इमेजिंग न्यूरॉन Microfluidic संस्कृति प्लेटफार्म में Glia सहभागिता (MCP) आधारित Neuronal Axon और Glia प्रणाली सह संस्कृति विश्लेषण

Neuroscience

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Summary

इस अध्ययन एक उपन्यास neuronal अक्षतंतु और glia (खगोल) के सह - संस्कृति मंच की स्थापना की प्रक्रिया का वर्णन करता है. इस प्रणाली में सह संस्कृति, एक एकल अक्षतंतु (और एक glial सेल) के बीच सीधी बातचीत के हेरफेर संभव हो जाता है, glial संकेत आपसी न्यूरॉन के यंत्रवत विश्लेषण की अनुमति देता है.

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Higashimori, H., Yang, Y. Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System. J. Vis. Exp. (68), e4448, doi:10.3791/4448 (2012).

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Abstract

Protocol

1. Microfluidic संस्कृति चैंबर के विधानसभा (MCP)

  1. MCP (1 चित्रा) खुला कक्षों 4 कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के compartmented संस्कृतियों के लिए तैयार हैं. यह आम तौर पर दो डिब्बों कि केंद्रीय चैनल (व्यास में 3 सुक्ष्ममापी) के माध्यम से जुड़े हुए हैं. MCP का गिलास तली व्यंजन के साथ विधानसभा संस्कृतियों और बाद इमेजिंग विश्लेषण तैयार करने के लिए आवश्यक है.
  2. सबसे पहले, कोट Polyornithine (सिग्मा Aldrich, 1 मिलीग्राम / एमएल) के साथ बाँझ गिलास तली व्यंजन सोडियम tetraborate (सिग्मा Aldrich, 10 मिमी 8.5 पीएच) में भंग किया गया और 37 डिग्री सेल्सियस में रातोंरात incubated
  3. अगले दिन, लेपित गिलास तली व्यंजन DDH 2 हे के साथ तीन बार धोया गया और बाँझ धूआं हुड के तहत सूखे. गिलास तली व्यंजन तो आगे laminin (सिग्मा Aldrich, 1 मिलीग्राम / एमएल) के साथ लेपित और 1 घंटे के लिए यूवी प्रकाश के तहत सूखे थे. लेपित व्यंजन का उपयोग करने के लिए तैयार हैं या -20 डिग्री सेल्सियस में उपयोग तक भंडारित किया जा सकता है. ये कोटिंग एकचढ़ाना सह संस्कृति में न्यूरॉन्स और astrocytes के लिए फिर से आवश्यक है.
  4. संस्कृति मंच को इकट्ठा करने के लिए, microfluidic संस्कृति प्लेटफार्मों लेपित गिलास तली व्यंजन के शीर्ष पर अपने नीचे की ओर पर केंद्रीय जोड़ने चैनलों के साथ रखा गया एक तंग सील फार्म. दोनों पक्षों (1 चित्रा) पर नियमित न्यूरॉन या astrocyte संस्कृति माध्यमों (सेल चढ़ाना क्षेत्रों से) जोड़ा गया था और इकट्ठे MCP में 37 डिग्री सेल्सियस में 2-4 घंटे के लिए incubated, यह सुनिश्चित करने के लिए वहाँ MCP और कांच के बीच कोई रिसाव तली पकवान. हम चढ़ाना कोशिकाओं से पहले मध्यम के साथ परीक्षण किया है सुनिश्चित करने के लिए कोई रिसाव नहीं है. पकवान कांच तली MCP का विधानसभा हौसले का उपयोग करने से पहले तैयार किया जाना चाहिए.

2. Neuronal और neuronal axons की संस्कृति प्रेरण इकट्ठे MCP में तैयारी

  1. Cortical neuronal सेल संस्कृतियों हौसले भ्रूण 14-16 दिन पुरानी माउस दिमाग से तैयार थे. न्यूरॉन संस्कृति के माध्यम neurobasal मध्यम, 2% B27 neurobasa से बना हैमैं पूरक, 100x GlutaMAX की 1%, और 1% पेनिसिलिन streptomysin जोड़कर 2 glutamine मिमी. माउस मस्तिष्क के विच्छेदन के बाद, meninges प्रांतस्था से विदारक माइक्रोस्कोप के तहत हटा दिया गया था. ऊतक तो छोटे ऊतक ब्लॉक बनाने के क्रम में सतह trypsin उजागर करने के लिए क्षेत्र में वृद्धि के लिए एक रेजर ब्लेड के साथ कीमा किया गया था. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 10 मिनट के लिए ऊतक ब्लॉक (सिग्मा Aldrich, 0.05% trypsin) trypsinized रहे थे, और फिर धीरे से एक आग पॉलिश पाश्चर विंदुक के साथ विचूर्णन से अलग. Dissociated कोशिकाओं एक 70 सुक्ष्ममापी झरनी के माध्यम से फ़िल्टर स्पष्ट neuronal सेल निलंबन इकट्ठा.
  2. न्यूरॉन्स (2-3 6 x 10 / एमएल, 150 μl) के दाईं ओर इकट्ठे MCP (1 चित्रा) पर सेल चढ़ाना क्षेत्रों पर चढ़ाया गया था इतना है कि न्यूरॉन्स सेल प्रतिधारण क्षेत्र (1 चित्रा) में संलग्न कर सकते हैं. हौसले से तैयार न्यूरॉन्स न्यूरॉन चढ़ाना माध्यम है जो नियमों में 5% से भ्रूण गोजातीय सीरम (Hyclone) के साथ पूरक है के साथ चढ़ाया गयाr न्यूरॉन संस्कृति के माध्यम. क्योंकि केवल न्यूरॉन्स कि सेल प्रतिधारण क्षेत्र में संलग्न केंद्रीय चैनलों के माध्यम से इकट्ठे MCP के दूसरे पक्ष में axons विकसित करने में सक्षम हैं, यह सेल चढ़ाना क्षेत्र में न्यूरॉन्स की थाली उच्च घनत्व सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त न्यूरॉन्स से जुड़े होते हैं प्रतिधारण क्षेत्र सेल. Neuronal axons की उच्च घनत्व के एक प्रतिनिधि छवि चित्रा 2A में दिखाया गया है.
  3. अगले दिन, न्यूरॉन चढ़ाना मध्यम नियमित न्यूरॉन संस्कृति के माध्यम से बदल दिया गया था. बदलने से मध्यम ध्यान चैम्बर की सेल चढ़ाना क्षेत्र से मध्यम aspirating द्वारा पूरा किया गया, लेकिन, क्रम में सेल प्रतिधारण क्षेत्र और केंद्रीय कनेक्टिंग चैनलों में हवाई बुलबुले से बचने के लिए इकट्ठे MCP सेल प्रतिधारण क्षेत्र से नहीं है. एयर बुलबुले गंभीर MCP में केंद्रीय चैनलों में अक्षतंतु परिणाम और बाद प्रविष्टि को बाधित करेगा. Glial सेल व्युत्पन्न neurotrophic कारक (GDNF, 10-20 एनजी / मिली) भी दूसरे पक्ष (बाएं) पर जोड़ा गयाउसी दिन पर चैम्बर neuronal और इकट्ठे MCP (2A चित्रा) के केंद्रीय चैनलों के माध्यम से पक्ष पार से अक्षतंतु 5 परिणाम की प्रेरण की सुविधा. GDNF बिना सहज neurite परिणाम की उचित राशि भी neuronal और इकट्ठे MCP की केंद्रीय चैनलों के माध्यम से पक्ष पार से मनाया जाता है. Axons कि केंद्रीय चैनल में प्रवेश अक्सर चढ़ाना बाद 2-3 दिनों में मनाया जाता है. एक बार axons केंद्रीय चैनल में दर्ज करते हैं, वे आम तौर पर एक दिन के भीतर दूसरी तरफ दर्ज करें. Axons आम तौर पर दूसरे पक्ष में प्रवेश करने के बाद कम से कम एक सप्ताह के लिए बरकरार हैं.

3. MCP के लिए संवर्धित Astrocytes के अलावा एक compartmentalized प्रणाली सह - संस्कृति की स्थापना

प्राथमिक astrocyte संस्कृतियों P1-3 माउस पिल्ला मस्तिष्क से तैयार किए गए थे. मस्तिष्क हदबंदी neuronal सेल अलगाव ऊपर वर्णित प्रक्रिया के लिए इसी तरह की प्रक्रिया है. Astrocytes 1 10 सेमी डिश है कि पूर्व में चढ़ाया गयाPolyornithine (सिग्मा Aldrich, 1 मिलीग्राम / एमएल) के साथ लेपित. astrocyte संस्कृति मध्यम (DMEM, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% पेनिसिलिन streptomysin) अगले दो दिनों के लिए हर दिन मलबे को हटाने के लिए बदल गया था. उसके बाद हर तीन दिन, मध्यम बदल गया था.

  1. Astrocytes 90% सहधारा हो गई और 7 दिनों के बाद एक monolayer फार्म. मिला हुआ astrocytes trypsinized किया गया और फिर से निलंबित astrocytes (1x10 6 मिलीग्राम /) के 150 μl थे इकट्ठे MCP के बाईं ओर के सेल चढ़ाना क्षेत्र में फिर से चढ़ाया जब axons दर्ज करने के बारे में कर रहे हैं या बस के बाईं ओर में प्रवेश MCP इकट्ठे हुए. Astrocytes आम तौर पर 4-5 दिनों चढ़ाया गया बाद न्यूरॉन्स मढ़वाया थे. GDNF 1 MCP के बाईं ओर में astrocytes के फिर चढ़ाना से पहले हटा दिया गया था. पुन चढ़ाया astrocytes सेल प्रतिधारण क्षेत्र में जुड़े थे, रूप में GFAP immunostaining (1 चित्रा) द्वारा दिखाया गया. कक्षों के दोनों पक्षों के बीच केवल माध्यम की न्यूनतम प्रवाह (प्रतिदीप्ति घ द्वारा निर्धारितहाँ) MCP में पाया गया था, के रूप में पहले 4,6 दिखाया.
  2. Astrocytes 90% सहधारा हो गई और 7 दिनों के बाद एक monolayer फार्म. मिला हुआ astrocytes trypsinized किया गया और फिर से निलंबित astrocytes (1 x 10 6 / मिली) के 150 μl थे इकट्ठे MCP के बाईं ओर के सेल चढ़ाना क्षेत्र में फिर से चढ़ाया जब axons के बारे में प्रवेश करने या सिर्फ बाएं में प्रवेश किया की ओर इकट्ठे MCP. Astrocytes आम तौर पर 4-5 दिनों चढ़ाया गया बाद न्यूरॉन्स मढ़वाया थे. GDNF 1 MCP के बाईं ओर में astrocytes के फिर चढ़ाना से पहले हटा दिया गया था. पुन चढ़ाया astrocytes सेल प्रतिधारण क्षेत्र में जुड़े थे, रूप में GFAP immunostaining (1 चित्रा) द्वारा दिखाया गया. कक्षों के दोनों पक्षों के बीच केवल माध्यम की न्यूनतम प्रवाह MCP (प्रतिदीप्ति रंगों द्वारा निर्धारित) में पाया गया था, के रूप में पहले 4,6 दिखाया.
  3. Astrocytes फिर चढ़ाना के बाद, axons कि इकट्ठे MCP के बाईं ओर में प्रवेश किया astr साथ सीधे बातचीतया तो प्रत्यक्ष axonal से संपर्क करें या घुलनशील कारकों की रिहाई ocytes. प्लाज्मा झिल्ली ग्लूटामेट astroglial ट्रांसपोर्टर GLT1 और neuronal βIII-ट्यूबिलिन immunostaining axons और astrocytes के बीच बातचीत की कल्पना करने के लिए प्रदर्शन किया गया था, के रूप में 2 डी एफ चित्र में दिखाया गया है.

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Representative Results

Astrocytes में अक्षतंतु प्रेरित GLT1 प्रमोटर सक्रियण के समय चूक इमेजिंग विश्लेषण

compartmented न्यूरॉन और astrocyte प्रणाली सह संस्कृति केवल neuronal प्रक्रियाओं, विशेष रूप से axons, चुनिंदा astrocytes के साथ बातचीत करने की अनुमति देता है. और इकट्ठे MCP में astrocyte (या अन्य glial कोशिकाओं) सह संस्कृति अक्षतंतु के सफल स्थापना के बाद, अक्षतंतु glia बातचीत के विभिन्न प्रकार के इस तरह के रूप में अध्ययन किया जा सकता है, astroglial जीन प्रमोटर सक्रियण, astrocyte प्रेरित अक्षतंतु मार्गदर्शन के अक्षतंतु प्रेरित सक्रियण अक्षतंतु प्रेरित astroglial 2 Ca + प्रतिक्रिया oligodendrocytes में और अक्षतंतु प्रेरित myelin संश्लेषण. इन आवेदनों में से सभी शक्तिशाली फ्लोरोसेंट पत्रकारों की उपलब्धता glial कोशिकाओं या इन कोशिकाओं को लोड करने के लिए रंगों के लिए उपलब्ध का लाभ ले लो.

यहाँ हम जीवाणु कृत्रिम chromo का उपयोग करके अक्षतंतु प्रेरित ग्लूटामेट 1 ट्रांसपोर्टर (GLT1) प्रमोटर astroglial के transcriptional सक्रियण का वर्णन(बीएसी) GLT1 EGFP ट्रांसजेनिक चूहों और इस compartmentalized प्रणाली सह संस्कृति. बीएसी GLT1 EGFP ट्रांसजेनिक चूहों में एक EGFP प्रतिदीप्ति संवाददाता GLT1 जीनोमिक 7 प्रमोटर के नियंत्रण के तहत overexpressed था. EGFP संवाददाता अभिव्यक्ति GLT1 अंतर्जात प्रमोटर सक्रियण प्रोटीन अभिव्यक्ति और कार्यात्मक गतिविधि 7 इस प्रकार GLT1 बगल में एकल astrocytes में प्रमोटर गतिविधि के एक आकलन की अनुमति के साथ संबद्ध है. Astroglial GLT1 अभिव्यक्ति अत्यधिक neuronal 6,8 उत्तेजना पर निर्भर है. प्राथमिक astrocytes GLT1 के न्यूनतम स्तर व्यक्त, तथापि, GLT1 अभिव्यक्ति के स्तर (दोनों mRNA और प्रोटीन) astrocytes कि सह 9 न्यूरॉन्स के साथ सुसंस्कृत में दृढ़ता से प्रेरित कर रहे हैं. सबूत यहाँ काफी वृद्धि हुई compartmentalized सह संस्कृति प्रणाली में GLT1 immunoreactivity (3 चित्रा) के द्वारा दिखाया गया है. पारंपरिक न्यूरॉन और astrocyte सह संस्कृतियों, न्यूरॉन्स की उच्च घनत्व कम आदर्श बनाने के लिए निरीक्षण करने के लिएneuronal axons की GLT1 प्रमोटर के transcriptional सक्रियण पर प्रभाव.

मॉनीटर करने अक्षतंतु निर्भर GLT1 प्रमोटर सक्रियण, जंगली प्रकार न्यूरॉन्स इकट्ठे MCP और axons की सही पक्ष में सुसंस्कृत थे इकट्ठे MCP के बाईं ओर पर GDNF के आवेदन के बाद प्रेरित किया गया. बीएसी GLT1 EGFP चूहों से प्राप्त astrocytes इकट्ठे MCP के बाईं ओर में सुसंस्कृत थे बाद axons प्रेरित किया गया है और इकट्ठे MCP के बाईं ओर में बस में प्रवेश. 6 दिनों की कुल (24 घंटे के लिए 140 घंटे) समय चूक छवियों EGFP वास्तविक समय में प्रतिदीप्ति तीव्रता परिवर्तन और MCP में अक्षतंतु विकास पर नजर रखने के लिए एकत्र किए गए. 4A चित्रा में दिखाया गया है, बहुत astrocytes में न्यूनतम EGFP प्रतिदीप्ति अभिव्यक्ति astrocytes के चढ़ाना के बाद 24 घंटे में मनाया गया. EGFP तीव्रता की उल्लेखनीय वृद्धि सह संस्कृति के बाद 48 घंटा मनाया गया (24 घंटे से 68 घंटे के लिए) जब axons astrocyte पक्ष और बातचीत में अच्छी तरह से कर रहे हैंटी astrocytes (4 चित्रा ई.पू.) के साथ सीधे संपर्क करें. दूसरी ओर, EGFP प्रतिदीप्ति तीव्रता धीरे - धीरे एक बार axons मुकर गया (200 सुक्ष्ममापी) इकट्ठे MCP (चित्रा 4D एफ) के neuronal (दाएं) तरफ प्रेरित neuronal सेल, मृत्यु kainite द्वारा degenerated कम था. axons के लिए प्रतिक्रिया में EGFP प्रतिदीप्ति तीव्रता के गतिशील परिवर्तन स्पष्ट रूप से दिखा दिया है कि astroglial GLT1 प्रमोटर गतिविधि अक्षतंतु बातचीत के द्वारा modulated है.

चित्रा 1
चित्रा 1. के योजनाबद्ध आरेख microfluidic न्यूरॉन और astrocyte सह संस्कृति मंच Microfluidic संस्कृति मंच (MCP) के दो डिब्बों है कि केंद्रीय चैनलों के माध्यम से जुड़े हुए हैं. कोशिकाओं सेल चढ़ाना क्षेत्र से प्रत्येक पक्ष पर चढ़ाया जा सकता है और neuronal axons सेल प्रतिधारण क्षेत्र और पास से ईएनटी केंद्रीय चैनलों के माध्यम से प्रेरित कर रहे हैंएर दूसरे पक्ष (पैमाने बार 50 सुक्ष्ममापी) डालने.

चित्रा 2
चित्रा 2. (ए) neuronal axons और MCP MCP में astrocyte के साथ axons की बातचीत की प्रेरण इकट्ठे MCP की सेल प्रतिधारण क्षेत्र में न्यूरॉन्स की उच्च घनत्व., ΒIII ट्यूबिलिन immunostaining द्वारा पता चला. स्केल बार: 50 (बी) सुक्ष्ममापी केंद्रीय चैनलों और MCP के दूसरे पक्ष में प्रवेश करने को पार axons की दृष्टि Magnified. स्केल पट्टी: 100 सुक्ष्ममापी (सी) Axon विकास धुंधला हो bIII-ट्यूबिलिन से पता चला जब axons MCP के दूसरे पक्ष में दर्ज शंकु. स्केल पट्टी: 100 (डी) सुक्ष्ममापी Axon बंडलों कि केंद्रीय चैनल के माध्यम से विकास और MCP के दूसरे पक्ष में प्रवेश. (ई) Astrocytes MCP का glial पक्ष में GLT1 immunostaining द्वारा पता चला. (एफ) विलय छवि axons और GLT1 सकारात्मक astrocytes के बीच संपर्क को प्रदर्शित करता है. स्केल पट्टी: 50 सुक्ष्ममापी.


चित्रा 3. प्रेरण न्यूरॉन प्राथमिक astrocytes GLT1 अभिव्यक्ति पर निर्भर GLT1 में immunoreactivity (ए) प्राथमिक astrocyte संस्कृतियों, स्केल बार: 50 सुक्ष्ममापी (बी) प्राथमिक neuronal संस्कृतियों, और (सी) प्राथमिक न्यूरॉन और astrocyte सह संस्कृतियों. स्केल पट्टी: न्यूरॉन्स βIII ट्यूबिलिन की immunostaining द्वारा दिखाए जाते हैं. Immunoreactivity GLT1 की उल्लेखनीय वृद्धि न्यूरॉन और सह संस्कृतियों astrocyte में मनाया गया.

चित्रा 4
चित्रा 4. अक्षतंतु प्रेरित GLT1 MCP में बीएसी GLT1 EGFP astrocytes और जंगली प्रकार न्यूरॉन्स के साथ प्रमोटर सक्रियण के समय चूक छवियों EGFP तीव्रता और axons की वृद्धि के गतिशील परिवर्तन एक 6D रिकॉर्डिंग समय व्यतीत हो जाने के माध्यम से astrocyte चढ़ाना के बाद एकत्र किए गए. (ए) (बी) 24 घंटों 48h (सी) 68h (डी) 92h (ई) 112h 140h (एफ). एक का प्रवेशastrocyte पक्ष में xons (पीले तीर द्वारा प्रकाश डाला) 48h से 92h जो वृद्धि हुई EGFP प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ सहसंबंधी करने के लिए मनाया गया. EGFP प्रतिदीप्ति kainite (200 सुक्ष्ममापी) 92h में neuronal तरफ neuronal सेल, मृत्यु और अक्षतंतु अध: पतन के लिए प्रेरित करने के लिए लागू किया गया था के बाद 112h से 140h हुई तीव्रता की कमी. स्केल पट्टी: 50 सुक्ष्ममापी.

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Discussion

MCP आधारित न्यूरॉन और astrocytes सह संस्कृति प्रणाली केवल axons केंद्रीय चैनल के पास अनुमति और astroglial कोशिकाओं के साथ बातचीत के द्वारा अस्थिकणिका संकेत दे रास्ते विस्तृत न्यूरॉन के विच्छेदन की अनुमति देता है. यह सह संस्कृति प्रणाली आसानी से पारंपरिक न्यूरॉन और astrocyte संस्कृति प्रक्रियाओं के साथ स्थापित किया जा सकता है. हम भी अक्षतंतु पर निर्भर GLT1 प्रमोटर सक्रियण astrocytes में प्रदर्शन के लिए एक EGFP आधारित रिपोर्टर को रोजगार से इस प्रणाली सह संस्कृति का एक व्यावहारिक आवेदन में वर्णित है.

इस MCP न्यूरॉन आधारित और अस्थिकणिका प्रणाली सह संस्कृति सह संस्कृति पारंपरिक तरीकों की तुलना में कई फायदे हैं: 1) के लिए कल्पना और एकल axons और वास्तविक समय में उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी 2 के तहत astrocytes के बीच स्पष्ट morphological संपर्क की पहचान करने की क्षमता) एक अच्छी तरह से नियंत्रित करने के लिए स्वतंत्र सेल विशिष्ट प्रभाव 3 के लिए औषधीय हेरफेर लागू microenvironment प्रमोटर सक्रियण के विश्लेषण)और प्रोटीन अभिव्यक्ति विशेष रूप से प्रेरित / astrocytes कि axons संपर्क द्वारा modulated विनियमित. के रूप में प्राथमिक microglia 10 और 11 oligodendrocytes के लिए संस्कृति की प्रक्रिया को अच्छी तरह से स्थापित किया गया है, इस MCP प्रणाली सह संस्कृति भी microglia और न्यूरॉन जा सकता सह संस्कृतियों oligodendrocyte न्यूरॉन पर लागू होता है. इस बीच, हम यह भी समझते हैं कि इस प्रणाली सह संस्कृति संवेदनशील छवि विश्लेषण के लिए एकल कोशिका के स्तर है, जो शाही सेना या प्रोटीन विश्लेषण के रूप में कोशिकाओं की बड़ी मात्रा का विश्लेषण करने के पारंपरिक तरीकों को पूरक है इरादा है. इसके अलावा, हमारे सिस्टम एकल कक्ष और अक्षतंतु के बीच बातचीत के द्वारा exemplifying और न्यूरॉन्स vivo में glial कोशिकाओं के बीच भारी बातचीत सरल. इन सब के सब जब इस प्रणाली सह संस्कृति से परिणामों की व्याख्या करने पर विचार किया जाना चाहिए. सीएनएस में axons और विभिन्न glial कोशिकाओं के बीच बातचीत का व्यापक रूप से मौजूद हैं और दोनों न्यूरॉन के लिए महत्वपूर्ण हैं औरglial कार्यों 12,13. इस प्रणाली सह संस्कृति का विकास इमेजिंग आधारित इन मुलाकातों के विच्छेदन की अनुमति देगा.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम बीएसी GLT1 EGFP चूहों और GLT1 एंटीबॉडी प्रदान करने के लिए डॉ. Jeffrey रोथस्टीन धन्यवाद देना चाहूंगा, तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान के लिए Tufts केंद्र (P30 NIH NS047243, PI, रोब जैक्सन) मूल्यवान कोर की सुविधा प्रदान करने के लिए नए शिक्षकों की भर्ती के अनुदान (P30 5P30NS069254-02 NIH , PI, फिल Haydon Tufts तंत्रिका विज्ञान विभाग में).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal bovine serum Hyclone SH30070.03 for plating neuron for neuron cutlure medium
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F4135 for astrocyte culture medium
Glial derived nerve factor R&D Systems 212-GD Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber
Dulbecco modified eagle medium high glucose Sigma-Aldrich 11995
70 mm cell strainer BD Falcon 352350
Sterile glass bottom dish MatTek Corporation
Microfluidic culture platforms Xona Microfluidics LLC SND150
6 wells of the culture plate Cellstar 657 160

Neuron culture medium

  • Neurobasal medium
  • 2% B27 Neurobasal supplement
  • 2 mM glutamate by adding 1% 100x GlutaMAX
  • 1% Penicillin-streptomysin

Neuron culture medium for plating cell

  • Neurobasal medium
  • 2% B27 Neurobasal supplement
  • 2 mM glutamate by adding 1% 100x GlutaMAX
  • 1% Penicillin-streptomysin
  • 5% Fetal bovine serum SH30070.03

Astrocyte culture medium

  • Dulbecco modified eagle medium high glucose
  • 10% Fetal bovine serum F4135
  • 1% Penicillin-streptomysin

Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system.

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References

  1. Stevens, B. Neuron-astrocyte signaling in the development and plasticity of neural circuits. Neuro-Signals. 16, 278-288 (2008).
  2. Paixao, S., Klein, R. Neuron-astrocyte communication and synaptic plasticity. Current opinion in neurobiology. 20, 466-473 (2010).
  3. Fields, R. D., Stevens-Graham, B. New insights into neuron-glia communication. Science. 298, 556-562 (2002).
  4. Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature. 1, 2128-2136 (2006).
  5. Wang, C. Y. Regulation of neuromuscular synapse development by glial cell line-derived neurotrophic factor and neurturin. The Journal of biological chemistry. 277, 10614-10625 (2002).
  6. Yang, Y. Presynaptic regulation of astroglial excitatory neurotransmitter transporter GLT1. Neuron. 61, 880-894 (2009).
  7. Regan, M. R. Variations in promoter activity reveal a differential expression and physiology of glutamate transporters by glia in the developing and mature CNS. The Journal of neuroscience. 27, 6607-6619 (2007).
  8. Swanson, R. A. Neuronal regulation of glutamate transporter subtype expression in astrocytes. The Journal of neuroscience. 17, 932-940 (1997).
  9. Schlag, B. D. Regulation of the glial Na+-dependent glutamate transporters by cyclic AMP analogs and neurons. Molecular pharmacology. 53, 355-369 (1998).
  10. Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state. Journal of immunological. 300, 32-46 (2005).
  11. Espinosa-Jeffrey, A., Wakeman, D. R., Kim, S. U., Snyder, E. Y., de Vellis, J. Culture system for rodent and human oligodendrocyte specification, lineage progression, and maturation. Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, (2009).
  12. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, 430-440 (2008).
  13. Debanne, D., Rama, S. Astrocytes shape axonal signaling. Science signaling. 4, pe11 (2011).

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