الأشكال الركض الجذعية الجنينية البشرية خلية خطوط مع التربسين

Published 10/12/2006
4 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

في هذا الفيديو كيف نظهر مختبرنا الممرات بشكل روتيني الأشكال البشرية خطوط الخلايا الجذعية الجنينية مع التربسين.

Cite this Article

Copy Citation

Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.. J. Vis. Exp. (1), e49, doi:10.3791/49 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

في هذا الفيديو كيف نظهر مختبرنا الممرات بشكل روتيني الأشكال البشرية خطوط الخلايا الجذعية الجنينية مع التربسين. الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والفنية للثقافة الخلية ، وتميل الى اكتساب شذوذ karyotypic الأضعاف مع الكثافة السكانية العالية. الركض السليم أمر ضروري للحفاظ على ، غير متمايزة صحية ، والأشكال الطبيعية karyotypically الخلايا الجذعية الجنينية البشرية الثقافة. أولا ، يتم غسلها ثقافة التوسع في برنامج تلفزيوني وسائل الإعلام لإزالة بقايا وحطام الخلايا ، ثم يتم مضافين الخلايا مع الحد الأدنى من حجم 0.05 ٪ دافئة التربسين - EDTA. ترك التربسين على الخلايا لمدة تصل إلى خمس دقائق ، ثم يتم فكها بلطف مع خلايا ماصة a 2mL المصلية. يتم جمع نظام التعليق الخلية ومختلطة مع كمية كبيرة من الاشكال وسائل الإعلام ، ثم يتم جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي لطيف. تتم إزالة المعطل خليط سائل الإعلام التربسين ، وخلايا معلق في وسائل الاعلام الأشكال السابقة للحرارة. ويتم احتساب نسبة تقسيم المناسب (1:10 عموما 1:20) ، وخلايا إعادة مطلي على طبق من العمر 1-2 اليوم تحتوي على أحادي الطبقة من الماوس الجنينية الخلايا المغذية المشع الليفية. تبقى الثقافة الأشكال المصنفة حديثا لوحة دون عائق لمدة 48 ساعة ، ثم يتم تغيير وسائل الاعلام كل يوم بعد ذلك. فمن المهم عدم trpsinize الى تعليق خلية واحدة ، لأن ذلك يزيد من مخاطر إدخال karyotypic شذوذ.

Protocol

عام

نوصي ذوبان لا يزيد عن عينة واحدة في وقت معين لضمان سهولة التعامل. ينبغي للمعالج الحرص على عدم ترك الثقافات في درجة حرارة الغرفة وCO2 منخفضة لفترات طويلة من الزمن. ويتم ذلك عن الطرد المركزي من الخلايا الحية على 500-600 XG لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

MEFs (خلايا الفأر الجنينية الطاعم)

  1. قبل وسائل الاعلام الحارة MEF إلى 37 درجة مئوية. إزالة MEF قنينة من -80 درجة مئوية ، وعلى الفور يغرق في النصف السفلي من الأنبوب في حمام مائي 37 ° C. وينبغي أن يستغرق حوالي 30-45 ثانية قبل الخلايا هي 80 ٪ إذابة (جزء صغير مجمدة اليسار).
  2. جلب بسرعة الأنبوب إلى تدفق الصفحي هود ، الرذاذ أسفل مع الكحول 70 ٪ ، ونقل الخلايا إلى ما قبل تحسنت وسائل الإعلام.
  3. نضح الحل الجيلاتين من لوحات أعدت في وقت سابق.
  4. قسامة 2 مل من محلول MEF في انخفاض الطريقة الحكيمة في كل من الآبار الست. لا شك أن توزع بالتساوي MEFs حول البئر. تاريخ لوحة MEF ، ووضع في الحاضنة 37 درجة مئوية خلال الليل للسماح لMEFs نعلق على طبق من ذهب.
  5. وبعد 6 ساعات ترفق MEFs إلى اللوحة. فمن الأفضل لاستخدام لوحات MEF 24-48 بعد ساعات من الطلاء. لا تستخدم لوحة MEF أن أكثر من 4 أيام من العمر.
  6. قبل وسائل الإعلام والأشكال الدافئة 0.05 ٪ التربسين / EDTA إلى 37 درجة مئوية تحت غطاء السيارة ، prelabel one العقيمة أنبوب 50 مل المخروطية.
  7. نضح بعناية ليكون تقسيم وسائل الاعلام الأشكال من الثقافة. يغسل بلطف مع آبار 2mL حل الفوسفات مخزنة 1X (PBS) لكل بئر. نضح في برنامج تلفزيوني. إضافة 0.75 مل 0.05 ٪ التربسين / EDTA إلى البئر.
  8. استبدال الغطاء ، ومراقبة الخلايا تحت التكبير 4X. يجب على المستعمرات المحيطة MEFs الأشكال تبدأ في التراجع. عندما يتم تقريب MEFs بما فيه الكفاية وحدود المستعمرات هي الأشكال الخام ، وعودة إلى لوحة غطاء محرك السيارة. وينبغي أن تستغرق هذه العملية حوالي 5 دقائق ، قطعا لا أطول من 10 دقيقة أو خلايا الخاص بك لن تنمو من جديد.
  9. ماصة بلطف صعودا ونزولا ، وغسل قاع البئر ، حتى المونولاير MEF ومنفصلة تماما (أحادي الطبقة هي لزجة ، وربما يبقى في قطعة واحدة).
  10. تعليق نقل الخلية إلى أنبوب an المخروطية التي تحتوي على 50 مل إضافية الأشكال وسائل الإعلام. تدور في أنبوب من الخلايا لمدة 5 دقائق 500xg ، نضح إيقاف وسائل الإعلام ، يجب الحرص على عدم تعكير صفو بيليه الخلية.
  11. لوحة على لوحة جديدة من MEFs ، إضافة تحديد حجم مناسب من الخلايا إلى وسائل الإعلام الأشكال إضافية ، وماصة الحل 5-7 مرات مع ماصة الآلي.
  12. إزالة وسائل الإعلام MEF من لوحة جديدة من MEFs.
  13. قسامة انخفاض حل الاشكال من الحكمة أن كل بئر ، والتأكد من أن توزع بالتساوي قطرات حول البئر. دون أن تهتز لوحة ، وعودة بعناية الخلايا إلى الحاضنة 37 درجة مئوية خلال الليل للسماح الأشكال المستعمرات البذور.
  14. وينبغي أن الأشكال الخلايا التي تخرج من انقسام تتصرف على نحو مماثل لتلك التي تخرج من ذوبان الجليد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا الفيديو كيف أننا أثبتنا الأشكال مرور روتينية الإنسان خطوط الخلايا الجذعية الجنينية في المختبر لدينا. تقسيم فعالة ومنتظمة والركض أمر ضروري للحفاظ على صحة الإنسان الخلايا الجذعية الجنينية الخط. التربسين مرور توسط هو ميزة كبيرة من خطوط الخلايا الأشكال ، ومع ذلك ، فمن المهم أن لا يعرض للتريبسين عبر الثقافات أو الحصول على نسبة كبيرة من الخلايا واحدة خلال إعادة platting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HuES media 651.5 ml
KO-DMEM 500 ml
PenStrep 6.5 ml
GlutaMAXTM 6.5 ml
NEAA 6.5 ml
2-mercapt–thanol 0.5ul
KO Serum Replacement 65 ml
Plasmanate 65 ml
bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis. Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).
  2. Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).
  3. Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip. PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).
  4. Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
  5. Pierce, C. G. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).
  6. Lee, M. Y. Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).
  7. Meyerhofer, D. Characteristics of resist films produced by spinning. Journal of Applied Physics. 49, (1978).
  8. Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
  9. Chandra, J. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
  10. Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).
  11. Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases. Mycoses. 53, 208-214 (2010).

Comments

4 Comments

  1. That's very nice clip and  I have some question. Normally, HuES cells are very hard to form colony from single cell state. By treating with trypsin, I think, HuES colony will be dissociated into single cell state or very small colony state. How could you solve this problem? Which HuES cell line your lab are using? Looking forward to your response! Tran Ngoc Tung  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 6, 2009 - 7:15 AM
  2. For Tran Njoc Tung, You are totally correct that HuES, in single cell state, form colonies with great difficulty. The trick to avoid making a single cell suspension is to minimize the time for which you trypsinze. As you put trypsin, observe the cells under the microscope and just when there are small aggregates of HuESC's remaninig add the media. This would not allow the formation f single cell suspension. It totally works for me. Hope it dŒs for you.   Sumit Rai

    Reply
    Posted by: Sumit R.
    April 7, 2009 - 4:06 AM
  3. Dear Sir/Madame Unfortunately I can"t see the movie. How can I overcome this problem? Thank you and regards Vitali Shilo vitali.shilo@gmail.com

    Reply
    Posted by: vitali s.
    January 22, 2009 - 8:05 AM
  4. Hello Vitali, Please try the steps on this page: http://www.jove.com/index/page.stp?name=FlashProblems and let me know if you have any trouble. Cheers, Nikita

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 22, 2009 - 9:33 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats