Passagierung FARBEN humanen embryonalen Stammzellen-Linien mit Trypsin

Published 10/12/2006
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Biology

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Summary

In diesem Video zeigen wir, wie unser Labor routinemäßig Passagen FARBEN humanen embryonalen Stammzell-Linien mit Trypsin.

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Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.. J. Vis. Exp. (1), e49, doi:10.3791/49 (2006).

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Abstract

In diesem Video zeigen wir, wie unser Labor routinemäßig Passagen FARBEN humanen embryonalen Stammzell-Linien mit Trypsin. Menschliche embryonale Stammzellen sind Artefakte der Zellkultur, und neigen dazu, karyotypischen Anomalien mit hoher Populationsverdopplungen erwerben. Proper Passagieren ist essentiell für die Aufrechterhaltung einer gesunden, undifferenziert, karyotypisch normalen FARBEN menschlichen embryonalen Stammzellen Kultur. Erstens, eine expandierende Kultur in PBS gewaschen, um restliches Medium und Zelltrümmer zu entfernen, dann Zellen werden mit einem minimalen Volumen von warmen 0,05% Trypsin-EDTA überlagert. Trypsin auf die Zellen für bis zu fünf Minuten nach links, dann Zellen werden vorsichtig mit einer 2-ml-serologischen Pipette verdrängt. Die Zellsuspension gesammelt und mit einem großen Volumen von Farbtönen Medien vermischt, dann Zellen werden durch sanfte Zentrifugation gesammelt. Das inaktivierte Trypsin Medien Gemisch entfernt und die Zellen in vorgewärmten FARBEN Medien resuspendiert. Eine entsprechende Teilungsverhältnis wird berechnet (in der Regel von 1.10 bis 01.20 Uhr), und die Zellen auf eine 1-2 Tage alten Platte mit einer Monoschicht von bestrahlten embryonalen Maus-Fibroblasten-Feeder-Zellen re-vernickelt. Die neu ausgesät FARBEN Kultur Platte links ungestört ist für 48 Uhr, dann werden die Medien wird jeden Tag danach. Es ist wichtig, nicht zu trpsinize auf eine einzige Zellsuspension, wie dies erhöht die Gefahr der Einschleppung von karyotypischen Anomalien.

Protocol

General

Wir empfehlen dem Auftauen nicht mehr als eine Probe zu einem bestimmten Zeitpunkt auf eine einfache Handhabung zu gewährleisten. Der Hundeführer sollte darauf achten, dass Kulturen bei Raumtemperatur und niedrigen CO2-Urlaub für längere Zeit. Alle Zentrifugation von lebenden Zellen ist bei 500-600 xg für 5 min bei Raumtemperatur.

MEFs (embryonalen Feeder-Zellen)

  1. Pre-warm MEF Medien bis 37 ° C. Entfernen Sie MEF Fläschchen von -80 ° C und sofort tauchen die untere Hälfte der Röhre in einem 37 ° C Wasserbad. Es sollte ca. 30-45 Sekunden dauern, bevor die Zellen 80% aufgetaut (kleine gefrorene Teil links).
  2. Bringt schnell das Rohr auf die Laminarströmungshaube, abspritzen mit 70% Alkohol und Transfer Zellen vorgewärmte Medien.
  3. Saugen Sie die Gelatine-Lösung von Platten hergestellt früher.
  4. Aliquot von 2 ml MEF-Lösung in einem tropfenweise Weise in jeder der sechs Brunnen. Achten Sie darauf, die MEFs gleichmäßig zu verteilen über den Brunnen. Datum der MEF Platte und in einem 37 ° C Inkubator über Nacht zu ermöglichen MEFs auf Platte befestigen.
  5. Nach 6 Stunden MEFs wird an der Platte befestigt werden. Es ist am besten zu nutzen MEF Platten 24-48 Stunden nach dem Ausplattieren. NICHT in der MEF Platte, die über 4 Tage alt ist.
  6. Pre-warmen Farbtönen Medien und 0,05% Trypsin / EDTA auf 37 ° C Unter der Haube prelabel ein steriles 50 ml konischen Rohr.
  7. Vorsichtig absaugen Die Farbtöne Medien aus der Kultur, die geteilt werden. Vorsichtig waschen die Vertiefungen mit 2 ml 1X Phosphat-gepufferter Lösung (PBS) pro Vertiefung. Saugen Sie das PBS. Add 0,75 ml 0,05% Trypsin / EDTA zum Brunnen.
  8. Ersetzen Deckel, und beobachten Sie die Zellen unter 4x Vergrößerung. Die MEFs umliegenden Die Farbtöne Kolonien beginnen sich zurückzuziehen. Wenn die MEFs ausreichend sind gerundet und die Grenzen der Farbtöne Kolonien sind rau, Rückkehr der Platte an der Kapuze. Dieser Prozess dauert ca. 5 Minuten, absolut nicht länger als 10 Minuten oder Ihre Zellen nicht wieder wachsen.
  9. Gently Pipette auf und ab, das Waschen der Grund des Brunnens, bis die MEF Monoschicht völlig losgelöst hat (Monolayer ist klebrig und kann in einem Stück bleiben).
  10. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 50 ml konische Röhrchen mit zusätzlichen FARBEN Medien. Drehen Sie das Rohr von Zellen 500 xg für 5 Minuten, Absaugen der Medien, darauf achten, nicht das Zellpellet zu stören.
  11. Um Platte auf eine neue Platte von MEFs, fügen Sie den entsprechend bestimmten Volumen der Zellen, um zusätzliche FARBEN Medien und Pipette die Lösung 5-7 mal mit einem automatisierten Pipette.
  12. Entfernen Sie die MEF Druckmedien aus einem neuen Platte von MEFs.
  13. Aliquot der Farbtöne Lösung tropfenweise in jede Vertiefung, so dass Sie die Tropfen gleichmäßig über die gut zu verteilen. Ohne Schütteln der Platte vorsichtig wieder die Zellen zu einer 37 ° C Inkubator über Nacht zu lassen FARBEN Kolonien Samen.
  14. FARBEN Zellen kommen aus einem geteilten sollte sich ähnlich wie diejenigen, die aus einem Tauwetter.

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Discussion

In diesem Video demonstriert, wie wir routinemäßig Durchgang FARBEN humanen embryonalen Stammzelllinien in unserem Labor. Effiziente und regelmäßige Aufteilung und Passagieren ist essentiell für die Aufrechterhaltung einer gesunden menschlichen embryonalen Stammzell-Linie. Trypsin-vermittelten Passage ist ein wesentlicher Vorteil von Farbtönen Zelllinien, ist es jedoch wichtig, nicht über trypsinize Kulturen oder zu einem großen Anteil der einzelnen Zellen während des Wiedereintritts Flechten haben.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
HuES media 651.5 ml
KO-DMEM 500 ml
PenStrep 6.5 ml
GlutaMAXTM 6.5 ml
NEAA 6.5 ml
2-mercapt–thanol 0.5ul
KO Serum Replacement 65 ml
Plasmanate 65 ml
bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml

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References

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Comments

4 Comments

  1. That's very nice clip and  I have some question. Normally, HuES cells are very hard to form colony from single cell state. By treating with trypsin, I think, HuES colony will be dissociated into single cell state or very small colony state. How could you solve this problem? Which HuES cell line your lab are using? Looking forward to your response! Tran Ngoc Tung  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 6, 2009 - 7:15 AM
  2. For Tran Njoc Tung, You are totally correct that HuES, in single cell state, form colonies with great difficulty. The trick to avoid making a single cell suspension is to minimize the time for which you trypsinze. As you put trypsin, observe the cells under the microscope and just when there are small aggregates of HuESC's remaninig add the media. This would not allow the formation f single cell suspension. It totally works for me. Hope it dŒs for you.   Sumit Rai

    Reply
    Posted by: Sumit R.
    April 7, 2009 - 4:06 AM
  3. Dear Sir/Madame Unfortunately I can"t see the movie. How can I overcome this problem? Thank you and regards Vitali Shilo vitali.shilo@gmail.com

    Reply
    Posted by: vitali s.
    January 22, 2009 - 8:05 AM
  4. Hello Vitali, Please try the steps on this page: http://www.jove.com/index/page.stp?name=FlashProblems and let me know if you have any trouble. Cheers, Nikita

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 22, 2009 - 9:33 AM

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