Passage af Hues humane embryonale stamceller-linjer med Trypsin

Published 10/12/2006
4 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

I denne video viser vi, hvordan vores laboratorium rutinemæssigt passager farvetone humane embryonale stamcellelinjer med trypsin.

Cite this Article

Copy Citation

Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.. J. Vis. Exp. (1), e49, doi:10.3791/49 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

I denne video viser vi, hvordan vores laboratorium rutinemæssigt passager farvetone humane embryonale stamcellelinjer med trypsin Humane embryonale stamceller er artefakter i cellekultur, og har tendens til at erhverve karyotypic abnormiteter med høje populationsfordoblinger. Korrekt passager er afgørende for at opretholde en sund, udifferentieret, karyotypically normal Hues humane embryonale stamceller kultur. For det første er en ekspanderende kultur vasket i PBS for at fjerne resterende medier og cellerester, og derefter celler overlejret med et minimalt volumen af ​​varm 0,05% trypsin-EDTA. Trypsin efterlades på cellerne op til fem minutter, hvorefter cellerne forsigtigt løsnes med en 2 ml serologisk pipette Cellesuspensionen opsamles og blandes med et stort volumen af ​​nuancer medier, der derefter opsamles cellerne ved forsigtig centrifugering. Den inaktiverede trypsin mediet Blandingen fjernes, og cellerne resuspenderet i forvarmet farvetone medier. En passende fordeling beregnes (generelt fra 1:10 til 1:20), og cellerne igen udpladet på en 1-2 dage gammelplade indeholdende et monolag af bestrålede muse embryonale fibroblaster fødeceller. Den nyligt podes farvetoner dyrkningsplade efterlades uforstyrret i 48 timer, hvorefter mediet skiftes hver dag derefter. Det er vigtigt ikke at trpsinize ned til en enkelt cellesuspension, da dette øger risikoen for at indføre karyotypic abnormiteter.

Protocol

General

Vi anbefaler optøning ikke mere end én prøve på et givent tidspunkt for at sikre nem håndtering. Føreren skal sørge for ikke at forlade kulturer ved stuetemperatur og lav CO2 i lange perioder ad gangen. Alle centrifugering af levende celler sker ved 500-600 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.

MEF'er (muse embryonale fødeceller)

  1. Præ-varme MEF medier til 37 ° C. Fjerne MEF hætteglasset fra -80 ° C og straks nedsænke den nederste halvdel af røret i et 37 ° C vandbad. Det bør tage ca 30-45 sekunder, før cellerne er 80% optøet (lille frosne portionsstykke venstre).
  2. Hurtigt bringe røret til laminært flow, spray ned med 70% alkohol, og overføre cellerne til præ-opvarmede medium.
  3. Aspirer gelatineopløsningen fra plader fremstillet tidligere.
  4. Aliquot 2 ml MEF opløsning i en dråbevis måde i hver af de seks brønde. Sørg for at distribuere MEF'er jævnt om brønden. Dato MEFplade, og anbringes i en 37 ° C inkubator natten over for at tillade MEF'er kan knytte til pladen.
  5. Efter 6 timer MEF'er vil blive knyttet til pladen. Det er bedst at anvende MEF pladerne 24-48 timer efter udpladning. Brug IKKE en MEF plade, der er over 4 dage gammel.
  6. Præ-varme nuancer medier og 0,05% trypsin / EDTA til 37 ° C under hætten, prelabel et sterilt 50 ml konisk rør.
  7. Forsigtigt suge de farver medier fra den kultur, der skal deles. Forsigtigt vaske brøndene med 2 ml 1X phosphatpufret opløsning (PBS) pr. Aspirer PBS. Tilsættes 0,75 ml 0,05% trypsin / EDTA til brønden.
  8. Sæt låg, og observere de celler under 4x forstørrelse. Den MEF'er omkring de farver kolonier bør begynde at trække. Når MEF'er er tilstrækkeligt afrundede, og grænserne af nuancerne kolonier er ru, tilbage pladen til emhætten. Denne proces bør tage omkring 5 minutter, absolut ikke længere end 10 minutter eller dine celler vil ikke vokse ud igen.
  9. Forsigtigt pipettere op og ned, vask bunden af ​​the godt, indtil MEF enkeltlags helt har løsnet sig (enkeltlags er klæbrig og kan forblive i ét stykke).
  10. Overfør cellesuspensionen til en 50 ml konisk rør indeholdende yderligere farvetone medier. Spin røret af celler, 500 x g i 5 minutter, suges væk fra medierne, være omhyggelig med ikke at forstyrre cellepelleten.
  11. Til pladen på en ny plade af MEF'er er passende bestemmes volumenet af celler tilsættes til yderligere farvetone medier, og pipetteres opløsningen 5-7 gange med en automatiseret pipette.
  12. Fjern MEF medier fra en frisk plade af MEF'er.
  13. Alikvot den Hues løsningen fald klogt at hver brønd, og sørg for at fordele falder jævnt om brønden. Uden omrystning af pladen, returnerer omhyggeligt cellerne til et 37 ° C inkubator natten over for at lade farvetoner kolonier frø.
  14. Farvetone celler, der kommer ud af en split bør opføre sig på samme måde som dem, der kommer ud af en tø.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne video har vi vist, hvordan vi rutinemæssigt passage farvetone humane embryonale stamcellelinjer i vores laboratorium. Effektiv og regelmæssig opdeling og passage er afgørende for at opretholde en sund humane embryonale stamceller linje. Trypsin medieret passage er en betydelig fordel af nuancer cellelinier, men det er vigtigt ikke at over Trypsinisér kulturer eller at have en stor del af enkelte celler under re-platting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HuES media 651.5 ml
KO-DMEM 500 ml
PenStrep 6.5 ml
GlutaMAXTM 6.5 ml
NEAA 6.5 ml
2-mercapt–thanol 0.5ul
KO Serum Replacement 65 ml
Plasmanate 65 ml
bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis. Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).
  2. Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).
  3. Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip. PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).
  4. Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
  5. Pierce, C. G. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).
  6. Lee, M. Y. Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).
  7. Meyerhofer, D. Characteristics of resist films produced by spinning. Journal of Applied Physics. 49, (1978).
  8. Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
  9. Chandra, J. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
  10. Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).
  11. Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases. Mycoses. 53, 208-214 (2010).

Comments

4 Comments

  1. That's very nice clip and  I have some question. Normally, HuES cells are very hard to form colony from single cell state. By treating with trypsin, I think, HuES colony will be dissociated into single cell state or very small colony state. How could you solve this problem? Which HuES cell line your lab are using? Looking forward to your response! Tran Ngoc Tung  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 6, 2009 - 7:15 AM
  2. For Tran Njoc Tung, You are totally correct that HuES, in single cell state, form colonies with great difficulty. The trick to avoid making a single cell suspension is to minimize the time for which you trypsinze. As you put trypsin, observe the cells under the microscope and just when there are small aggregates of HuESC's remaninig add the media. This would not allow the formation f single cell suspension. It totally works for me. Hope it dŒs for you.   Sumit Rai

    Reply
    Posted by: Sumit R.
    April 7, 2009 - 4:06 AM
  3. Dear Sir/Madame Unfortunately I can"t see the movie. How can I overcome this problem? Thank you and regards Vitali Shilo vitali.shilo@gmail.com

    Reply
    Posted by: vitali s.
    January 22, 2009 - 8:05 AM
  4. Hello Vitali, Please try the steps on this page: http://www.jove.com/index/page.stp?name=FlashProblems and let me know if you have any trouble. Cheers, Nikita

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 22, 2009 - 9:33 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats