Tripsin ile Pasajlanması tonlar İnsan Embriyonik Kök Hücre hatları

Published 10/12/2006
4 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Bu video laboratuarımızda rutin tripsin tonlar insan embriyonik kök hücre hatları geçişleri nasıl göstermektedir.

Cite this Article

Copy Citation

Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.. J. Vis. Exp. (1), e49, doi:10.3791/49 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bu video laboratuarımızda rutin tripsin tonlar insan embriyonik kök hücre hatları geçişleri nasıl göstermektedir. İnsan embriyonik kök hücreleri, hücre kültürü eserler, ve yüksek nüfus çiftlenmeler karyotipik anormallikler edinmeye eğilimindedir. Uygun Pasajlanması sağlıklı, farklılaşmamış, karyotipik olarak normal tonlar, insan embriyonik kök hücre kültürü korumak için şarttır. Birincisi, genişleyen bir kültürün artık medya ve hücre enkaz kaldırmak için PBS içinde yıkanır, sonra da hücre sıcak 0.05% tripsin-EDTA minimum hacmi ile üst üste. Tripsin, beş dakika kadar hücreleri sol, sonra da hücre 2mL serolojik bir pipet yardımıyla hafifçe yerinden vardır. Tonlar medyanın büyük hacimli hücre süspansiyonu ile toplanır ve karıştırılır, sonra da hücre nazik santrifüj tarafından toplanır. Inaktive tripsin medya karışımı kaldırılır ve hücrelerin önceden ısıtılmış tonlar medya yeniden bekletildi. Uygun bir bölünme oranı (genellikle 1:10-01:20) hesaplanır ve ışınlanmış fare embriyonik fibroblast besleyici hücreler tek tabaka içeren 1-2 gün eski bir plaka üzerine yeniden kaplı hücreler. Yeni seribaşı tonlar kültür plaka 48 saat boyunca rahatsız edilmeden bırakılırsa, o medya bundan sonra her gün değiştirilir. Bu karyotipik anormallikleri tanıtan riskini artırır gibi, tek bir hücre süspansiyonu aşağı trpsinize için önemlidir.

Protocol

Genel

Biz kolay kullanım sağlamak için belirli bir zamanda birden fazla örnek çözülme öneririz. İşleyici, uzun bir süre için oda sıcaklığında ve düşük CO2 kültürler bırakmamaya özen göstermelisiniz. Bütün canlı hücreler santrifüj xg'de 500-600 oda sıcaklığında 5 dakika süreyle yapılır.

MEFS (Fare Embriyonik Besleyici Hücreler)

  1. 37 Pre-sıcak MEF medya ° C -80 Den MEF flakon çıkarın ° C ve hemen batığın 37 ° C su banyosunda tüp alt yarısı. Hücrelerin% 80 (küçük donmuş kısmını sol) çözülmüş önce 30-45 saniye sürer.
  2. Hızla tüp, laminer akış kaputu getirmek,% 70 alkol ile sprey ve önceden ısıtılmış medya hücreleri aktarmak.
  3. Önceden hazırlanmış plakalar jelatin solüsyonu aspire edin.
  4. MEF her altı kuyu içine bir damla akıllıca bir şekilde çözüm kısım 2 ml. MEFS eşit dağıtmak için iyi hakkında emin olun. MEFS plaka takmak için izin gecede MEF plaka ve 37 ° C inkübatör yer tarih.
  5. 6 saat sonra MEFS plaka eklenecektir. MEF plakalar 24-48 saat sonra kaplama kullanmak en iyisidir. 4 gün ve üzeri bir MEF plaka KULLANMAYIN.
  6. Pre-sıcak tonlar medya ve% 0.05 tripsin / EDTA - 37 ° C Kaputun altında, prelabel bir steril 50 ml konik tüp.
  7. Dikkatle aspirat kültürü tonlar medya bölünebilir. 1X fosfat tampon çözeltisi (PBS) başına 2mL kuyu nazikçe yıkayın. PBS aspire. 0.75 ml% 0.05 tripsin / EDTA iyi ettiniz.
  8. Kapağını değiştirin ve 4x büyütme altında hücreler gözlemlemek. Tonlar kolonileri çevreleyen MEFS geri çekmek için başlamalıdır. MEFS yeterince yuvarlak ve tonlar kolonilerin sınırları kaba, kaput, plaka dönün. Bu süreç kesinlikle HAYIR, 10 dakika veya hücreleri yeniden büyümek olmaz daha uzun yaklaşık 5 dakika sürer.
  9. MEF tek tabaka tamamen müstakil (tek tabaka yapışkan ve tek parça halinde kalması) kadar yavaşça kuyunun altındaki yıkama, aşağı yukarı pipet ve.
  10. 50 ml konik boru, ek tonlar medya içeren bir hücre süspansiyonu aktarın. Spin tüp 5 dakika için 500xg hücrelerin, hücre pelletini rahatsız etmemek için dikkatli olmak, medya aspire.
  11. MEFS yeni bir tabağa plaka için ek tonlar medya hücrelerinin uygun şekilde belirlenir hacmi ekleyin ve 5-7 kez otomatik bir pipet yardımıyla çözüm pipetle.
  12. MEFS taze bir plaka MEF medya çıkarın.
  13. Kısım iyi hakkında, eşit bir şekilde düşer dağıtmak için emin olun, her bir kuyunun akıllıca tonlar damla. Plaka sallayarak, tonlar koloniler tohum sağlamak için dikkatli bir şekilde bir gecede 37 ° C inkübatör hücrelerin geri.
  14. Tonlar hücreleri bir bölünme çıkan bir çözülme çıkan bu benzer şekilde davranır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu video laboratuvarda rutin geçit tonlar insan embriyonik kök hücre hatları gösterdi. Verimli ve düzenli bir bölme ve Pasajlanması sağlıklı bir insan embriyonik kök hücre hattı korumak için şarttır. Tripsin aracılı geçit tonlar hücre hatlarının önemli bir avantaj, ancak kültürler üstü trypsinize veya yeniden platting sırasında tek hücre büyük bir kısmı için değil önemlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HuES media 651.5 ml
KO-DMEM 500 ml
PenStrep 6.5 ml
GlutaMAXTM 6.5 ml
NEAA 6.5 ml
2-mercapt–thanol 0.5ul
KO Serum Replacement 65 ml
Plasmanate 65 ml
bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis. Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).
  2. Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).
  3. Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip. PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).
  4. Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
  5. Pierce, C. G. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).
  6. Lee, M. Y. Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).
  7. Meyerhofer, D. Characteristics of resist films produced by spinning. Journal of Applied Physics. 49, (1978).
  8. Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
  9. Chandra, J. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
  10. Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).
  11. Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases. Mycoses. 53, 208-214 (2010).

Comments

4 Comments

  1. That's very nice clip and  I have some question. Normally, HuES cells are very hard to form colony from single cell state. By treating with trypsin, I think, HuES colony will be dissociated into single cell state or very small colony state. How could you solve this problem? Which HuES cell line your lab are using? Looking forward to your response! Tran Ngoc Tung  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 6, 2009 - 7:15 AM
  2. For Tran Njoc Tung, You are totally correct that HuES, in single cell state, form colonies with great difficulty. The trick to avoid making a single cell suspension is to minimize the time for which you trypsinze. As you put trypsin, observe the cells under the microscope and just when there are small aggregates of HuESC's remaninig add the media. This would not allow the formation f single cell suspension. It totally works for me. Hope it dŒs for you.   Sumit Rai

    Reply
    Posted by: Sumit R.
    April 7, 2009 - 4:06 AM
  3. Dear Sir/Madame Unfortunately I can"t see the movie. How can I overcome this problem? Thank you and regards Vitali Shilo vitali.shilo@gmail.com

    Reply
    Posted by: vitali s.
    January 22, 2009 - 8:05 AM
  4. Hello Vitali, Please try the steps on this page: http://www.jove.com/index/page.stp?name=FlashProblems and let me know if you have any trouble. Cheers, Nikita

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 22, 2009 - 9:33 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats