RIFLESSI Passaging sulle cellule staminali embrionali umane-linee con tripsina

Published 10/12/2006
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Biology

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Summary

In questo video ci dimostra come il nostro laboratorio passaggi di routine RIFLESSI embrionali umane linee di cellule staminali con tripsina.

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Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.. J. Vis. Exp. (1), e49, doi:10.3791/49 (2006).

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Abstract

In questo video ci dimostra come il nostro laboratorio passaggi di routine RIFLESSI embrionali umane linee di cellule staminali con tripsina. Cellule staminali embrionali umane sono artefatti della coltura cellulare, e tendono ad acquisire anormalità del cariotipo con raddoppi di popolazione. Passaging è essenziale per il mantenimento di un sano, indifferenziato, tinte karyotypically umano normale coltura di cellule staminali embrionali. In primo luogo, una cultura in espansione è lavato in PBS per rimuovere il supporto residui e detriti cellulari, cellule sono poi sovrapposte con un volume minimo di caldo 0,05% tripsina-EDTA. Tripsina viene lasciato sulle cellule per un massimo di cinque minuti, poi le cellule sono staccato delicatamente con una pipetta sierologica 2 ml. La sospensione cellulare viene raccolto e mescolato con una grande quantità di mezzi toni, poi le cellule sono raccolte per centrifugazione delicata. Il inattivato tripsina miscela dei media viene rimosso e le cellule risospese in pre-riscaldato i media tonalità. Un rapporto di divisione appropriata è calcolato (generalmente 1:10-1:20), e le cellule ri-placcato su una lastra di 1-2 giorni vecchio contenente un monostrato di cellule di fibroblasti embrionali irradiato alimentatore del mouse. La nuova testa di serie cultura RIFLESSI piatto è lasciato riposare per 48 ore, allora il programma viene modificato ogni giorno dopo. E 'importante non trpsinize fino a una sospensione singola cella, in quanto ciò aumenta il rischio di introdurre anomalie del cariotipo.

Protocol

Generale

Si consiglia di scongelamento non più di un campione in un dato momento per garantire una guida facile. Il gestore deve fare attenzione a non lasciare le culture a temperatura ambiente e di CO2 basse per lunghi periodi di tempo. Tutti centrifugazione di cellule vive è fatto a 500-600 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.

MEF (cellule embrionali di topo alimentatore)

  1. Pre-riscaldare i media MEF a 37 ° C. Rimuovere fiala MEF da -80 ° C e subito immergere la metà inferiore del tubo in un bagno d'acqua a 37 ° C. Occorrono circa 30-45 secondi prima che le cellule sono 80% scongelati (piccola porzione congelata a sinistra).
  2. Portare rapidamente il tubo alla cappa a flusso laminare, spruzzo giù con alcool al 70%, e il trasferimento di cellule pre-riscaldato media.
  3. Aspirare la soluzione di gelatina da piastre preparate in precedenza.
  4. Aliquota di 2 ml di soluzione MEF in una goccia modo sapiente in ognuno dei sei pozzi. Assicurarsi di distribuire il MEF in modo uniforme sul bene. Data la piastra MEF, e mettere in un incubatore a 37 ° C durante la notte per permettere MEF di allegare al piatto.
  5. Dopo 6 ore MEF sarà allegato alla piastra. E 'meglio usare piastre MEF 24-48 ore dopo la placcatura. NON usare una piastra MEF che è più di 4 giorni.
  6. Preriscaldare mezzi colori e 0,05% tripsina / EDTA a 37 ° C Sotto il cofano, prelabel uno sterile tubo da 50 ml.
  7. Con attenzione aspirare i media RIFLESSI dalla cultura da dividere. Lavare delicatamente i pozzetti con 2 ml di soluzione 1X tampone fosfato (PBS) per bene. Aspirare il PBS. Aggiungere 0,75 ml 0,05% tripsina / EDTA al pozzo.
  8. Rimettere il coperchio, e osservare le cellule sotto ingrandimento 4x. Il MEF che circonda le colonie RIFLESSI dovrebbe cominciare a ritrattare. Quando il MEF sono sufficientemente arrotondati ed i confini delle colonie tonalità sono grezzi, la piastra di ritorno alla cappa. Questo processo dovrebbe prendere circa 5 minuti, assolutamente non più di 10 minuti o le cellule non si ri-crescere.
  9. Pipettare delicatamente su e giù, lavare il fondo del pozzo, fino a quando il monostrato MEF ha completamente staccato (monostrato è appiccicoso e può rimanere in un unico pezzo).
  10. Trasferire la sospensione di cellule in una provetta da 50 ml conica contenente ulteriori mezzi di tonalità. Rotazione del tubo delle cellule 500xg per 5 minuti, fuori Aspirare i media, fare attenzione a non disturbare il pellet
  11. Alla piastra su una nuova piastra di MEF, aggiungere il volume pertinente per definire delle cellule di ulteriori mezzi di sfumature, e pipetta la soluzione 5-7 volte con una pipetta automatica.
  12. Rimuovere il supporto MEF da un piatto fresco del MEF.
  13. Aliquota della soluzione RIFLESSI goccia a goccia in ciascun pozzetto, avendo cura di distribuire uniformemente le gocce per il bene. Senza agitare la piastra, con attenzione ritornare le cellule a 37 ° C in incubatore durante la notte per far RIFLESSI seme colonie.
  14. Cellule RIFLESSI uscendo da una divisa dovrebbe comportarsi in modo simile a quelle che esce da un disgelo.

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Discussion

In questo video abbiamo dimostrato il modo in cui abitualmente RIFLESSI passaggio embrionali umane linee di cellule staminali nel nostro laboratorio. Suddivisione efficiente e regolare e passaging è essenziale per mantenere un sano embrionali umane linea di cellule staminali. Passaggio mediato tripsina è un vantaggio significativo di linee cellulari sfumature, tuttavia, è importante non trypsinize più culture o di avere un gran numero di singole cellule durante il rientro platting.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
HuES media 651.5 ml
KO-DMEM 500 ml
PenStrep 6.5 ml
GlutaMAXTM 6.5 ml
NEAA 6.5 ml
2-mercapt–thanol 0.5ul
KO Serum Replacement 65 ml
Plasmanate 65 ml
bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml

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References

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Comments

4 Comments

  1. That's very nice clip and  I have some question. Normally, HuES cells are very hard to form colony from single cell state. By treating with trypsin, I think, HuES colony will be dissociated into single cell state or very small colony state. How could you solve this problem? Which HuES cell line your lab are using? Looking forward to your response! Tran Ngoc Tung  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 6, 2009 - 7:15 AM
  2. For Tran Njoc Tung, You are totally correct that HuES, in single cell state, form colonies with great difficulty. The trick to avoid making a single cell suspension is to minimize the time for which you trypsinze. As you put trypsin, observe the cells under the microscope and just when there are small aggregates of HuESC's remaninig add the media. This would not allow the formation f single cell suspension. It totally works for me. Hope it dŒs for you.   Sumit Rai

    Reply
    Posted by: Sumit R.
    April 7, 2009 - 4:06 AM
  3. Dear Sir/Madame Unfortunately I can"t see the movie. How can I overcome this problem? Thank you and regards Vitali Shilo vitali.shilo@gmail.com

    Reply
    Posted by: vitali s.
    January 22, 2009 - 8:05 AM
  4. Hello Vitali, Please try the steps on this page: http://www.jove.com/index/page.stp?name=FlashProblems and let me know if you have any trouble. Cheers, Nikita

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 22, 2009 - 9:33 AM

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