Barwy Pasażowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych linii Trypsyna

Published 10/12/2006
4 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

W tym filmie pokazujemy, jak w naszym laboratorium rutynowo fragmenty barwy linii ludzkich zarodkowych komórek macierzystych, z trypsyny.

Cite this Article

Copy Citation

Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.. J. Vis. Exp. (1), e49, doi:10.3791/49 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

W tym filmie pokazujemy, jak w naszym laboratorium rutynowo fragmenty barwy linii ludzkich zarodkowych komórek macierzystych, z trypsyny. Ludzkich zarodkowych komórek macierzystych są artefakty hodowli komórek i mają tendencję do nabywania karyotypic nieprawidłowości z wysokiej podwojeń populacji. Właściwa pasaży jest niezbędna dla utrzymania zdrowego, niezróżnicowane, karyotypically normalne odcienie ludzkich macierzystych embrionalnych hodowli komórkowej. Po pierwsze, kultura rozwija przemyto w PBS w celu usunięcia resztek mediów i resztek komórek, a następnie komórkową zalewamy niewielką ilość ciepła 0,05% trypsyny-EDTA. Trypsyna jest w lewo na komórki do pięciu minut, a następnie komórki są delikatnie wypadają z 2 ml pipety serologiczne. Zawiesiny komórek są zbierane i mieszane z dużą ilością odcieni media, następnie komórki są zbierane przez delikatne wirowanie. Inaktywowane trypsyny mieszanki mediów jest usuwany, a komórki zawieszano w ogrzana barwy mediów. Odpowiedniego współczynnika podziału jest obliczana (zazwyczaj 1:10 do 1:20), a komórki ponownie wysiano na 1-2 dni stare płyty zawierające monowarstwy napromieniowanych myszy embrionalnych komórek podajnik fibroblastów. Nowo zasiane kultury barwy płyta jest w nienaruszonym stanie przez 48 godzin, a następnie wymiany nośnika na co dzień później. Ważne jest, aby nie trpsinize do pojedynczej zawiesiny komórek, ponieważ zwiększa to ryzyko wprowadzenia karyotypic nieprawidłowości.

Protocol

Ogólny

Zalecamy rozmrożeniu nie więcej niż jednej próbki w danym czasie, aby zapewnić łatwą obsługę. Obsługi należy uważać, aby nie pozostawić kultur w temperaturze pokojowej i CO2 niskie przez długi okres czasu. Wszystkie wirowania żywych komórek odbywa się w temperaturze 500-600 xg przez 5 min w temperaturze pokojowej.

MEFs (mysz zarodkowych komórek Feeder)

  1. Pre-ciepłe mediów MEF do 37 ° C. Usuń fiolki MEF od -80 ° C i natychmiast zanurzyć pół probówki w łaźni wodnej 37 ° C. To powinno zająć około 30-45 sekund przed komórek 80% rozmrożone (małe mrożone lewej części).
  2. Szybko doprowadzić rury do okapu przepływ laminarny, spray w dół z 70% alkoholu, a przeniesienie komórek do mediów ogrzana.
  3. Zaaspiruj roztworu żelatyny z płytek przygotowanych wcześniej.
  4. Podzielić na części 2 ml roztworu MEF w spadku sposób mądry w każdej z sześciu studni. Pamiętaj, aby równomiernie rozprowadzić MEFs o dobrze. Data płyty MEF, i umieścić w temperaturze 37 ° C w inkubatorze na noc, aby MEFs dołączyć do płyty.
  5. Po 6 godzinach MEFs zostanie dołączony do płyty. Najlepiej jest używać płyt MEF 24-48 godzin po poszycia. NIE używać płyty MEF, że jest ponad 4 dni.
  6. Pre-ciepłe barwy mediów i 0,05% Trypsyna / EDTA do 37 ° C Pod maską prelabel jeden jałowy 50 ml stożkowe rury.
  7. Ostrożnie odciągnąć barwy mediów z kultury ma zostać podzielona. Delikatnie umyć studnie z 2 ml 1X buforowym roztworze fosforanowym (PBS) na studzienkę. Zaaspiruj PBS. Dodaj 0,75 ml 0,05% Trypsyna / EDTA do studni.
  8. Wymienić pokrywę i obserwować komórki pod 4x powiększenie. MEFs wokół odcieni kolonie powinny zacząć się wycofać. Kiedy MEFs są dostatecznie zaokrąglone i granice barw kolonie są szorstkie, powrót płytkę do okapu. Proces ten powinien trwać około 5 minut, absolutnie nie dłużej niż 10 minut lub komórki nie będą ponownie rosnąć.
  9. Delikatnie pipety w górę iw dół, mycie dna studni, do jednowarstwowych MEF całkowicie oderwane (monowarstwy jest lepka i może pozostać w jednym kawałku).
  10. Przenieść zawiesinę komórek na 50 ml stożkowa rurka zawierająca dodatkowe barwy mediów. Spin rury komórek 500xg przez 5 minut, Zassać z nośnika, należy uważać, aby nie przeszkadzać osad komórek.
  11. Aby płytki na nową płytkę z MEFs, dodać odpowiednio określona ilość komórek do dodatkowych odcieni media, i pipety rozwiązanie 5-7 razy ze zautomatyzowaną pipety.
  12. Usuń MEF mediów z nowego płyty MEFs.
  13. Podwielokrotności roztworu barwy kroplami do każdej studzienki, upewniając się, aby równomiernie rozprowadzić równomiernie spada o dobrze. Bez potrząsając płytki, dokładnie przywrócić te komórki do 37 ° C w inkubatorze na noc do wynajęcia barwy kolonii nasion.
  14. Barwy komórek pochodzących z podziału powinny zachowywać się podobnie jak te pochodzące z odwilży.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

W tym filmie pokazaliśmy, w jaki sposób rutynowo barwy fragment linii ludzkich zarodkowych komórek macierzystych w laboratorium. Sprawne i regularne dzielenie i pasaży jest niezbędna dla utrzymania zdrowego linii ludzkich zarodkowych komórek macierzystych. Przejście pośredniczy Trypsyna jest znaczącą przewagę odcieni linii komórkowych, jednak ważne jest nie do ponad trypsinize kultur i mieć duży udział pojedynczych komórek podczas ponownego Platting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HuES media 651.5 ml
KO-DMEM 500 ml
PenStrep 6.5 ml
GlutaMAXTM 6.5 ml
NEAA 6.5 ml
2-mercapt–thanol 0.5ul
KO Serum Replacement 65 ml
Plasmanate 65 ml
bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis. Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).
  2. Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).
  3. Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip. PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).
  4. Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
  5. Pierce, C. G. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).
  6. Lee, M. Y. Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).
  7. Meyerhofer, D. Characteristics of resist films produced by spinning. Journal of Applied Physics. 49, (1978).
  8. Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
  9. Chandra, J. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
  10. Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).
  11. Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases. Mycoses. 53, 208-214 (2010).

Comments

4 Comments

  1. That's very nice clip and  I have some question. Normally, HuES cells are very hard to form colony from single cell state. By treating with trypsin, I think, HuES colony will be dissociated into single cell state or very small colony state. How could you solve this problem? Which HuES cell line your lab are using? Looking forward to your response! Tran Ngoc Tung  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 6, 2009 - 7:15 AM
  2. For Tran Njoc Tung, You are totally correct that HuES, in single cell state, form colonies with great difficulty. The trick to avoid making a single cell suspension is to minimize the time for which you trypsinze. As you put trypsin, observe the cells under the microscope and just when there are small aggregates of HuESC's remaninig add the media. This would not allow the formation f single cell suspension. It totally works for me. Hope it dŒs for you.   Sumit Rai

    Reply
    Posted by: Sumit R.
    April 7, 2009 - 4:06 AM
  3. Dear Sir/Madame Unfortunately I can"t see the movie. How can I overcome this problem? Thank you and regards Vitali Shilo vitali.shilo@gmail.com

    Reply
    Posted by: vitali s.
    January 22, 2009 - 8:05 AM
  4. Hello Vitali, Please try the steps on this page: http://www.jove.com/index/page.stp?name=FlashProblems and let me know if you have any trouble. Cheers, Nikita

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 22, 2009 - 9:33 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats