Author Produced

الاستفادة من وجود نافذة القحف لتصور الشريان الدماغي الأوسط خلال Endothelin-1 انسداد الشريان الدماغي الأوسط المستحثة

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هذه المقالة طريقة لتصور الشرايين الدماغية الفئران من خلال نافذة الجمجمة باستخدام قطع القحف الزمنية لعرض أجزاء القريبة من الشريان الدماغي الأوسط (

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Regenhardt, R. W., Ansari, S., Azari, H., Caldwell, K. J., Mecca, A. P. Utilizing a Cranial Window to Visualize the Middle Cerebral Artery During Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion. J. Vis. Exp. (72), e50015, doi:10.3791/50015 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

إنشاء نافذة الجمجمة هو الأسلوب الذي يسمح التصور المباشر الهياكل على سطح القشرية من الدماغ 1-3. لا يمكن أن يؤديها هذه التقنية في العديد من المواقع التي تغمر المخ الفئران، ولكن هو الأكثر بسهولة نفذت من خلال خلق قطع القحف على العظام يمكن الوصول إليها بسهولة أو الجبهي الجداري. في معظم الأحيان، وقد استخدمنا هذه التقنية بالاشتراك مع endothelin-1 الشريان المخي الأوسط نموذج انسداد السكتة الدماغية لتحديد التغيرات في الشريان المخي الأوسط قطر السفينة التي تحدث مع الحقن من 1-endothelin في لحمة الدماغ المتاخمة للMCA القريبة 4، 5. من أجل تصور الجزء القريب من خلال MCA يسببها endothelin MCAO -1، نستخدم تقنية لإنشاء إطار الجمجمة عن طريق العظم الصدغي على الجانب الوحشي من الجمجمة الفئران (الشكل 1). يمكن تصور الشرايين الدماغية إما مع أو الجافية سليمة مع قطعي الجافية وretraالمديرية. الأكثر شيوعا، نترك سليمة الجافية خلال التصور منذ endothelin-1 MCAO بفعل ينطوي على تسليم الببتيد vasoconstricting في لحمة الدماغ. هذا يتجاوز الحاجة إلى شق الجافية مباشرة عبر السفن تصور لتسليم المخدرات. وهذا البروتوكول تصف كيفية إنشاء إطار لتصور الشرايين القحفية الدماغية على نحو تدريجي، وكذلك كيفية تجنب الكثير من المزالق المحتملة المتصلة بهذا الأسلوب.

Protocol

وقد وافق هذا البروتوكول من قبل رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام (IACUC) في جامعة ولاية فلوريدا ومتوافق مع "دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية" (الطبعة الثامنة، والأكاديمية الوطنية للعلوم، 2011).

المواد

  1. الحيوانات: ثمانية أسابيع من العمر، من الذكور، سبراغ داولي الفئران (تشارلز ريفر مزارع، ويلمنجتون، MA، الولايات المتحدة الأمريكية) وزنها 250-300 ز في وقت الجراحة.
  2. خدر
    1. استنشاق التخدير نظام (VetEquip شركة، بليسانتون، CA، الولايات المتحدة الأمريكية)
    2. Isoflurane مخدر (الصيدلانيات باكستر، ديرفيلد، IL، الولايات المتحدة الأمريكية)
  3. التجسيمي النظام (ديفيد KOPF الصكوك، Tujunga، CA، الولايات المتحدة الأمريكية)
    1. نظام الحيوانات الصغيرة التجسيمي
    2. غير تمزق الأذن القضبان لالفئران
    3. حامل الغاز رئيس التخدير بالنسبة للفئران
  4. درجة الحرارة التنظيم
    1. BAT-12 ميزان حرارة المسبار الميكروي (البنكأدوات دقيقة، وشركة، ساراسوتا، FL، الولايات المتحدة الأمريكية)
    2. T / PUMP، TP600 بطانية الحرارية (صناعات Gaymar، وشركة، بستان حديقة، NY، USA)
  5. الأدوات الجراحية
    1. Metzenbaum مقص، ملقط القزحية، الكامشات المشبك البلدغ، 10 ميكرولتر مع حقنة إبرة قياس 26 مشطوف، Bovie الكي عدة (البنك أدوات دقيقة، وشركة، ساراسوتا، FL، الولايات المتحدة الأمريكية)
    2. محرك صغروي الحفر (Stoelting، الخشب دايل، IL، الولايات المتحدة الأمريكية)
    3. 0،8 مم بر حفر الجولة (Roboz الجراحية الصك المحدودة، وشركة، غايثرسبيرغ، MD، الولايات المتحدة الأمريكية)
    4. STORZ بون خياطة الملقط (باوش ومب و، وشركة، روتشستر، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية)
  6. اللوازم الجراحية
    1. 3،0 النايلون خياطة (الواحة، Mettawa، IL، الولايات المتحدة الأمريكية)
    2. مسحات القطن، Puralube مرهم العين (فيشر العلمية، بتسبرغ، PA، الولايات المتحدة الأمريكية)
    3. نقاط جراحية وشرائح (مدترونيك Xomed، وشركة، جاكسونفيل، FL، الولايات المتحدة الأمريكية)
    4. كليبرز الشعر الكهربائية (اوستر، بروفيدانس، رود آيلند، الولايات المتحدة الأمريكية)
    المواد الكيميائية
    1. Endothelin-1 (الأمريكية الببتيد، سانيفيل، CA، الولايات المتحدة الأمريكية)
    2. الكلورهيكسيدين 2٪ (Agrilabs، وسانت جوزيف، MO، الولايات المتحدة الأمريكية)
  7. التصور معدات
    1. المجهر الجراحي (SEILER الصك وتصنيع؛ سانت لويس، MO، الولايات المتحدة الأمريكية)
    2. سوني هاندي كام HDR-SR12 (سوني، ميناتو، طوكيو، اليابان)
    3. إضاءة الألياف البصرية (TechniQuip شركة، ليفرمور، CA، الولايات المتحدة الأمريكية)
  8. قياس قطر السفينة
    1. VLC وسائل الاعلام لاعب (باريس، فرنسا)
    2. الصورة J البرمجيات (يماغيج 1.42q البرامج والمعاهد الامريكية الوطنية للصحة في بيثيسدا، MA، الولايات المتحدة الأمريكية)

1. خطوات ما قبل الجراحة

  1. قبل الجراحة، ويعيش الفئران تحت دائرة الضوء / الظلام 12:12 مع حرية الوصول إلى المياه والقوارض تشاو.
  2. هو فعل التخدير مع 4٪ isoflurane في 100٪ خليط الغاز O 2 في دائرة التعريفي.
  3. الغراب وحلق الرأس ن مع كليبرز الشعر الكهربائية.
  4. يتم وضع الفئران في وضعية الرقود على وسادة ماصة الكذب على سطح التشغيل التحكم في درجة حرارته (بطانية الحرارية) ويتم وضع الرأس في جهاز التجسيمي بدءا من وضع قناع الوجه الغاز مخدر.
  5. المقبل، يتم إدراج أشرطة الأذن وشددت.
  6. خلال إجراء التخدير يتم الاحتفاظ بنسبة 2٪ isoflurane في 100٪ خليط الغاز O 2.
  7. يتم تطبيق مرهم البصريات مواد التشحيم لكلتا العينين، والجفون مغلقة لمنع جفاف العين خلال العملية الجراحية.
  8. يتم إدراج التحقيق درجة حرارة الجسم الأساسية للحفاظ على درجة حرارة ثابتة الحيوانية من 37 ± 0.5 ° C.
  9. مع رئيس الفئران تخدير عقد بحزم في الجهاز التجسيمي منطقة العمليات الجراحية هو تطهير بالتناوب مع الكلورهيكسيدين والمالحة ثلاث مرات.

2. قبل الجمجمة نافذة إعداد

ontent "> قبل إنشاء نافذة الجمجمة، ينبغي إعداد الفئران عن أي تجارب من قبل غرس الأجهزة الأخرى المطلوبة ويجب أن يحصل أي إجراءات المطلوبة الجراحية. لهذا البروتوكول، لقد زرع في السابق قنية دليل لل1-endothelin (ET- 1) الناجم عن MCAO كما هو مبين في منشور بعنوان رفيق "Endothelin-1 المستحثة انسداد الشريان الدماغي الأوسط نموذج للالسكتة الدماغية مع التوجيه بالليزر Flowmetry دوبلر في الفئران."

3. إنشاء نافذة القحف

بعد وضع قنية دليل أو المعدات اللازمة لإجراء التجارب، وإنشاء إطار لتصور الجمجمة مباشرة القريب من أجزاء الشريان الدماغي الأوسط خلال إجراء السكتة الدماغية.

  1. أولا، يتم استخدام مقص لشق الجلد المغطي العضلات الصدغي بدءا إعلامي والعمل أفقيا.
  2. هو شطر العضلة الصدغية باستخدام كاو كهربي ثم تراجع استخدام النايلون لخياطة 3،0 visua ليز الجزء الحرشفية من العظم الصدغي.
  3. ويوجه ساحة حوالي 3-4 ملم على الجزء الحرشفية من العظم الصدغي الذيلية إلى المدار ومتفوقة على قاعدة من عملية الوجني كما أنه يعكس الخروج من العظم الصدغي.
  4. يتم استخدام الحفر لخفض تدريجيا قطعة المحددة من العظام خالية من العظم الصدغي. وينبغي الحرص على تجنب تطبيق الكثير من الضغط على الحفر لأنه من الممكن أن تضر أو ​​قشرة الدماغ الجافية.
  5. يتم تنفيذ يشطف متكررة مع ملحي معقم لتحسين التصور من مجال الجراحة ومنع ارتفاع درجة حرارة الجمجمة.
  6. بدءا من الزاوية الحرة، تتم إزالة بعناية قطعة من العظام باستخدام temoporal غرامة ملقط ذو أسنان الفئران في حين التأكد من عدم المسيل للدموع أي سفن المرتبطة الجافية.
  7. يتم ترك الجافية سليمة ويتم شطف بعيدا الحطام باستخدام ملحي معقم.

4. تسجيل انقباض الشريان الدماغي

يستخدم خيمة "> لشرح كيفية التقاط الصور في الوقت الحقيقي، والفئران التي تمر ET-1 يسببها MCAO لهذا البروتوكول.

  1. قبل تطبيق مركبات فعال في الأوعية، يجب تسجيل الفيديو الأساسية لما لا يقل عن 1 دقيقة. لET-1 MCAO يسببها، يتم تسجيل خط الأساس بمجرد خفض الإبرة في المخ ولكن لحمة قبل الحقن ET-1.
  2. بدء تشغيل مضخة للحقن حقنة وسجلت لمدة 1 ساعة أو حتى نقطة النهاية المرجوة. تبقى الإبرة في مكانها أثناء تسجيل الفيديو من أجل منع الاضطرابات من المستوى البؤري.
  3. يجب أن يكون الفأر تخدير عميق والموت الرحيم وفقا لبروتوكول افق بعد هذا الإجراء.

5. تحليل الصور

يمكن تحديد القطر السفينة عن أي جزء من تصور MCA. وكمثال على ذلك، سوف نستخدم فرع واحد من MCA لقياس قطر السفينة على نقطة في الوقت قبل وبعد حقن ET-1. الأمراض المنقولة جنسيايتم التقاط إطارات ليرة لبنانية من الفيديو على فترات حد أدنى 1 باستخدام VLC media player ل(VideoLAN).

  1. تم تثبيت VLC لاعب وفتح.
  2. من خلال اختيار أدوات ثم تفضيلات، يتم تغيير الإعداد إلى "جميع" تحت "إعدادات العرض."
  3. "قائمة الفيديو" يتم توسيع في شريط الجانب الأيسر و"وحدات الإخراج" ثم يتم توسيع. "فلاتر المشهد" لتحديد إظهار قائمة الفيديو مشهد التصفية.
  4. يتم كتابتها "المشهد" في خانة اسم الملف لالبادئة.
  5. يتم تعريف بادئة مسار الدليل. هذا هو المكان الذي يتم حفظ الإطارات يزال.
  6. يتم تحديد نسبة A التسجيل على أساس معدل المطلوب من إلتقاط يزال. وفي حال عدم القبض على الفيديو في 29 لقطة في الثانية، ثم "1749" (29 إطارات / ثانية × 60 ثانية / دقيقة) يمكن إدخالها في مربع لحفظ إطار واحد لا يزال كل دقيقة 1. ثم يتم حفظ جميع التغييرات.
  7. ثم يتم فتح شريط الفيديو المطلوب في مشغل VLC لانقاذ تلقائيا لا يزال الإطارات مرة كل دقيقة 1.
  8. ثم يتم قياس القطر باستخدام هذه السفينةالصور. أولا، يتم فتح برنامج يماغيج (NIH).
  9. ثم يتم فتح الأطر التي سوف تزال في قياس يماغيج.
  10. عن طريق اختيار "تحليل" القائمة، "تعيين القياسات" ثم يتم فتح جميع المربعات ودون رادع.
  11. المقبل، يتم تحديد أداة خط مستقيم.
  12. اختصار لوحة المفاتيح "السيطرة +" يستخدم لتكبير حسب الحاجة ويتم وضع خط عمودي على مسار السفينة لقياس قطر السفينة.
  13. وأخيرا، يتم الحصول على طول السفينة عن طريق اختيار "تحليل" القائمة ثم "التدبير" (CTRL + M) للحصول على طول السفينة.
  14. يتم تكرار هذه العملية على الأقل ثلاث مرات وبلغ متوسط ​​قياس لقياس كل سفينة في كل إطار يزال.
  15. وتطبيع قطر السفينة في كل نقطة من الوقت لخط الأساس قطر السفينة حتى يمكن إجراء المقارنات باستخدام الفئران متعددة. للقيام بذلك، استخدم الصيغة الحالية قطر / قطر × خط الأساس 100٪ لحساب قطر خط الأساس٪ من كل سفينة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

صور ثابتة مأخوذة من عرض الفيديو الملتقط أن التغيير في القطر الشريان الدماغي بعد ET-1 يمكن حقن تقديره بسهولة باستخدام هذه التقنية نافذة الجمجمة (الشكل 2). في غضون دقائق من حقن ET-1، سوف تبدأ في السفينة انقباض. في نهاية المطاف سوف تكون الأوعية الصعب تصور وأنسجة المخ سوف تصبح شاحبة. بعد حوالي 20 دقيقة وآثار ET-1 ويقلل السفن ستبدأ في تمدد، تعود تدريجيا إلى قطرها خط الأساس بعد حوالي 45 دقيقة. بالإضافة إلى تضيق الأوعية التي تحدث أكثر وضوحا، والسطح القشري يصبح أكثر شحوبا بعد تناوله ET-1. فمن الممكن لحساب التغير المطلق في قطر السفينة مع شبكاني المجهر معايرة اذا شئت. للمقارنة بين الفئران متعددة نحسب التغير النسبي في قطر السفينة التي تحدث أثناء إجراء. يتم تنفيذ هذه القياسات باستخدام يماغيج البرمجيات (NIH). ثم رسم بياني يمثل الرطوبةيمكن للتغيرات في القطر السفينة اطر النسبية بمرور الوقت ثم يتم بناؤها (الشكل 3).

الشكل 1
الشكل 1. الرسم التخطيطي لموقع قطع القحف الزمنية. يصور هذا الرسم البياني تشريح الهيكل العظمي للجمجمة الفئران مع التوجه الأمامي إلى اليسار. العضلة الصدغية لديه أصله على طول حافة الجمجمة الجانبي. يجب فصل هذه العضلة من هذه التلال وشطر من أجل رؤية الجزء الحرشفية من العظم الصدغي. لا يمكن أن يؤديها على قطع القحف حوالي 3-4 مم في هذا الموقع الخلفي فقط إلى المدار ومتفوقة على قاعدة من عملية الوجني كما أنه يعكس الخروج من العظم الصدغي. أشار موقع سهم كبير لأداء قطع القحف. الأسهم تشير إلى 3 صغيرة MCA وفروعها. جميع الشرايين وسوف يكون في هذا الموقع ويمكن تمييز فروع MCA والشرايين من الأوردة من قبل كل من المظهر غير متعرجة والحساسية للمركبات فعال في الأوعية.

الشكل 2
الشكل 2. نافذة الجمجمة قبل الحقن ET-1، بعد الحقن ET-1، وبعد ضخه. بدءا من اليسار، يظهر صورة ممثل فروع MCA كما تراه من خلال نافذة في الجمجمة. ويمكن تحديد الشرايين من التشكل بهم. وMCA مستقيم نسبيا يدخل مجال في أسفل اليسار ولها نقطة واحدة فرع رئيسي في هذه الصورة. سفن أخرى في هذه الصور هي أوردة المخ والتي يمكن تحديدها من قبل لهجة أكثر عمقا ومظهرها متعرجة. وخلال الشرايين انسداد انقباض بسرعة والأنسجة سوف تصبح شاحبة. ببطء، سوف تمدد الشريان والعودة إلى قطر خط الأساس.

رقيقة الصفحة = "دائما"> الشكل 3
الشكل 3. ويمكن حساب ممثل قطر السفينة مع مرور الوقت ليبلغ قطرها واحد خط الأساس الفئران. النسبة مع مرور الوقت باستخدام صيغة بسيطة، قطر الحالي / خط الأساس قطر × 100٪. ويمكن أن يتم هذا مع أي عنصر فعال في الأوعية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وباختصار، هذه النافذة إعداد الجمجمة تقنية متعددة جدا ويمكن تغييره لتلبية احتياجات العديد من التجارب مع تعديلات طفيفة 4، 5. على سبيل المثال، رصد نجحنا تدفق الدم الدماغي في فروع محددة باستخدام الليزر MCA دوبلر flowmetry التركيز مباشرة على الشريان الدماغي تصور من خلال نافذة الجمجمة (مكة AP 2009 و 2011). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام مستحضر مماثلة مع قطعي الجافية مع إدارة موضعي فعال في الأوعية المركبات لخلق تفاعل الجسم الحي في حمام الأوعية الدموية 3. ينبغي أن تؤخذ عدة عوامل بعين الاعتبار عند إعداد إطار الجمجمة من أجل تقليل نسبة الفشل لهذه التقنية. ترتبط العديد من هذه العوامل إلى الحصول على التصور الجيد الشرايين الدماغية. أولا، لا بد من توخي الحذر عند إنشاء قطع القحف حتى لا تتعطل الأوعية الدموية دورا أو المغطي مع لقمة الحفر. ويتم إنجاز هذا أفضلمن يغسل متكررة مع ملحي معقم لازالة الانقاض وتبريد الجمجمة. ثانيا، ينبغي رفع جزء العظام بلطف عندما يتم إزالته. إذا كان جزء لا سحب بعيدا بسهولة، وينبغي بعد ذلك أن تستخدم لقمة الحفر إلى قطع أكثر العظام. وأخيرا، يمكن أن كميات صغيرة من الدم أو السائل النخاعي تغيير مظهر بسهولة من النافذة الجمجمة أثناء هذا الإجراء. وقطع القحف إجراء يوفر فتحة في الجمجمة أكبر من التصور اللازم ل. ولذلك، فمن السهل أن تضع الإسفنج ماصة عدة تعتمد في جزء من الموقع الجراحية لمنع تراكم السوائل من. يمكن تغيير هذه الإسفنج حسب الحاجة إذا تم استخدام الحرص على عدم عرقلة الإطار مع الأدوات الجراحية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من أمريكا انضم جمعية القلب جنوب شرق الكبرى (09GRNT2060421)، الجمعية الطبية الأمريكية، ومن جامعة العلوم السريرية ومعهد فلوريدا بالحركة. آدم مكة هو زميل NRSA NIH / NINDS، predoctoral (NS-F30 060335). تلقى روبرت Regenhardt predoctoral الدعم زمالة من جامعة فلوريدا برنامج التدريب المتعدد التخصصات في ارتفاع ضغط الدم (HL-T32 083810).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inhalation anesthesia system VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA 901806
Isoflurane anesthetic Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA 1001936060
Small animal stereotaxic system David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA 900
Non-rupture ear bars, rat David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA 957
Rat gas anesthesia head holder David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA 1929
BAT-12 microprobe thermometer World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA BAT-12
T/PUMP, Thermal blanket Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA T/PUMP, TP600
Metzenbaum Scissors World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA 501254
Iris forceps World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA 15915
Bulldog clamp retractors World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA 14119-G
10 μl syringe 26-gaugue World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA SGE010RNS
Bovie, high temperature cautery kit World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA 500392
Rat tooth forceps 0.12 Stotz E1811
Micromotor drill Stoelting, Wood Dale, IL, USA 51449
0.8 mm round drill bur Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA RS-6280C-1
STORZ Bonn suturing forceps Bausch and Lomb, Inc., Rochester, NY, USA
Nylon Suture, size 3.0 Oasis, Mettawa, IL, USA MV-663
Cotton swabs Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 22-029-488
Puralube eye ointment Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA NC0138063
Electric hair clippers Oster, Providence, RI, USA 78005-301
ET-1 diluted to 80 μM concentration in PBS American Peptide, Sunnyvale, CA, USA 88-1-10A
Chlorhexidine, 2% Agrilabs, St. Joseph, MO, USA 1040, Rev. 6-06, NAC No.: 10580322
Surgical microscope Seiler Instrument and Manufacturing, St. Louis, MO, USA Evolution xR6
Sony Handycam Sony, Minato, Tokyo, Japan HDR-SR12
Fiber optic illuminator TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA FO1–150
VLC media Player (Paris, France)
Image J software U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Levasseur, J. E., Wei, E. P., Raper, A. J., Kontos, A. A., Patterson, J. L. Detailed description of a cranial window technique for acute and chronic experiments. Stroke. 6, 308-317 (1975).
  2. Baumbach, G. L., Dobrin, P. B., Hart, M. N., Heistad, D. D. Mechanics of cerebral arterioles in hypertensive rats. Circ. Res. 62, 56-64 (1988).
  3. Regrigny, O., et al. Effects of melatonin on rat pial arteriolar diameter in vivo. Br. J. Pharmacol. 127, 1666-1670 (1999).
  4. Mecca, A. P., O'Connor, T. E., Katovich, M. J., Sumners, C. Candesartan pretreatment is cerebroprotective in a rat model of endothelin-1-induced middle cerebral artery occlusion. Exp. Physiol. 94, 937-946 (2009).
  5. Mecca, A. P., et al. Cerebroprotection by angiotensin-(1-7) in endothelin-1-induced ischaemic stroke. Exp. Physiol. 96, 1084-1096 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics