Пассирования оттенков эмбриональных стволовых клеток человека линий с Трипсин

Published 10/12/2006
4 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

В этом видео показано, как в нашей лаборатории регулярно проходы оттенки человеческих линий эмбриональных стволовых клеток трипсином.

Cite this Article

Copy Citation

Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.. J. Vis. Exp. (1), e49, doi:10.3791/49 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

В этом видео показано, как в нашей лаборатории регулярно проходы оттенки человеческих линий эмбриональных стволовых клеток трипсином. Человека эмбриональные стволовые клетки являются артефактами культуры клеток, и, как правило, приобретают кариотипические аномалии с высокой удвоений популяции. Правильное пассажей имеет важное значение для поддержания здорового, недифференцированной, karyotypically нормальные оттенки человеческих стволовых эмбриональных клеточных культур. Во-первых, расширение культуры промывают в PBS для удаления остатков средств массовой информации и сотовых мусора, то клетки с наложением минимальный объем теплого 0,05% трипсина-EDTA. Трипсин остается на клетки на срок до пяти минут, после чего клетки аккуратно выбили с 2 мл серологические пипетки. Клеточной суспензии, собирается и смешивается с большим количеством оттенков средств массовой информации, то клетки собирают нежные центрифугирования. Инактивированной трипсина СМИ смесь снять, и клетки ресуспендировали в подогретого оттенков СМИ. Соответствующем соотношении разделить рассчитывается (в основном от 1:10 до 1:20), и клетки снова высевали на 1-2 день старые пластины, содержащей монослоя облученного мышиных эмбриональных фибробластов фидерные клетки. Вновь посеянных оттенков культуры пластина не трогать в течение 48 часов, то средства массовой информации меняется каждый день после этого. Важно, чтобы не trpsinize до суспензии отдельных клеток, так как это увеличивает риск появления аномалий кариотипа.

Protocol

Общий

Мы рекомендуем оттаивания не более одного образца в данный момент времени, чтобы обеспечить удобство в обращении. Обработчик должен заботиться, чтобы не оставить культур при комнатной температуре и низкой CO2 в течение длительных периодов времени. Все центрифугирования живых клеток происходит при температуре 500-600 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.

MEFs (мышь эмбриональных клеток для подачи)

  1. Предварительно теплой MEF средствах массовой информации до 37 ° C. Удалить MEF флакон от -80 ° C и сразу же погрузить нижнюю часть трубки в 37 ° С водяной бане. Это должно занять около 30-45 секунд, прежде чем клетки 80% талой (малая часть замороженных слева).
  2. Быстро довести трубку ламинарном боксе, спрей вниз с 70% спиртом, и передачи клеткам подогретого СМИ.
  3. Аспирируйте раствора желатина из плит подготовлено раньше.
  4. Алиготе 2 мл раствора в MEF падение мудрым образом в каждый из шести скважин. Будьте уверены, чтобы распределять равномерно MEFs о хорошо. Дата пластины MEF, и места в 37 ° С инкубатор ночь, чтобы позволить MEFs приложить к пластине.
  5. После 6 часов MEFs будет прикреплен к пластине. Лучше всего использовать MEF пластин через 24-48 часов после покрытия. НЕ используйте MEF пластина, которая в течение 4 дней.
  6. Предварительно теплых оттенков средств массовой информации и 0,05% трипсин / ЭДТА до 37 ° C Под капотом prelabel один стерильные 50 мл коническую трубку.
  7. Тщательно аспирата оттенков средств массовой информации из культура должны быть разделены. Осторожно промыть скважин с 2 мл 1X фосфатным буферным раствором (PBS) в каждую лунку. Аспирируйте PBS. Добавить 0,75 мл 0,05% трипсин / ЭДТА к колодцу.
  8. Замените крышку, и наблюдать клетки под 4-кратным увеличением. MEFs окружающих оттенков колонии должны начать отказаться. Когда MEFs достаточно округлые и границ оттенков колонии грубая, возвращение пластины к капоту. Этот процесс должен занять около 5 минут, абсолютно не дольше 10 минут, или ваши клетки не будут заново расти.
  9. Аккуратно пипетку вверх и вниз, стиральная дно колодца, пока монослой MEF полностью съемный (монослой является липким и могут оставаться в одной части).
  10. Передача клеточной суспензии в 50 мл коническую трубку с дополнительным медиа оттенков. Спиновые трубки клеток 500xg в течение 5 минут, аспирацию от средств массовой информации, будьте осторожны, чтобы не потревожить осадок клеток.
  11. Для пластины на новые пластины MEFs, добавить надлежащим определенного объема клетки дополнительных средств массовой информации оттенков, и пипетки раствор 5-7 раз с автоматизированной пипетки.
  12. Удалить MEF средств массовой информации из свежих пластины MEFs.
  13. Алиготе падение оттенков решение мудрым в каждую лунку, убедившись, что для распространения капель равномерно о хорошо. Без тряски плиты, осторожно вернуть клеткам 37 ° С инкубатор ночь, чтобы оттенки колонии семени.
  14. Оттенки клетки выходят из разделить должны вести себя так же, тех, кто прибывает из оттепель.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом видео мы продемонстрировали, как мы обычно оттенки человеческих прохождения линии эмбриональных стволовых клеток в нашей лаборатории. Эффективное и регулярное расщепление и пассажи очень важны для поддержания здоровых человеческих эмбриональных стволовых клеток. Трипсин опосредованный переход является существенным преимуществом линий оттенков клетки, однако, важно не переусердствовать trypsinize культур или иметь большую долю отдельных клеток во время повторного Платтинг.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HuES media 651.5 ml
KO-DMEM 500 ml
PenStrep 6.5 ml
GlutaMAXTM 6.5 ml
NEAA 6.5 ml
2-mercapt–thanol 0.5ul
KO Serum Replacement 65 ml
Plasmanate 65 ml
bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis. Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).
  2. Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).
  3. Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip. PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).
  4. Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
  5. Pierce, C. G. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).
  6. Lee, M. Y. Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).
  7. Meyerhofer, D. Characteristics of resist films produced by spinning. Journal of Applied Physics. 49, (1978).
  8. Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
  9. Chandra, J. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
  10. Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).
  11. Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases. Mycoses. 53, 208-214 (2010).

Comments

4 Comments

  1. That's very nice clip and  I have some question. Normally, HuES cells are very hard to form colony from single cell state. By treating with trypsin, I think, HuES colony will be dissociated into single cell state or very small colony state. How could you solve this problem? Which HuES cell line your lab are using? Looking forward to your response! Tran Ngoc Tung  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 6, 2009 - 7:15 AM
  2. For Tran Njoc Tung, You are totally correct that HuES, in single cell state, form colonies with great difficulty. The trick to avoid making a single cell suspension is to minimize the time for which you trypsinze. As you put trypsin, observe the cells under the microscope and just when there are small aggregates of HuESC's remaninig add the media. This would not allow the formation f single cell suspension. It totally works for me. Hope it dŒs for you.   Sumit Rai

    Reply
    Posted by: Sumit R.
    April 7, 2009 - 4:06 AM
  3. Dear Sir/Madame Unfortunately I can"t see the movie. How can I overcome this problem? Thank you and regards Vitali Shilo vitali.shilo@gmail.com

    Reply
    Posted by: vitali s.
    January 22, 2009 - 8:05 AM
  4. Hello Vitali, Please try the steps on this page: http://www.jove.com/index/page.stp?name=FlashProblems and let me know if you have any trouble. Cheers, Nikita

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 22, 2009 - 9:33 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats