HUES repiquage souches embryonnaires humaines lignées cellulaires à la trypsine

Published 10/12/2006
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Biology

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Summary

Dans cette vidéo, nous montrons comment notre laboratoire passages couramment HUES humaine lignées cellulaires embryonnaires souches à la trypsine.

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Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.. J. Vis. Exp. (1), e49, doi:10.3791/49 (2006).

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Abstract

Dans cette vidéo, nous montrons comment notre laboratoire passages couramment HUES humaine lignées cellulaires embryonnaires souches à la trypsine. Cellules souches embryonnaires humaines sont des artefacts de la culture cellulaire, et ont tendance à acquérir anomalies chromosomiques avec doublements de population élevée. Repiquage correcte est essentielle pour maintenir une bonne santé, indifférenciée, des teintes caryotype humain normal de la culture de cellules souches embryonnaires. Tout d'abord, une culture de l'expansion est lavé dans du PBS pour éliminer les médias résiduelles et les débris cellulaires, puis les cellules sont recouvertes avec un volume minimal de 0,05% au chaud trypsine-EDTA. La trypsine est à gauche sur les cellules pour un maximum de cinq minutes, puis les cellules sont doucement délogés avec une pipette de 2 mL sérologique. La suspension cellulaire est recueilli et mélangé avec un volume important de médias teintes, puis les cellules sont collectées par centrifugation douce. La trypsine inactivé média mélange est éliminé et les cellules remises en suspension dans les médias HUES préchauffé. Un rapport de division appropriée est calculé (généralement 1:10-1:20), et les cellules re-plaqué sur une plaque 1-2 jours anciens contenant une monocouche de cellules embryonnaires de souris irradiées alimentation fibroblastes. La plaque de culture nouvellement ensemencé HUES n'est laissé au repos pendant 48 heures, puis les médias est changé tous les jours par la suite. Il est important de ne pas trpsinize jusqu'à une suspension cellulaire unique, car cela augmente le risque d'introduction d'anomalies chromosomiques.

Protocol

Général

Nous vous recommandons de dégel pas plus d'un échantillon à un moment donné pour assurer une manipulation facile. Le gestionnaire doit prendre soin de ne pas laisser des cultures à la température ambiante et de faibles émissions de CO2 pendant de longues périodes de temps. Tous centrifugation des cellules vivantes se fait à 500-600 g pendant 5 min à température ambiante.

FAE (cellules de souris embryonnaires Feeder)

  1. Préchauffer les médias MEF à 37 ° C. Retirez le flacon MEF de -80 ° C et immédiatement plonger la moitié inférieure du tube dans un bain à 37 ° C l'eau. Il devrait prendre environ 30-45 secondes avant que les cellules sont décongelées 80% (petite partie gelée à gauche).
  2. Vite, apportez le tube à la hotte à flux laminaire, par pulvérisation avec de l'alcool à 70%, et le transfert aux cellules de pré-chauffé médias.
  3. Aspirer la solution de gélatine à partir de plaques préparées auparavant.
  4. Aliquote de 2 ml de solution MEF dans une goutte de manière sage dans chacun des six puits. Soyez sûr de distribuer les FAE uniformément sur le bien. Date de la plaque du MEF, et placer dans un incubateur à 37 ° C pendant la nuit pour permettre aux FAE à attacher à la plaque.
  5. Après 6 heures FAE sera attaché à la plaque. Il est préférable d'utiliser des plaques MEF 24-48 heures après placage. NE PAS utiliser une plaque MEF qui est de plus de 4 jours.
  6. Préchauffer les médias teintes et 0,05% de trypsine / EDTA à 37 ° C sous le capot, une prelabel stérile de 50 ml tube conique.
  7. Aspirer délicatement les médias couleurs de la culture pour être divisé. Lavez délicatement les puits avec 2 ml de solution de tampon phosphate 1X (PBS) par puits. Aspirer le PBS. Ajouter 0,75 ml 0,05% de trypsine / EDTA pour le bien.
  8. Replacer le couvercle, et d'observer les cellules sous un grossissement de 4x. La FAE entourant les colonies HUES devrait commencer à se rétracter. Lorsque la FAE sont suffisamment arrondis et les frontières des colonies teintes sont rugueux, le retour de la plaque à la hotte. Ce processus devrait prendre environ 5 minutes, absolument pas plus de 10 minutes ou vos cellules ne sera pas re-pousser.
  9. Délicatement la pipette de haut en bas, le lavage au fond du puits, jusqu'à ce que la monocouche MEF a complètement détaché (monocouche est collante et peut rester en un seul morceau).
  10. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 ml contenant multimédia supplémentaire teintes. Spin le tube de cellules 500xg pendant 5 min, Aspirer les médias, attention à ne pas perturber le culot cellulaire.
  11. Pour plaque sur une nouvelle plaque d'FAE, ajouter le volume déterminé de manière appropriée des cellules vers d'autres supports teintes, et la pipette la solution 5-7 fois avec une pipette automatique.
  12. Retirez le support du MEF à partir d'une plaque fraîche de FAE.
  13. Aliquoter la chute solution HUES sage de chaque puits, en veillant à répartir équitablement les gouttes sur le bien. Sans secouant la plaque, avec précaution les cellules d'un incubateur à 37 ° C pendant la nuit pour laisser HUES colonies semences.
  14. Cellules HUES sortant d'une scission devrait se comportent comme ceux qui sortent d'un dégel.

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Discussion

Dans cette vidéo, nous avons démontré comment nous HUES passage couramment lignées de cellules souches dans notre laboratoire. Fractionnement efficace et régulière et repiquage est essentiel pour maintenir une bonne santé humaine ligne de cellules souches embryonnaires. Passage de la médiation trypsine est un avantage significatif de teintes des lignées de cellules, cependant, il est important de ne pas trop trypsiniser cultures ou d'avoir une grande proportion de cellules individuelles pendant le re-Platting.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
HuES media 651.5 ml
KO-DMEM 500 ml
PenStrep 6.5 ml
GlutaMAXTM 6.5 ml
NEAA 6.5 ml
2-mercapt–thanol 0.5ul
KO Serum Replacement 65 ml
Plasmanate 65 ml
bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml

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References

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Comments

4 Comments

  1. That's very nice clip and  I have some question. Normally, HuES cells are very hard to form colony from single cell state. By treating with trypsin, I think, HuES colony will be dissociated into single cell state or very small colony state. How could you solve this problem? Which HuES cell line your lab are using? Looking forward to your response! Tran Ngoc Tung  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 6, 2009 - 7:15 AM
  2. For Tran Njoc Tung, You are totally correct that HuES, in single cell state, form colonies with great difficulty. The trick to avoid making a single cell suspension is to minimize the time for which you trypsinze. As you put trypsin, observe the cells under the microscope and just when there are small aggregates of HuESC's remaninig add the media. This would not allow the formation f single cell suspension. It totally works for me. Hope it dŒs for you.   Sumit Rai

    Reply
    Posted by: Sumit R.
    April 7, 2009 - 4:06 AM
  3. Dear Sir/Madame Unfortunately I can"t see the movie. How can I overcome this problem? Thank you and regards Vitali Shilo vitali.shilo@gmail.com

    Reply
    Posted by: vitali s.
    January 22, 2009 - 8:05 AM
  4. Hello Vitali, Please try the steps on this page: http://www.jove.com/index/page.stp?name=FlashProblems and let me know if you have any trouble. Cheers, Nikita

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 22, 2009 - 9:33 AM

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