גוונים Passaging האדם עובריים לתאי גזע קווי עם טריפסין

Published 10/12/2006
4 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

בסרטון הזה אנחנו מדגימים איך במעבדה שלנו שגרתי קטעים בגוונים האדם עובריים קווי גזע עם טריפסין.

Cite this Article

Copy Citation

Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.. J. Vis. Exp. (1), e49, doi:10.3791/49 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

בסרטון הזה אנחנו מדגימים איך במעבדה שלנו שגרתי קטעים בגוונים האדם עובריים קווי גזע עם טריפסין. בתאי גזע עובריים אנושיים הם חפצים של תרבית תאים, והם נוטים לרכוש ליקויים karyotypic עם הכפלות אוכלוסין גבוהה. Passaging נכונה חיונית לשמירה על בריא, מובחן, גוונים נורמלי karyotypically האדם גזע עובריים תרבות. ראשית, תרבות הרחבת נשטף ב PBS להסיר התקשורת שיורית ופסולת תאים, אז התאים מעולף עם נפח מינימלי של% 0.05 חם טריפסין-EDTA. טריפסין נשאר על התאים לתקופה של עד חמש דקות, ואז התאים וחילצה בעדינות עם טפטפת סרולוגיות 2ml. השעיית התא נאספים ומעורבבים עם כמויות גדולות של אמצעי התקשורת גוונים, אז התאים נאספים על ידי צנטריפוגה עדין. התערובת מומת טריפסין המדיה מוסר, ותאי resuspended מראש חימם התקשורת גוונים. יחס ראוי לפצל מחושב (בדרך כלל 1:10-01:20), ותאי מחדש מצופה לצלחת הישן 1-2 יום המכיל monolayer של מוקרן עובריים בעכבר תאים פיברובלסטים מזין. הגוונים החדשים seeded צלחת תרבות נותר ללא הפרעה במשך 48 שעות, אז התקשורת משתנה כל יום לאחר מכן. חשוב לא trpsinize עד ההשעיה תא בודד, כמו זה מגביר את הסיכון של החדרת ליקויים karyotypic.

Protocol

כללי

אנו ממליצים הפשרה לא יותר מדגם אחד בזמן נתון, כדי להבטיח טיפול קל. המטפל צריך לדאוג שלא להשאיר תרבויות בטמפרטורת החדר CO2 נמוכה במשך תקופות זמן ארוכות. כל צנטריפוגה של תאים חיים נעשית XG 500-600 5 דקות בטמפרטורת החדר.

MEFs (תאים עובריים בעכבר מזין)

  1. טרום חם MEF מדיה 37 ° C. הסר בקבוקון MEF מ -80 ° C ומיד להטביע את החצי התחתון של הצינורית אמבטיה 37 מעלות צלזיוס המים. זה אמור לקחת בערך 30-45 שניות לפני התאים הם 80% מופשר (חלק קפוא קטן משמאל).
  2. מהר להביא את הצינור אל מכסה המנוע לזרום למינרית, ספריי עם אלכוהול 70%, ולהעביר תאים טרום חימם התקשורת.
  3. לשאוב את הפתרון ג'לטין מן צלחות מוכן קודם לכן.
  4. 2 Aliquot מ"ל של תמיסת MEF לירידה בצורה חכמה לתוך כל אחד מששת הבארות. הקפידו להפיץ את MEFs באופן שווה על הבאר. תאריך את הצלחת MEF, ומניחים 37 ° C חממה לילה כדי לאפשר MEFs לצרף צלחת.
  5. לאחר 6 שעות MEFs יצורף הצלחת. מומלץ להשתמש בצלחות MEF 24-48 שעות לאחר ציפוי. אין להשתמש צלחת MEF כי הוא מעל 4 ימים.
  6. טרום גוונים חמים מדיה 0.05% טריפסין / EDTA עד 37 מעלות צלזיוס מתחת למכסה המנוע, prelabel שפופרת אחת סטרילי 50 מ"ל חרוטי.
  7. בזהירות לשאוב את הגוונים התקשורת מתרבות להיות מפוצל. לשטוף בעדינות את הבארות עם 2ml של פתרון 1X שנאגרו פוספט (PBS) בכל טוב. לשאוב PBS. הוספת 0.75 ml 0.05% טריפסין / EDTA אל הבאר.
  8. החלף את המכסה, ולבחון את התאים בהגדלה 4x. MEFs סביב מושבות גוונים צריך להתחיל לחזור בו. כאשר MEFs מעוגלות מספיק גבולות המושבות הגוונים הם מחוספסים, להחזיר את הצלחת עד למכסה המנוע. תהליך זה אמור לקחת בערך 5 דקות, בהחלט לא יותר מ 10 דקות או התאים שלך לא לגדול מחדש.
  9. פיפטה בעדינות מעלה ומטה, כביסה לתחתית הבאר, עד monolayer MEF יש מנותקת לחלוטין (monolayer דביק ועלול להישאר בחתיכה אחת).
  10. מעבירים את ההשעיה לתא צינור חרוטי המכיל 50 מ"ל נוסף התקשורת גוונים. ספין הצינור של תאים 500xg במשך 5 דקות, לשאוב את התקשורת, להיזהר לא להפריע תא גלולה.
  11. כדי צלחת לצלחת חדשה של MEFs, להוסיף נפח נחוש הולם של תאים התקשורת גוונים נוספים, פיפטה הפתרון 5-7 פעמים עם פיפטה אוטומטית.
  12. הסר את המדיה MEF מהצלחת טרייה של MEFs.
  13. Aliquot הגוונים טיפה פתרון חכם היטב לכל, מוודא להפיץ את טיפות באופן שווה על הבאר. בלי ללחוץ את הצלחת בזהירות להחזיר את התאים 37 ° C במשך הלילה באינקובטור לתת גוונים זרע מושבות.
  14. גוונים תאים יוצא לפצל צריכים להתנהג באופן דומה לאלה יוצא של הפשרה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בסרטון הזה הראינו איך אנחנו שגרתי גוונים מעבר אדם בתאי גזע עובריים קווי במעבדה שלנו. פיצול יעיל רגיל passaging חיונית לשמירה על תאים עובריים של אדם בריא קו גזע. מעבר טריפסין בתיווך היא יתרון משמעותי של קווים בגוונים התא, עם זאת, חשוב שלא לאורך trypsinize תרבויות או יש אחוז גדול של תאים בודדים במהלך platting מחדש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HuES media 651.5 ml
KO-DMEM 500 ml
PenStrep 6.5 ml
GlutaMAXTM 6.5 ml
NEAA 6.5 ml
2-mercapt–thanol 0.5ul
KO Serum Replacement 65 ml
Plasmanate 65 ml
bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis. Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).
  2. Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).
  3. Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip. PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).
  4. Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
  5. Pierce, C. G. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).
  6. Lee, M. Y. Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).
  7. Meyerhofer, D. Characteristics of resist films produced by spinning. Journal of Applied Physics. 49, (1978).
  8. Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
  9. Chandra, J. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
  10. Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).
  11. Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases. Mycoses. 53, 208-214 (2010).

Comments

4 Comments

  1. That's very nice clip and  I have some question. Normally, HuES cells are very hard to form colony from single cell state. By treating with trypsin, I think, HuES colony will be dissociated into single cell state or very small colony state. How could you solve this problem? Which HuES cell line your lab are using? Looking forward to your response! Tran Ngoc Tung  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 6, 2009 - 7:15 AM
  2. For Tran Njoc Tung, You are totally correct that HuES, in single cell state, form colonies with great difficulty. The trick to avoid making a single cell suspension is to minimize the time for which you trypsinze. As you put trypsin, observe the cells under the microscope and just when there are small aggregates of HuESC's remaninig add the media. This would not allow the formation f single cell suspension. It totally works for me. Hope it dŒs for you.   Sumit Rai

    Reply
    Posted by: Sumit R.
    April 7, 2009 - 4:06 AM
  3. Dear Sir/Madame Unfortunately I can"t see the movie. How can I overcome this problem? Thank you and regards Vitali Shilo vitali.shilo@gmail.com

    Reply
    Posted by: vitali s.
    January 22, 2009 - 8:05 AM
  4. Hello Vitali, Please try the steps on this page: http://www.jove.com/index/page.stp?name=FlashProblems and let me know if you have any trouble. Cheers, Nikita

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 22, 2009 - 9:33 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats