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Utilizzando una finestra craniale per visualizzare l'arteria cerebrale media Durante endotelina-1 indotta da occlusione dell'arteria cerebrale media

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Summary

Questo articolo descrive un metodo per la visualizzazione delle arterie cerebrali di ratto attraverso una finestra craniale utilizzando craniotomia temporale per visualizzare porzioni prossimale dell'arteria cerebrale media (

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Regenhardt, R. W., Ansari, S., Azari, H., Caldwell, K. J., Mecca, A. P. Utilizing a Cranial Window to Visualize the Middle Cerebral Artery During Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion. J. Vis. Exp. (72), e50015, doi:10.3791/50015 (2013).

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Abstract

Creazione di una finestra craniale è un metodo che permette la visualizzazione diretta delle strutture sulla superficie corticale del cervello 1-3. Questa tecnica può essere eseguita in molti luoghi sovrastanti il ​​cervello di ratto, ma è più facilmente effettuata creando una craniectomia sulle ossa facilmente accessibili frontale o parietale. Più frequentemente, abbiamo utilizzato questa tecnica in combinazione con il modello di endotelina-1 occlusione dell'arteria cerebrale media di ictus ischemico per quantificare le variazioni mezzo diametro dell'arteria cerebrale vaso che si verificano con l'iniezione di endotelina-1 nel parenchima cerebrale adiacente al prossimale MCA 4, 5. Per visualizzare la porzione prossimale del MCA durante dell'endotelina -1 indotta MCAO, si usa una tecnica per creare una finestra craniale attraverso l'osso temporale sulla faccia laterale del cranio ratto (Figura 1). Arterie cerebrali può essere visualizzata sia con la dura intatto o con l'inciso dura e RetraCTED. Più comunemente, lasciamo la dura intatto durante la visualizzazione dal endotelina-1 indotta MCAO prevede la consegna del peptide vasocostrittori nel parenchima cerebrale. Questo evita la necessità di incidere la dura direttamente sulle navi visualizzati per il drug delivery. Questo protocollo descrive come creare una finestra del cranio per visualizzare le arterie cerebrali in un modo graduale, così come il modo di evitare molti dei potenziali rischi relativi a questo metodo.

Protocol

Questo protocollo è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso (IACUC) presso l'Università della Florida, ed è in conformità con la "Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio" (ottava edizione, Accademia Nazionale delle Scienze, 2011).

Materiale

  1. Animali: otto settimane di età, di sesso maschile, Sprague Dawley (Charles River, Farms Wilmington, MA, USA) del peso di 250-300 g al momento dell'intervento chirurgico.
  2. Anestesia
    1. Inalazione sistema di anestesia (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA)
    2. Isoflurano anestetico (Farmaceutici Baxter, Deerfield, IL, USA)
  3. Stereotassico sistema (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA)
    1. Piccolo animale sistema stereotassico
    2. Non rottura orecchio barre per i ratti
    3. Gas testa porta l'anestesia per i ratti
  4. Regolazione della temperatura
    1. BAT-12 Termometro microsonda (Il MondoPrecision Instruments, Inc., Sarasota, FL, Stati Uniti d'America)
    2. T / POMPA, TP600 coperta termica (Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, Stati Uniti d'America)
  5. Strumenti chirurgici
    1. Forbici Metzenbaum, iris forcipe, bulldog clamp divaricatori, siringa da 10 ml con 26 gauge smussato, Bovie cauterizzazione kit (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, Stati Uniti d'America)
    2. Micromotore trapano (Stoelting, Wood Dale, IL, USA)
    3. 0,8 millimetri rotonda trapano fresa (Roboz chirurgico Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA)
    4. STORZ Bonn sutura Pinze (Bausch & Lomb, Inc., Rochester, NY, USA)
  6. Forniture chirurgiche
    1. 3,0 nylon sutura (Oasis, Mettawa, IL, USA)
    2. Tamponi di cotone, unguento oculare Puralube (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA)
    3. Punti chirurgici e strisce (Medtronic Xomed, Inc., Jacksonville, FL, Stati Uniti d'America)
    4. Tosatrici elettriche (Oster, Providence, RI, USA)
    Prodotti chimici
    1. L'endotelina-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, USA)
    2. Clorexidina al 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, USA)
  7. Visualizzazione Attrezzature
    1. Microscopio chirurgico (Strumento Seiler e Manufacturing, St. Louis, MO, USA)
    2. Sony Handycam HDR-SR12 (Sony, Minato, Tokyo, Giappone)
    3. Fibra ottica illuminatore (TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA)
  8. Misurazione del diametro del vaso
    1. VLC media player (Parigi, Francia)
    2. Image J software (ImageJ 1.42q software, US National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA)

1. Pre-chirurgiche Steps

  1. Prima dell'intervento, i topi sono alloggiati sotto una 12:12 ciclo luce / buio con libero accesso all'acqua e roditori chow.
  2. Anestesia viene indotta con 4% isoflurano in 100% O 2 miscela di gas in una camera di induzione.
  3. Il corvo n della testa è rasata con tosatrici elettriche.
  4. Il ratto viene posto in posizione prona su un tampone assorbente sdraiata su una temperatura controllata superficie operativa (coperta termica) e la testa viene posta nell'apparecchio stereotassico partire posizionamento della maschera frontale del gas anestetico.
  5. Successivamente, le barre auricolari sono inseriti e serrati.
  6. Durante la procedura di anestesia viene mantenuta con isofluorano 2% in 100% O 2 miscela di gas.
  7. Pomata oftalmica lubrificante viene applicato a entrambi gli occhi, e le palpebre sono chiuse per prevenire l'essiccamento occhio durante la procedura chirurgica.
  8. Una sonda di temperatura rettale è inserito per mantenere una temperatura interna costante di 37 animali ± 0,5 ° C.
  9. Con la testa del ratto anestetizzato tenuto saldamente nel dispositivo stereotassico l'area chirurgica è purificato con alternanza di clorexidina e soluzione salina tre volte.

2. Pre-cranica finestra Preparazione

ONTENUTO "> Prima di creare una finestra del cranio, il ratto deve essere preparato per degli esperimenti con l'impianto di altro hardware richiesto e devono ricevere tutte le procedure chirurgici necessari. Per questo protocollo, abbiamo precedentemente impiantato una cannula guida per l'endotelina-1 (ET- 1) indotta MCAO come indicato in una pubblicazione compagno dal titolo "L'endotelina-1 indotta cerebrale media modello occlusione dell'arteria per l'ictus ischemico con guida laser flussimetria Doppler nel ratto."

3. Creazione della finestra del cranio

Dopo il posizionamento di una cannula guida o attrezzature necessarie per la sperimentazione, una finestra craniale viene creato per visualizzare direttamente porzioni prossimale dell'arteria cerebrale media durante una procedura di ictus.

  1. Primo, forbici sono utilizzati per incidere la pelle sovrastante il muscolo temporale iniziale medialmente e lateralmente lavoro.
  2. Il muscolo temporale è diviso in due con elettrocauterizzazione e poi ritratta con 3,0 sutura in nylon per Visua Lize la parte squamosa dell'osso temporale.
  3. Un quadrato di circa 3-4 millimetri è tracciata sulla porzione squamosa del temporale caudale all'orbita e superiore alla base del processo zigomatico quanto riflette dell'osso temporale.
  4. Un trapano è usato per ridurre gradualmente il pezzo di osso tratteggiata libera dal osso temporale. Si deve prestare attenzione per evitare di applicare una pressione eccessiva per il trapano in quanto è possibile danneggiare la dura o corteccia cerebrale.
  5. Frequenti lavaggi con soluzione fisiologica sterile vengono eseguite per migliorare la visualizzazione del campo chirurgico e prevenire il surriscaldamento del cranio.
  6. A partire da un angolo libero, il pezzo di osso temoporal viene accuratamente rimosso con fini rat-denti pinza facendo attenzione a non strappare le navi connessi con la dura madre.
  7. La durata è lasciata intatta e detriti è sciacquato con soluzione fisiologica sterile.

4. Registrazione di costrizione dell'arteria cerebrale

tenda "> Per dimostrare come per catturare le immagini in tempo reale, un topo che è in fase di ET-1 indotta MCAO viene utilizzato per questo protocollo.

  1. Prima dell'applicazione di composti vasoattivi, un video baseline dovrebbe essere registrata per almeno 1 min. Per ET-1 indotta MCAO, la registrazione di base è fatta una volta che l'ago è stato abbassato nel parenchima cerebrale ma prima della ET-1 iniezione.
  2. La pompa a siringa per iniezione viene avviato e registrato per 1 ora o fino al punto finale desiderato. L'ago rimane in posizione durante la registrazione video per evitare perturbazioni del piano focale.
  3. Il ratto dovrebbe essere profondamente anestetizzati e l'eutanasia secondo un protocollo approvato seguendo questa procedura.

5. Image Analysis

Diametro del vaso può essere determinato per ogni parte del MCA visualizzato. A titolo di esempio, useremo un ramo della MCA per misurare il diametro nave al momento punti prima e dopo ET-1 iniezione. Still frame dal video vengono acquisiti a intervalli di 1 minuto utilizzando VLC media player (VideoLAN).

  1. VLC Player è installato e aperto.
  2. Selezionando strumenti e quindi le preferenze, l'impostazione viene modificata in "All" in "Mostra impostazioni".
  3. Il menu "video" si espande nella barra laterale di sinistra e "moduli di uscita" viene ampliato. "Filtri Scene" è stato selezionato per far apparire il menu filtro video scena.
  4. "Scena" viene digitato nella casella per il prefisso del nome file.
  5. Un prefisso percorso di directory è definito. Questo è dove ancora fotogrammi vengono salvati.
  6. Un rapporto di registrazione è selezionata sulla base del tasso desiderato di ancora cattura frame. Se un video è stato catturato a 29 fotogrammi al secondo, quindi "1749" (29 fotogrammi / sec x 60 sec / min) deve essere immesso nella casella di salvare un fermo fotogramma ogni 1 min. Tutte le modifiche vengono salvate.
  7. Il video desiderato viene quindi aperto in VLC per salvare automaticamente i fotogrammi una volta ogni min 1.
  8. Diametro del vaso viene quindi misurata con questiimmagini. Primo, software ImageJ (NIH) è aperto.
  9. Poi le immagini fisse che si misurano sono aperte in ImageJ.
  10. Selezionando il menu "analizzare", "impostare misure" è quindi aperto e tutte le caselle siano deselezionate.
  11. Successivamente, lo strumento linea retta è selezionata.
  12. La scorciatoia da tastiera "Ctrl +" viene utilizzato per ingrandire, se necessario e una linea è posto perpendicolare al percorso nave per misurare diametro del vaso.
  13. Infine, lunghezza della nave è ottenuta selezionando il menu "analizzare" e "misura" (ctrl + M) per ottenere lunghezza della nave.
  14. Questo processo viene ripetuto almeno tre volte e in media per ogni nave misurata misurata in ogni fermo.
  15. Diametro del vaso in ogni punto temporale è normalizzato al diametro del vaso di riferimento in modo che il confronto può essere effettuato utilizzando ratti multipli. Per effettuare questa operazione, utilizzare l'attuale formula di diametro / diametro di base x 100% per calcolare il diametro di base% di ogni nave.

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Representative Results

Ancora immagini prese dal video catturato che mostra la modifica del diametro dell'arteria cerebrale dopo ET-1 iniezione può essere facilmente apprezzato usando questa tecnica cranica finestra (Figura 2). In pochi minuti di ET-1 iniezione, la nave inizierà a costrizione. Alla fine le navi sarà difficile da visualizzare e il tessuto cerebrale diventa pallido. Dopo circa 20 minuti gli effetti di ET-1 diminuirà e le navi inizieranno a dilatarsi, gradualmente ritornando al diametro basale dopo circa 45 min. Oltre alla vasocostrizione più evidente che si verifica, la superficie corticale diventa più chiara dopo somministrazione ET-1. È possibile calcolare la variazione assoluta diametro del vaso con un microscopio reticolo calibrato se desiderato. Per confronto tra ratti più si calcola la variazione relativa di diametro del vaso che si verifica durante una procedura. Queste misurazioni sono eseguite utilizzando il software ImageJ (NIH). Poi un grafico che rappresenta il relcambiamenti di diametro ativi vaso nel tempo può quindi essere costruito (Figura 3).

Figura 1
Figura 1. Schema della posizione dei craniectomia temporale. Questo schema rappresenta l'anatomia scheletrica del cranio ratto con orientato anteriore verso sinistra. Il muscolo temporale ha la sua origine lungo il crinale laterale del cranio. Questo muscolo deve essere staccato da questa cresta e attraversata per visualizzare la porzione squamosa dell'osso temporale. Un craniectomia circa 3-4 millimetri può essere eseguita in questa posizione appena posteriormente l'orbita e superiore alla base del processo zigomatico quanto riflette dell'osso temporale. La freccia grande indica la posizione per eseguire la craniotomia. Le 3 piccole frecce indicano la MCA e le sue filiali. Tutte le arteriein questa posizione sarà rami della MCA e arterie possono essere distinte da vene sia la loro non tortuoso aspetto e sensibilità ai composti vasoattivi.

Figura 2
Figura 2. Finestra cranica prima iniezione ET-1, ET-1 dopo l'iniezione, e dopo la riperfusione. Partendo sinistra, un'immagine rappresentativa di rami MCA come visto attraverso una finestra craniale viene mostrata. Arterie possono essere identificati dalla loro morfologia. La relativamente semplice MCA entra nel campo in basso a sinistra ed è un punto importante filiale in questa immagine. Altre navi in ​​queste immagini sono le vene cerebrali che possono essere identificati dal loro tono più profondo e l'aspetto tortuoso. Durante occlusione delle arterie si restringono rapidamente e il tessuto diventa pallido. Lentamente, l'arteria si dilata e tornare al diametro di base.


Figura 3. Diametro del vaso rappresentativo nel tempo per un singolo topo. Percent diametro basale può essere calcolato nel tempo utilizzando la semplice formula, diametro corrente / basale diametro x 100%. Questo può essere fatto con qualsiasi composto vasoattivo.

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Discussion

In sintesi, questa tecnica di preparazione cranica finestra è molto versatile in quanto può essere modificato per soddisfare le esigenze di molti esperimenti con piccole modifiche 4, 5. Per esempio, siamo riusciti a monitorare il flusso ematico cerebrale in specifici rami MCA con laser doppler flussimetria di concentrarsi direttamente su un'arteria cerebrale visualizzata attraverso una finestra cranica (Mecca AP 2009 e il 2011). Inoltre, una preparazione simile con l'inciso dura può essere utilizzato con la somministrazione topica dei composti vasoattivi per creare un bagno in vivo reattività vascolare 3. Diversi fattori devono essere presi in considerazione quando si prepara una finestra craniale per diminuire il tasso di fallimento per questa tecnica. Molti di questi fattori sono correlati ad ottenere una buona visualizzazione delle arterie cerebrali. In primo luogo, è necessario prestare attenzione quando si crea il craniectomia in modo che i vasi della dura o di sangue sovrastanti non sono interrotti con la punta del trapano. Questo si realizza meglioda frequenti lavaggi con soluzione salina sterile per eliminare i detriti e raffreddare il cranio. Secondo, il frammento osseo deve essere sollevata leggermente quando viene rimosso. Se il frammento non tira via facilmente, quindi la punta deve essere utilizzato per tagliare più osso. Infine, piccole quantità di sangue o CSF ​​può facilmente alterare l'aspetto della finestra cranica durante questa procedura. Il craniectomia eseguito fornisce un'apertura nel cranio che è più grande di quanto richiesto per la visualizzazione. Pertanto, è facile da posizionare diverse spugne assorbenti nella porzione dipendente del sito chirurgico per impedire l'accumulo di fluido. Queste spugne possono essere modificate come necessario se la cura viene utilizzato non ostruire la finestra con strumenti chirurgici.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal American Heart Association Greater Affiliato Sud-Est (09GRNT2060421), l'American Medical Association, e presso l'Università della Florida clinica e traslazionale Science Institute. Adam Mecca è un NIH / NINDS, compagno NRSA predoctoral (F30 NS-060335). Robert Regenhardt ricevuto il sostegno predoctoral borsa di studio presso l'Università di programma di formazione multidisciplinare in Florida Ipertensione (T32 HL-083810).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inhalation anesthesia system VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA 901806
Isoflurane anesthetic Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA 1001936060
Small animal stereotaxic system David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA 900
Non-rupture ear bars, rat David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA 957
Rat gas anesthesia head holder David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA 1929
BAT-12 microprobe thermometer World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA BAT-12
T/PUMP, Thermal blanket Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA T/PUMP, TP600
Metzenbaum Scissors World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA 501254
Iris forceps World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA 15915
Bulldog clamp retractors World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA 14119-G
10 μl syringe 26-gaugue World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA SGE010RNS
Bovie, high temperature cautery kit World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA 500392
Rat tooth forceps 0.12 Stotz E1811
Micromotor drill Stoelting, Wood Dale, IL, USA 51449
0.8 mm round drill bur Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA RS-6280C-1
STORZ Bonn suturing forceps Bausch and Lomb, Inc., Rochester, NY, USA
Nylon Suture, size 3.0 Oasis, Mettawa, IL, USA MV-663
Cotton swabs Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA 22-029-488
Puralube eye ointment Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA NC0138063
Electric hair clippers Oster, Providence, RI, USA 78005-301
ET-1 diluted to 80 μM concentration in PBS American Peptide, Sunnyvale, CA, USA 88-1-10A
Chlorhexidine, 2% Agrilabs, St. Joseph, MO, USA 1040, Rev. 6-06, NAC No.: 10580322
Surgical microscope Seiler Instrument and Manufacturing, St. Louis, MO, USA Evolution xR6
Sony Handycam Sony, Minato, Tokyo, Japan HDR-SR12
Fiber optic illuminator TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA FO1–150
VLC media Player (Paris, France)
Image J software U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA

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References

  1. Levasseur, J. E., Wei, E. P., Raper, A. J., Kontos, A. A., Patterson, J. L. Detailed description of a cranial window technique for acute and chronic experiments. Stroke. 6, 308-317 (1975).
  2. Baumbach, G. L., Dobrin, P. B., Hart, M. N., Heistad, D. D. Mechanics of cerebral arterioles in hypertensive rats. Circ. Res. 62, 56-64 (1988).
  3. Regrigny, O., et al. Effects of melatonin on rat pial arteriolar diameter in vivo. Br. J. Pharmacol. 127, 1666-1670 (1999).
  4. Mecca, A. P., O'Connor, T. E., Katovich, M. J., Sumners, C. Candesartan pretreatment is cerebroprotective in a rat model of endothelin-1-induced middle cerebral artery occlusion. Exp. Physiol. 94, 937-946 (2009).
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