איתור של palmitoylation חלבון בנוירונים ביפוקמפוס מתורבתים ידי immunoprecipitation וacyl-Exchange ביוטין (אייב)

Neuroscience
 

Summary

בנוסף ההפיך של Palmitate לחלבונים הוא רגולטור חשוב של סחר בחלבונים תאי. זו היא עניין מיוחד בתאי עצב שבו חלבונים סינפטיים רבים palmitoylated. אנו משתמשים בשיטה ביוכימית פשוטה לזהות חלבונים בתאי עצב בתרבית palmitoylated, שניתן להתאים למספר רבים של סוגי תאים ורקמות.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Brigidi, G. S., Bamji, S. X. Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE). J. Vis. Exp. (72), e50031, doi:10.3791/50031 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Palmitoylation הוא שינוי שומנים שלאחר translational לערב את הקובץ המצורף של חומצת 16-פחם רווי שומן, Palmitate, לשאריות ציסטאין של חלבונים באמצעות מצע רופף thioester אג"ח [סקר ב1]. Palmitoylation של חלבון מצע מגדיל hydrophobicity, ובדרך כלל מאפשר הסחר שלה לכיוון קרום תא. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו palmitoylation להיות אחד שינויי השומנים הנפוצים ביותר בתאי העצב 1, 2, טוען כי מחזור Palmitate הוא מנגנון חשוב שבו תאים אלה להסדיר את המיקוד ואת הסחר של חלבונים. זיהוי והאיתור של מצעי palmitoylated לכן יכולים לשפר את ההבנה שלנו של סחר בחלבון בתאי עצב.

איתור של palmitoylation חלבון בעבר כבר הפריע מבחינה טכנית עקב חוסר הסכמה בין רצף חלבוני מצע, וההסתמכות על labeli מטבוליתng של Palmitoyl-חלבונים עם 3 H-Palmitate, assay יוכימי זמן רב עם רגישות נמוכה. פיתוח של assay acyl-Exchange ביוטין (אייב) מאפשר זיהוי מהיר ורגישות גבוה יותר של חלבוני palmitoylated 2-4, והוא אופטימלי למדידת התחלופה הדינמית של Palmitate על חלבונים עצביים. Assay אייב מורכב משלושה צעדים ביוכימיים (איור 1): 1) בלתי הפיך מצור של קבוצות thiol ציסטאין ללא שינוי באמצעות N-ethylmaliemide (nem), 2) מחשוף ספציפי והסרת מסכות קבוצת thiol של ציסטאין palmitoylated ידי hydroxylamine (שינקין), ו 3) תיוג סלקטיבית של ציסטאין palmitoylated באמצעות ריאגנט biotinylation thiol-reactive, ביוטין-BMCC. טיהור של חלבוני thiol-biotinylated בעקבות הצעדים שלאייב שונה, בהתאם למטרה הכללית של הניסוי.

כאן, אנו מתארים שיטה לטיהור חלבון palmitoylated עניין בhippocamp העיקריהנוירונים al ידי immunoprecipitation ראשוני (IP) צעד באמצעות נוגדן המכוון נגד החלבון, ואחרי בדיקת אייב והמערבי סופגים ישירות כדי למדוד את רמות palmitoylation של חלבון, הנקרא בדיקת ה-IP-ABE. תרבויות בצפיפות הנמוכה של נוירונים ביפוקמפוס עכברוש העובריים היו בשימוש נרחב כדי ללמוד את הלוקליזציה, פונקציה, וסחר בחלבונים עצביים, מה שהופך אותם אידיאלי ללימוד palmitoylation חלבון העצבי באמצעות בדיקת ה-IP-ABE. בדיקת ה-IP-ABE בעיקר דורשת IP סטנדרטי וריאגנטים מוחים מערביים, ומוגבל רק על ידי הזמינות של נוגדנים נגד מצע היעד. assay זה יכול בקלות להיות מותאם לטיהור והגילוי של חלבונים בתרבויות palmitoylated transfected Heterologous סלולריים, תרבויות העצביות עיקריות הנגזרות מרקמות מוח השונות של עכבר והן את העכברוש, ורקמת מוח אפילו עיקרית עצמו.

Protocol

1. מיצוי של חלבון מטרה מנוירונים ביפוקמפוס ראשוניים מתורבתים

  1. לפני קציר חלבון אנדוגני מתאים ביפוקמפוס עיקריים, להכין מאגר תמוגה (LB; טבלת 1) עם מעכבי פרוטאז. עד 10 מ"ל של חיץ תמוגה, להוסיף פתרון 0.1 מ"ל phenylmethanesulfonyl פלואוריד (PMSF) לריכוז סופי של 10 מ"מימ, ולהוסיף לוח קוקטייל מעכב פרוטאז 1.
  2. הכן N-ethylmaleimide (nem) פתרון (טבלה 1) מאבקת lyophilized. מתמוסס בעדינות EtOH 100% בטמפרטורת חדר (RT). תמיד להכין תמיסה טרייה ליום של ניסוי nem.
  3. הבא לשלב חיץ תמוגה וnem. הוסף 0.5 מ"ל של פתרון nem 2M לצינור טרי 50 מיליליטר חרוטים. הוסף LB 20 מ"ל מעל הראש, ומהר LB המקום + nem (ריכוז סופי של 50 מ"מימ) על פלטפורמת נדנדה ב 4 ° C כדי לערבב באופן מלא למשך 5 דקות. תמיד להוסיף פתרון השנייה ראשונה וLB nem / EtOH, כדי לערבב 2 כמו שצריך.
  4. הסר נוירונים בתרבית מהחממה ומקום על * קרח. בעדינות להסיר תקשורת הסלולרית, ולשטוף בעדינות פעמים עם פוספט הקר נאגר מלוח (PBS) 1x. הוסף 300 מ"ל של LB + nem 50mm לבאר הראשונה של נוירונים ביפוקמפוס, ותאי סריטות באמצעות מרים תא פנוי. איסוף lysate התא, ואז לפרוק את lysate לתוך הבאר הבאה של אותה הקבוצה. לגרד תאים בתוך 2 גם באמצעות מרים התא, לאסוף, ולחזור להשתמש גם שלישי, אם יש צורך להתרכז lysate נוסף.
  5. איסוף lysate תא לטרום מקורר (על קרח), צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. חזור על השלב 1.4 באמצעות 100 μl של LB + nem 50mm לאסוף כל lysate תא נותר. תעבור lysate תא סך דרך מזרק מד 26 ½ 5-6 פעמים כדי לסייע בתמוגה מכאנית, נזהר שלא לפוצץ בועות לפתרון. אחד במקום יכול sonicate עבור 15 שניות על קרח, אם ציוד זמין. Nutate lysate תא ל≥ 30 דקות ב 4 ° C.
  6. להבהיר את ליסה התאטה ידי צנטריפוגה XG ב 16000/30 דקות, כדי תאי גלולה בלתי lysed חומר ניקוי וחומר מסיס.
  7. האיסוף פינה lysate תא (supernatant) בצינור חדש מראש מקורר 1.5 מ"ל על קרח. חזור על פרוטוקול קציר לכל הקבוצות של תאים. ריכוז חלבון במידה כל דגימות lysate באמצעות BCA assay, ולנרמל את עוצמת הקול של כל דגימות lysate מקבוצות של תאים יש חלבון כולל שווה בדיוק, עם מינימום מומלץ של 500 מיקרוגרם. למעלה כל הדגימות עם LB + nem 50mm לסך הנפח 500 μl.
  8. הוסף 1-5 מיקרוגרם של נוגדן ראשוני נגד חלבון המטרה לכל אחת ממדגם lysate. Nutate דגימות נוגדנים lysate המעורבות הלילה ב 4 ° C.

* נוירונים ביפוקמפוס עכברוש ראשוניים צריכים להיות מתורבתים בצפיפות של כ 250.000 תאים / היטב בצלחת 6-ובכן, בתקשורת סרום נטולה המכילה תוסף B27 עצבי, כפי שתואר לעיל 5, וגדל לתשוקהאורך ד של זמן, בדרך כלל 14-16 ימים, במבחנה (DIV) כדי להשיג בגרות. מינימום של 500 מיקרוגרם של חלבון כולל מומלץ immunoprecipitate הצלחה וbiotinylate חלבון עצבי יעד, אשר בדרך כלל דורש 2-3 בארות של צלחת 6-כן.

2. משקעים של חלבון מטרת נוגדן בכריכה

  1. לפני החשתי ולשתק חלבון המטרה, להתכונן סלארי 50% מחלבון A או חרוזי sepharose, חלבון ה-G-מצופים. באופן ספציפי, להוסיף ≥ 60 μl של חרוזי sepharose לדגימה לצינורות 1.5 מ"ל, ולהבטיח כי כל הדגימות יש כמויות שווות של חרוזים. חרוזים מגנטיים מתאימים גם אם הציוד זמין.
  2. הוסף נפח שווה של תרחיף 50% לכל דגימת הנוגדנים lysate, וnutate ל≥ 1 שעה ב 4 ° C.

3. Acyl-Exchange ביוטין: מחשוף hydroxylamine (שינקין)

  1. בעת ביצוע שלב 2.2, להכין מספר הצינורות עם חיץ תמוגה (LB) של דיPHS fferent. PH הוא חשוב מאוד לשלבים הבאים ותמיד צריך להיות מותאם משתמש במד pH. הכן 2 מ"ל של pH 7.2 LB לדגימה, ו0.5 מ"ל של הצפה מחמירה לפי מדגם (טבלה 1). גם להכין LB ​​מ"ל 0.5 + nem 10mm לדגימה, כמו בשלבים 1.1-1.3. הוסף טבליות מעכב פרוטאז PMSF ולכל מאגרי תמוגה, כמו בשלב 1.1.
    1. Hydroxylamine (שינקין) הוא סוכן עצמת צמצום, מחשוף שמPalmitate מcysteines נדרש לbiotinylation (איור 1), והמחדל של מחשוף HAM משמש כשליטה שלילית. פיצול כל דגימה של חרוזים לשתי דגימות, אחד השמטת צעד המחשוף HAM (-HAM), ואחד כולל את צעד HAM (+ HAM). כדי לנרמל לפירוק חלבונים הנגרם על ידי טיפול שינקין, אחד צריך לפצל כל דגימה לשלישים, עם 1/3 מהחרוזים המשמשים לבקרת HAM-, ונותרו 2/3 המשמשים לטיפול HAM +.
    2. הכן 1 נוסף.5 צינורות מ"ל על קרח, שכותרתו שליטת HAM-עבור כל מדגם. בעקבות צעד 2.2, עדינות סרכזת חרוזים של כל הדגימות בדקות XG 0.5 / 1 ב 4 ° C (צנטריפוגה במהירות זו, משך זמן, וטמפרטורה לכל יתר השלבים, אלא אם כן צוין אחר), הנח את הצינורות על קרח, להסיר את supernatant, ו מחדש להשעות את החרוזים ב600 μl של LB + nem 10mm.
  2. לאחר מחדש מתלים-חרוזים של הדגימות במאגר תמוגה + nem 10mm, לאסוף באופן מיידי 200 μl של slurry lysate של החרוזים של המדגם, והזרמה למדגם שהצינור של HAM-על קרח. הוסף 300 μl נוסף של LB + nem 10mm למדגם HAM-, ו100 μl נוסף מדגם HAM + עבור סכום כולל של 500 μl בכל דגימה. דגירת הצינורות למשך 10 דקות על קרח.
  3. Re-להשעות (לשטוף) HAM-ודגימות HAM + בעדינות עם חיץ מחמיר 0.5 מ"ל, למדגם. לבצע שלב זה במהירות, כמו דגירת SDS עוד תגרום להסרה של נוגדן מאוגד מחרוזים.
  4. לשטוף בעדינות את כל הדגימות שלוש פעמים ב0.5 מ"ל / מדגם LB של pH 7.2, וספין למטה בין הכביסות שכן ב3.2b צעד.
  5. בעת ביצוע שלב 3.5, להכין חיץ HAM (טבלה 1). הוסף נפח המתאים של פתרון hydroxylamine לצינור חדש, כדי להשיג ריכוז סופי של 1M בנפח של pH 0.5 מ"ל LB 7.2 + לדוגמה, הם. תמיד להכין את החיץ הטרי ליום של ניסוי HAM. הוסף 0.5 מ"ל / מדגם של pH 7.2 LB קטעים מכל בשר חזיר, ו0.5 מ"ל / מדגם של חיץ HAM לכל דגימות HAM +.
  6. Nutate כל הדגימות לשעה 1 בטמפרטורת חדר (RT). אל תחרוג משעה 1.

4. Acyl-Exchange ביוטין: תיוג ביוטין-BMCC

  1. בעת ביצוע שלב 3.6, להכין 2 מ"ל של pH 6.2 LB לפי מדגם (טבלה 1), כמו בשלב 3.1. הנח את pH 6.2 LB על קרח עד הצורך. גם להכין פתרון מניות של ביוטין-BMCC (1 טבלה) מייד לפני השימוש. תשקול את exactly 2.1 מ"ג של ביוטין-BMCC, לאסוף בצינור מ"ל 1.5, ומתמוסס בעדינות sulfoxide דימתיל המ"ל 0.5 (DMSO) על ידי נחת על פלטפורמה מתנדנדת RT, כדי להשיג ריכוז 8mm (לא משתמש בפיפטה כדי לשבור את האבקה ).
  2. לאחר השלב 3.6 הושלם, לשטוף בעדינות את החרוזים בעבר במאגר תמוגה pH 6.2, כדי להסיר חיץ HAM שיורית. הסר את supernatant ולמקם את הדוגמות על קרח.
  3. ביוטין-BMCC היא מולקולת ביוטין מצומדת maliemide שיש זיקה גבוהה לקבוצות thiol חופשיות של cysteines (איור 1). בעת ביצוע השלב 4.2, להכין 0.5 מ"ל של הצפת ביוטין-BMCC (טבלה 1) לפי מדגם, בריכוז עבודה בין 0.5 מיקרומטר עד 5 מיקרומטר. ריכוזים העולים על 5 מיקרומטר צפויים להרוות את חלבון המטרה 6, ובדרך כלל לא צריך להיות חריגים, אולם זה עשוי להשתנות בהתאם לחלבון המטרה הרצויה. הוסף 0.5 מ"ל של חיץ ביוטין-BMCC לכל דגימה, וnutate בדיוק לשעה 1 ב4 &מעלות; ג אל תחרוג משעה 1.

5. Elution של חלבון מטרת ביוטין מצומדות וSDS-PAGE

  1. לאחר השלב 4.3 הושלם, לשטוף בעדינות את כל הדגימות פעם אחת בחומציות LB 6.2. שמור את כל הדגימות על קרח בין כביסות. הסר מאגר לדוגמא SDS 2x ללא סוכני הפחתה (טבלה 1) מ-20 ° C אחסון ולהפשיר לאט על קרח.
  2. לשטוף בעדינות דגימות שלוש פעמים בחומציות LB 7.5 + PMSF / מעכבים, ולשמור על קרח בדגימות בין כביסות.
  3. הסר את supernatant מהכביסה השלישית, משאיר את חרוזי pelleted בתרחיף עם חיץ שנותר בתחתית של תחתית. טבול פיפטה עם טיפ קטן בקוטר (טיפ טעינת ג'ל או קצה פיפטה P2 מספיק) לחלק התחתון ביותר של הצינור דרך slurry, ולאסוף במהירות כל חיץ שנותר, נזהר שלא לקחת את כל חרוזים.
  4. תוספת המאגר לדוגמא SDS 2x עם DL-Dithiothreitol (DTT) כדי להשיג ריכוז סופי של 5 מ"מ. להוסיף40-50 μl של מאגר לדוגמא 2x + DTT 5mm לכל דגימה. במידת הצורך, מערבולת החרוזים לערבב לחלוטין עם חיץ המדגם, וחובצה מייד במהירות גבוהה כדי לאסוף את כל החרוזים בגלולה, שקועים בחיץ מדגם.
  5. מרתיח את כל הדגימות ל10 דקות ב 75-80 ° C. תן דוגמאות מגניבות RT ל≥ 10 דקות על גבי ספסל, וצנטריפוגה XG ב 16000/3 דקות לגלולה לחלוטין את החרוזים.
  6. הוסף נפח מלא של חלבון eluted (supernatant) מכל דגימה לנתיב אחד בתוך הג'ל polyacrylamide מתאים למערב סופג, באמצעות 7 SDS-PAGE. לארגן את כל הדגימות כך שeluent-HAM השליטה וeluent HAM + ליחיד מדגם מנוהלים באופן מיידי סמוכים זה לזה במהלך SDS-PAGE (איור 2). בעקבות SDS-PAGE, להעביר לPVDF או קרום ניטרוצלולוזה.

6. מערבי סופג ואיתור של palmitoylation של חלבון מטרה

  1. ברגע שיושלם שלב 5.6, לשטוף את הממברנהפעמים בטריס-נאגר מלוח (TBS 1x) למשך 10 דקות על פלטפורמת נדנדה בRT.
  2. הכן מאגר חסימה כדי לחסום תיוג לא ספציפי על ידי שקילה החוצה אלבומין בסרום שור (BSA), כדי להשיג משקל של 3% בנפח של TBS 1x + Tween-20 0.05% (TBS-T) כי די בכך כדי להטביע את הקרום באופן מלא . לstreptavidin סופג, תמיד לחסום עם BSA ולא אבקת חלב. חסום את הקרום לשעה 1 בRT על פלטפורמת נדנדה.
  3. הכן את פתרון נוגדן של TBS-T + BSA 0.3%. הוסף נוגדן HRP-streptavidin מחדש ב1 מ"ג / מ"ל ​​במים מזוקקים, בדילול 1:5,000-1:10,000. לאחר השלב 6.2 הושלם, לשטוף את הממברנה פעם אחת בTBS-T למשך 10 דקות, ואז דגירת הקרום בפתרון נוגדן streptavidin על פלטפורמת נדנדה לאו לשעה 1 בRT, או הלילה ב 4 ° C.
  4. שטוף את הממברנה שלוש פעמים בTBS-T למשך 10 דקות על פלטפורמת נדנדה. על מנת לאתר את אות palmitoylation, לחשוף את הארת HRP שימוש כימיערכת המצע iluminescent.
  5. כדי לנרמל את רמות palmitoylation לכמות החלבון של עניין שimmunoprecipitated, להפשיט את קרום חיץ באמצעות הפשטת כתם מערבי לדקות 5-10 על פלטפורמת נדנדה בRT. חזור על שלבים 6.1-6.4 באמצעות נוגדן הראשוני נגד החלבון של ריבית ששמש במקור לimmunoprecipitation.
  6. לכמת palmitoylation של החלבון של עניין באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, ולנרמל את רמות palmitoylation לכמות חלבון immunoprecipitated.

Representative Results

בדיקת ה-IP-ABE במיוחד מזהה thiol-palmitoylation של שאריות ציסטאין לאורך חלבוני מצע, והוא יכול לשמש כדי לזהות palmitoylation של חלבונים העצביים immunoprecipitated באופן מתואר באיור 1. טיפול בחלבון העצבי immunoprecipitated עם HAM (איור 1) וחותך את הצמדת thioester בין קבוצת thiol של ציסטאין Palmitate ו, המאפשר שילוב ספציפי של ביוטין-BMCC על קבוצת thiol חדש הזמינה, שניתן לאתר בהמשך באמצעות סופג מערבי. המחדל של מחשוף HAM (מינוס-HAM) מונע התאגדות של ביוטין-BMCC ופונקציות כמו שליטה שלילית לPalmitoyl-biotinylation הספציפי של המדגם בתוספת-HAM, ולכן תמיד יהיה להפעיל בסמוך למדגם בתוספת-HAM למערבי סופג ידי SDS-PAGE (איור 2).

בניסוי אופטימיזציה (איור 2 א), palmitoylationאות של חלבון δ-catenin העצבי 2 יכולה להיות מזוהית בקלות על ידי סופג לביוטין-BMCC בריכוז של 1 מיקרומטר, באמצעות streptavidin מצומד עם HRP, נגד דגימות מינוס ופלוס HAM מקבילות. אות palmitoylation הספציפית ל- catenin δ מופיעה בגודל החזה שלה 160kD, רק בתוספת המדגם-HAM. הספציפיות של האות הזה אושרה על ידי reprobing לδ-catenin עם הנוגדן הספציפי שתחילה שמש לimmunoprecipitate, וכתוצאה מכך אות בשני טיפולי HAM באותו גודל חזה. אופטימיזציה של assay IP-ABE (איור 2 א) תגרום פרופיל סופג מערבי של מדגם מינוס HAM שהוא בקלות להבחין ממדגם הפלוס HAM, ומציגה מינימאלי או ללא אות palmitoylation.

הריכוז של ביוטין-BMCC לשמש תווית cysteines palmitoylated דורש אופטימיזציה זהירה, ואם ריכוז להרוות סופר של דוotin-BMCC משמש במהלך שלבי אייב כימיה (איור 2 ב '), הרקע מוגזם ואותות שאינם ספציפיים יהיה גלוי. עקומת תגובה ליניארי biotinylation של חלבון palmitoylated עצבי, הקולטן אצטילכולין α7 ניקוטינית, ביוטין באמצעות-BMCC העבר נקבעה 6, ומראה ליד רוויה מלאה בריכוז של 5-10 מיקרומטר. למרות שהריכוז האופטימלי של ביוטין-BMCC יסטה מעט בהתאם לחלבון המטרה העצבי, טיפול ביוטין-BMCC בריכוז העולה על 5 מיקרומטר צפויים סופר להרוות את חלבון המטרה, ותוצאה בפרופיל כתם מערבי עם רקע גלוי ואותות שאינם ספציפיים. ריכוז של 0.5 מיקרומטר לביוטין-BMCC שמש בעבר כדי לזהות palmitoylation של חלבונים עצביים אחרים כולל SNAP-25, huntingtin, יחידות משנת רצפטור AMPA GluA1 וGluA2, וparalemmin 8, וקביעת הריכוז האופטימלי לרומןחלבון המטרה יכול להתבצע על ידי ניסוי וטעייה באופן ליניארי, החל בטווח של 0.5-5 מיקרומטר שאנו מתארים כאן. פרופילי תוצאת streptavidin המערבי הכתם בין דגימות מינוס ופלוס HAM לpalmitoylation δ-catenin נראים דומים כאשר טופלו עם 4 מיקרומטר ביוטין-BMCC (איור 2 ב '), עם אותות רקע נוספים בגדלים שונים, המצביעים על כך biotinylation ההולם התרחש.

Hydroxylamine הוא סוכן צמצום חזק כי תוצאות בשפלה מוגבלת של חלבון המטרה, בנוסף למחשוף היעיל של thioester הצמדה. כתוצאה מכך, אופטימיזציה של אייב כימיה מחייבת אחד ללנרמל את כמות חלבון immunoprecipitated משמש לדגימות מינוס ופלוס HAM (שלבים 3.2-3.3). נורמליזציה דורשת שימוש בכמות הכפולה של חלבון המטרה משותקת בפלוס לעומת מדגם מינוס HAM, אשר למעשה גורם Wester נבדלn סופג פרופילים לחלבון המטרה, כפי שמוצגים לδ-catenin (איור 2 א ', ב'). עם זאת, אם כמות חלבון המטרה משותקת אינה מנורמלת בין דגימות מינוס ופלוס HAM, אות הכתם המערבית כתוצאה לחלבון המטרה בדגימה בתוספת-HAM יכולה ללכת לאיבוד, כפי שמוצגת לδ-catenin כאשר כמויות שווות של חלבון היה בשימוש בשני טיפולי HAM (האיור 2C).

הספציפיות של אייב כימיה לתיוג חלבוני palmitoylated הן מאוד רגישות ודורשות אופטימיזציה. את המלכודות הנפוצות נתקלו במהלך בדיקת ה-IP-ABE כוללות את התוצאות תת אופטימליות מוצגות באיורים ו2B 2C, והשפלה של חלבון המטרה, ללא תלות בטיפול HAM, אשר בדרך כלל נגרם על ידי חומרים כימיים וחוצצים מבוגרים, וחומציות נכונה. על מנת להימנע מהמלכודות הללו ולתקן לכימית אייב תת אופטימלית, הרעננות והריכוז של החומרים כימיים הנדרשות למאגרים מופיעים בטבלה 1 תמיד יש לבחון, ואת התאמות pH של כל המאגרים תמיד יש לבדוק לפני הפעלת הניסוי.

בלם ריכוז עבודה תגובות
מאגר תמוגה (LB) במזוקק H 2 O:% 1-630 CA pH7.5 150mm NaCl גליצרול IGEPAL 50mm טריס-HCl 10% N / הכן לפני הניסוי והחנות ב 4 ° C
פתרון nem ב% EtOH 100: אבקת lyophilized nem ז 2 הכן טרי, מייד לפני השימוש.
מאגר מחמיר בLB: 10 מ"מימ MEM 0.1% SDS N / הכן זמן קצר לפני השימוש, לשמור על קרח.
pH 7.2 LB בLB: התאם PH בדיוק 7.2 N / השתמש במד pH להתאים pH מייד לפני השימוש.
מאגר HAM בחומציות LB 7.2: פתרון HAM המלאי 1 ז (ריכוז HAM סופי) הכן מייד לפני השימוש.
LB pH 6.2 בLB: התאם את ה-pH בדיוק 6.2 N / זהה לרמת חומציות 7.2 LB
פתרון המניות ביוטין-BMCC בDMSO: 2.1 מ"ג פתרון ביוטין-BMCC 8 מ"מ הכן מייד לפני השימוש.
מאגר ביוטין-BMCC בpH 6.2 LB: הוסף פתרון ביוטין-BMCC 1-5 מיקרומטר (ריכוז סופי ביוטין-BMCC) הכן מייד לפני השימוש.
2 מאגר x SDS לדוגמה, לא סוכני הפחתה במזוקק H 2 O: 5% SDS 5% גליצרול 125mm טריס-HCL-pH 6.8 0.01% Bromophenol הכחול N / הכן לפני הניסוי, ולאחסן ב -20 ° C עד שימוש. להשלים עם DTT 5 מ"מ לפני השימוש.

טבלת 1. חוצצים וריאגנטים הנדרשים לבדיקת ה-IP-ABE. רבים של מאגרי תמוגה יכולים להיות מוכנים לפני תחילת הניסוי, לעומת זאת pH צריך להיות מסומן ומותאם מייד לפני שימוש עם מד pH, כדי להבטיח את ההצלחה של כימית אייב. רוב פתרוני מניות צריכים להיות מוכן טרי עבור כל ניסוי, מייד לפני השימוש. רבים מהמאגרים דורשים ריאגנטים משותפים למרבית המעבדות המצוידות לביוכימיה, וריאגנטים מיוחדים עם פרטי ספקים מופיעים בטבלה של חומרים כימיים ובציוד.

דף = "תמיד"> איור 1
איור 1. סכמטי של immunoprecipitation וassay Exchange acyl-ביוטין (IP-ABE) כדי לטהר ולזהות palmitoylation של חלבונים עצביים. נוירונים ביפוקמפוס מתורבתים הם lysed, (1) חלבון המטרה הוא אז מטוהר באמצעות נוגדן היעד ספציפי, ומשותק על sepharose חרוזים מצופים בחלבון G או A. חלבון המטרה המטוהרת אז (2) טופל בN-ethylmaliemide (nem) באופן בלתי הפיך לקשור ולחסום קבוצות בחינם thiol (-SH) יחד cysteines ללא שינוי (C). חלבון המטרה הוא לאחר מכן (3) נתון לטיפול עם hydroxylamine (שינקין), וכתוצאה מהמחשוף ספציפי של אג"ח thioester בcysteines palmitoylated והסרת מסכות קבוצת thiol palmitoylated חופשיה (-SH). בשלב בא, חלבון המטרה הוא (4) treateד עם מולקולת thiol-reactive ביוטין, ביוטין-BMCC, וכתוצאה מbiotinylation הספציפי של ציסטאין palmitoylated. לבסוף, (5) חלבון המטרה biotinylated הוא eluted והוסר מהנוגדנים והחרוז. חלבון המטרה עם ציסטאין palmitoylated (הים) מתויג בביוטין הוא עכשיו מתאים לאלקטרופורזה SDS פולי acrylamide ג'ל (SDS-PAGE), וסופג עם streptavidin לזהות לpalmitoylation של החלבון העצבי המטוהר מערבית. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה .

איור 2
איור 2. איתור של palmitoylation של δ-catenin החלבון העצבי באמצעות בדיקת ה-IP-ABE. נוירונים ביפוקמפוס עכברוש ראשוניים היו מבוגרים בטרוםתאר מטבע דברים 5, בצפיפות של 130 תאים / מ"מ 2 עד לפדיון ב14DIV, אז היו lysed, ונתונים לבדיקת ה-IP-ABE לזהות palmitoylation של מצע זוהה לאחרונה palmitoylated עצבי, δ-catenin 2. Immunoprecipitates מטוהר (IPS) של δ-catenin (חלבון המטרה) היינו מבודד באמצעות 5 מיקרוגרם של נוגדן δ-catenin לדגימה (מעבדות תמרת BD), ולאחר מכן נחשפו לSDS-PAGE במקביל מינוס ופלוס hydroxylamine (שינקין) דגימות. Palmitoylation זוהה על ידי מערב סופג (WB) עם streptavidin-HRP (palmitoylation), והקרום הופשט ונתונים לreprobe WB לδ-catenin. () תוצאה אופטימלית נציג ה-IP-ABE ל- catenin δ palmitoylated (ראש החץ) שטופל עם מיקרומטר 1 ביוטין-BMCC, הממחיש את הספציפיות של אייב כימיה לאיתור חלבוני thiol-palmitoylated מדגימות ה-IP. (ב) מייצג תת אופטימליתוצאת IP-ABE sentative ל- catenin δ, שם ריכוז עודף של 4 מיקרומטר ביוטין-BMCC היה בשימוש, וכתוצאה מאותות שאינם ספציפיים ורקע בשתי דגימות מינוס ופלוס HAM (חיצים). (ג) נציג אחר תת אופטימלי IP-ABE WB ל- catenin δ, שבו ריכוז 4 מיקרומטר מוגזם של ביוטין-BMCC היה בשימוש, ואת כמות החלבון המשמשת למדגם IP הפלוס HAM לא מנורמל לHAM-תיווך פירוק חלבונים, וכתוצאה מכך אבדה את האות בreprobe WB לδ-catenin. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

Discussion

בדיקת ה-IP-ABE מוצג כאן היא שיטה פשוטה ורגישה מאוד לאיתור חלבוני palmitoylated בנוירונים ביפוקמפוס בתרבית ראשונית, תוך שימוש בטכניקות ביוכימיות בעיקר סטנדרטיות. זה הופך את הבדיקה להתאמה בקלות למעבדות מצוידות כבר עם חומרים מוחים מערביים. בדיקת ה-IP-ABE משלבת פרוטוקול סטנדרטי immunoprecipitation לבודד ולשתק את חלבון המטרה של אחד, ואחריו תאר בעבר אייב כימית 2-4 במהירות כדי לזהות רמות Palmitate על חלבון מצע. טכניקת אייב יש מגוון רחב של יישומים לבחינת חלבוני palmitoylated ברקמות שונות וקווים סלולריים, כולל סריקות רחבות היקף Palmitoyl-proteomic של פרופילי palmitoylation הגלובליים, ואיתור מהיר של רמות palmitoylation של חלבון מטרה אחת.

תיאורים קודמים של אייב כימיה נצלו תמוגה שונה שיטות תא והפקת חומרי ניקוי מprot העצביEins 2, 9, בחסמי thiol חופשיים 10, 11, biotinylation, וטיהור של חלבון המטרה 4, בהתאם ליישום של הניסוי. התוספת של Palmitate לתוצאות חלבונים עצביות במיקוד שלהם לכיוון קרום תא, וזיהוי של שבריר palmitoylated של חלבון המטרה תחייב חילוצו מהקרומים האלה. מתודולוגיות אייב שתוארו לעיל יש שימוש במגוון של 9 יוניים וחומרי ניקוי שאינם יוניים 8 לחלץ חלבוני היעד רצוי, ושימוש בחומרי ניקוי מסוימים תלוי בחלבון המטרה וסחר הקרום הידוע שלה. כאן, אנו מנצלים את הלא denaturing וחומר ניקוי לא יוני IGEPAL CA-630 כדי לחלץ חלבוני palmitoylated, שיש לנו תוקף לחילוץ וזיהוי של חלבון δ-catenin העצבי palmitoylated (איור 2). מבנה IGEPAL CA-630 כולל קבוצה שאינה קוטבית ראש מגושמת ונוקשה שאינהלשבש קונפורמציה חלבון יליד או אינטראקציות, אך המאפשר הקשר שלה עם האזורים ההידרופובי של חלבוני קרום קשורים ל, ובכך מקנה להם miscibility ומאפשר המיצוי שלהם. חלבונים עצביים רבים מותאמים להממברנה הסינפטית או צפיפות פוסט סינפטי של סינפסות יש לחלצם באמצעות IGEPAL CA-630, עם זאת חלק לא יכול solubilize לחלוטין, ועשוי לדרוש שימוש בחומרי ניקוי שונים שאינם denaturing כמו טריטון X-100, שבו יש כבר נוצל בעבר לאייב כימיה 2, 8.

כמה תיאורים של אייב כימיה גם מנוצלים מגיב biotinylation thiol-reactive שונה מהמולקולה מתוארת כאן, בשם ביוטין-HPDP (Thermo Scientific), שמחייבת גם אמצעים שונים של טיהור חלבונים 4. ביוטין-HPDP היא עוד מולקולת thiol-reactive, maliemide מצומדות ביוטין המכילה קשר דיסולפיד בזרוע המקשרת maliemide, מבני דifferentiating מביוטין-BMCC, אשר אינו מכיל קשר דיסולפיד זה. בעקבות thiol-biotinylation של ציסטאין בחינם או palmitoylated של חלבון על ידי ביוטין-HPDP, קשר דיסולפיד כתוצאה בין חלבון המטרה וקבוצת יוטין ניתן בקע ידי הפחתת ריאגנטים לשחרר את קבוצת יוטין ולחדש את החלבון וללא שינוי שלה, מה שהופך biotinylation ביוטין-HPDP חולף והפיך. שימוש, אפוא, מגיב biotinylation זה דורש טיהור של חלבון מטרה על ידי חומרים כימיים avidin חסר יכולת תנועה, כגון חרוזי streptavidin מצופים. עם זאת, thiol-biotinylation של חלבון מטרה על ידי ביוטין-BMCC, כפי שנתואר כאן, הוא יציב וקבוע יחסית, ודורש טיהור של חלבון המטרה על ידי נוגדן מכוון נגד היעד, ומשותק על חרוזי sepharose. שני טכניקות אייב כבר נוצל בעבר למסכים בקנה מידה גדול, ואיתור של palmitoylation של חלבונים בודדים 2, 8-10, 12, ובדיקת ה-IP-ABE אנו מתארים כאן היא אופטימלית לאיתור מהיר של palmitoylation של חלבוני היעד עצביים יחידים.

רוב מכריע של palmitoylation הסלולרי כרוך בנוסף ההפיך של Palmitate לקבוצת thiol של cysteines (שמכונה S-palmitoylation, בו אנו מכלילים כ 'palmitoylation' בפרוטוקול זה), אולם קבוצה מצומצמת מאוד של חלבונים חשופות לpalmitoylation בלתי הפיך בגליצין ושאריות ציסטאין באמצעות יצירת קשרים אמידים יציבים, כינו N-palmitoylation 13. מגבלה אחת של אייב כימיה היא חוסר יכולתה לזהות בגלל N-palmitoylation ליציבות של הקשר האמיד, וכן הקרנה של חלבון המטרה חדשה לpalmitoylation יש לאשר באמצעות תיוג מטבולית 3H-Palmitate 1.

כאמור, בדיקת IP-ABE ניתן להתאים בקלות לבחינת palmitoylation בתמציות חלבונים ממקורות מרובים, כולל טראןsfected קווי Heterologous תא, רקמה עיקרית, ותרבויות העצביות עיקריות מאזורים במוח מרובים. בדיקת ה-IP-ABE נוצלה לבחינת הסתפקות palmitoylation של חלבונים שעברו מוטצית ציסטאין לסרין כדי לזהות את מיקומו של ציסטאין palmitoylated יחד חלבון המטרה 8, לבחינת מחזור Palmitate דינמי על חלבונים סינפטיים בנוירונים בתרבית בתנאי בסיס, 10, ושינויים ברמות palmitoylation של חלבונים עצביים בעקבות אינדוקציה של פעילות עצבית 9. הרגישות וההסתגלות של assay IP-ABE להפוך אותו אידיאלי לבחינת פרופילי palmitoylation של חלבונים עצביים, ואופטימלי לאיתור שינויים דינמיים בpalmitoylation.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממכון קנדי ​​לבריאות מחקר MOP-81158.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IGEPAL CA-630 Sigma I8896
PMSF Fluka 93482
Protease Inhibitor Cocktail Roche Complete Mini 11 836 153 001
NEM Sigma E3876
HAM solution Sigma 46780-4
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225 Ensure compatibility with chosen detergent
Protein G/A-coated sepharose beads GE Healthcare 17-6002-35
Biotin-BMCC Thermo Scientific 21900
Streptavidin-HRP Thermo Scientific 21126 Reconstitute at 1 mg/ml in water
Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific 21059

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nat. Rev. Neurosci. 11, 161-175 (2010).
  2. Kang, R., et al. Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation. Nature. 456, 904-909 (2008).
  3. Drisdel, R. C., Green, W. N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. Biotechniques. 36, 276-285 (2004).
  4. Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nat. Protoc. 2, 1573-1584 (2007).
  5. Xie, C., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Survival of hippocampal and cortical neurons in a mixture of MEM+ and B27-supplemented neurobasal medium. Free Radic. Biol. Med. 28, 665-672 (2000).
  6. Drisdel, R. C., Alexander, J. K., Sayeed, A., Green, W. N. Assays of protein palmitoylation. Methods. 40, 127-134 (2006).
  7. Eslami, A., Lujan, J. W. estern Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
  8. Huang, K., et al. Neuronal palmitoyl acyl transferases exhibit distinct substrate specificity. FASEB J. 23, 2605-2615 (2009).
  9. Noritake, J., et al. Mobile DHHC palmitoylating enzyme mediates activity-sensitive synaptic targeting of PSD-95. J. Cell Biol. 186, 147-160 (2009).
  10. Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 Targets GRIP1 to Dendritic Endosomes to Regulate AMPA-R Trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
  11. Hayashi, T., Thomas, G. M., Huganir, R. L. Dual palmitoylation of NR2 subunits regulates NMDA receptor trafficking. Neuron. 64, 213-226 (2009).
  12. Ho, G. P., et al. S-Nitrosylation and S-Palmitoylation Reciprocally Regulate Synaptic Targeting of PSD-95. Neuron. 71, 131-141 (2011).
  13. Iwanaga, T., Tsutsumi, R., Noritake, J., Fukata, Y., Fukata, M. Dynamic protein palmitoylation in cellular signaling. Prog. Lipid Res. 48, 117-127 (2009).

Comments

7 Comments

  1. please ,what is the stringent buffer ? What reagents should I prepare?

    Reply
    Posted by: 李 î
    August 28, 2013 - 3:09 AM
  2. Hello,
    The stringent buffer is described in Table 1, 3rd buffer from the top. The description reads "In LB: 10 mM MEM 0.1% SDS," however there is typo and should read "In LB: 10mM NEM + 0.1% SDS." NEM refers to N-ethymaliemide, which we describe in the protocol. SDS refers to sodium dodecyl sulfate, a common laboratory reagent, and powerful ionic detergent. Add SDS to LB containing 10mM NEM to achieve a final concentration of 0.1% of the total volume. Perform the wash step (step 3.4) quickly, as we describe above, as the SDS could result in the removal of the target protein from the antibody-bead immunocomplex if incubated to long. Thank you for your interest in the our protocol.

    Reply
    Posted by: Stefano B.
    August 28, 2013 - 6:04 PM
  3. please,I want to kown that if my cell is suspended cells,what can I do about the Extraction of Target Protein ? especially,the amount of the LB+50mM NEM. THANK YOU!

    Reply
    Posted by: 李 î
    September 2, 2013 - 2:22 AM
  4. Hello,
    The IP-ABE assay should work fine for a suspended cell culture. The section of the protocol pertaining to the harvesting and extraction (steps 1.1-1.8) of the target protein works in a manner similar to the extraction of any target protein for the purposes of immunoprecipitation. Begin by growing your cells to the confluence and density in suspension that you desire, and then simply spin down (e.g. 3000 x g/ 5 minutes) to collect the cells in a pellet. Next, simply re-suspend the cells in lysis buffer supplemented with 50mM NEM, and proceed with the remainder of the protocol as we describe. Some important considerations should be paid to your choice of detergent for extracting the target protein. We recommend the use of IGEPAL-CA 630, a non-ionic detergent suitable for the extraction of membrane-associated proteins, and which can extract palmitoylated fractions of neuronal proteins localized to synapses of cultured hippocampal neurons. Triton X-100 is a similar detergent, and is also highly utilized to extract palmitoylated proteins. We would not recommend using an ionic detergent (e.g. SDS), as this will denature the protein and may hinder the immunoprecipitation efficiency of your chosen antibody, and may degrade the palmitoylation signal. You will also want to choose an antibody suitable for immunoprecipitation of your target protein. We recommend that you refer to your lab's standard protocol for immunoprecipitating a target protein from suspended cell culture, and simply supplement your lysis buffer with 50mM NEM and proceed with the ABE assay as we describe. Please refer to the discussion section of our protocol for more information regarding choice of detergents. Thank you again for your interest in our protocol.

    Reply
    Posted by: Stefano B.
    September 2, 2013 - 4:32 PM
  5. sorry ,I also confused about the Extraction of Target Protein of suspended cells, a problem is how do I control the amount of the LB+50mM NEM ? whether should I determine its amount based on the amount of my cells or refer your protocol to add 300μl ?

    Reply
    Posted by: 李 î
    September 3, 2013 - 3:14 AM
  6. Hello,
    I recommend that you determine the total volume of lysis buffer to use for harvesting according to the amount of cells you use as a starting point. As long as you maintain the concentration of 50mM NEM within your lysis buffer, the total volume can change depending upon your needs. The volume we used in the protocol was based upon harvesting protein from at least 3 wells of a standard 6-well dish containing hippocampal neurons, however I imagine you will want to adjust the volume you use for harvesting from suspended cells. In general, it is best to obtain a high total protein concentration within the lysis buffer, and so I recommend that you use the minimal volume of lysis buffer necessary to sufficiently extract your target protein. In my past experience working with adherent cell cultures and the IP-ABE assay, approximately 50-100uL of lysis buffer / 1.0 x 10^6 cells was sufficient for adequate protein extraction and achieving a high protein concentration. I suggest that you begin by determining the number of cells required for at least 500ug total protein / IP sample, and start with a smaller volume of lysis buffer (up to 500uL total, per sample). Once you spin down and pellet your suspended cells in a conical tube, you should be able to visualize an approximate volume that will suffice. We wish you the best of luck with the protocol.

    Reply
    Posted by: Stefano B.
    September 3, 2013 - 2:11 PM
  7. Hello,
    I tried the protocol with your protein as a positive control but I can't see any signal for palmitoylation. I noticed I used Protease Inhibitor Cocktail ultra which not contain EDTA compare to your. I used the 2x Laemmli Sample Buffer from Biorad (glycerol 20-35%, SDS 1-2.5%, water 50-100%) and I add DTT. Is this may be the reason it didn't work ?

    Reply
    Posted by: Nicolas P.
    September 25, 2016 - 12:34 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics