Author Produced

Elektrofizyoloji Tabanlı Katı Desteklenen Membran Giriş

Biology
 

Summary

Burada Elektrojenik membran nakil karakterizasyonu için uygulamaları odaklı sağlam desteklenen membranlar dayalı bir elektrofizyolojik yöntem mevcut.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bazzone, A., Costa, W. S., Braner, M., Călinescu, O., Hatahet, L., Fendler, K. Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology. J. Vis. Exp. (75), e50230, doi:10.3791/50230 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Biz mevcut elektrofizyolojik yöntem altın kaplamalı sensör çipi ve üstüne bir fosfatidilkolinin tek tabaka üzerinde kimyasal olarak bir octadecanethiol tabakası oluşan sağlam bir desteklenen membran (SSM) dayanmaktadır. Bu meclis referans elektrot, bir klorlu gümüş tel içeren bir küvet sisteme monte edilir.

Membran fragmanları ya da ilgi membran proteini içeren proteoliposomes adsorpsiyonu sonra, hızlı bir çözüm değişimi membran proteini taşıma etkinliği indüklemek için kullanılır. Tek bir çözüm değişimi protokolü iki çözüm, bir aktive edici olmayan ve bir aktive edici bir çözüm, ihtiyaç vardır. Akış, bir Faraday kafesi içinde basınçlı hava ve bir valf ve boru sistemi ile kontrol edilir.

Elektrojenik taşımacılık faaliyetinin kinetik SSM ve proteoliposomes veya membran parçaları arasında kapasitif bağlantı yoluyla elde edilir. Bir yöntem olup, bu nedenle, sadece transien verimlerit akımları. Akım tepe sabit taşıma aktivitesini temsil eder. Zamana bağlı taşıyıcı akımları devre analizi ile yeniden olabilir.

Bu yöntem özellikle yama kelepçe veya gerilim kelepçe yöntemlerle incelenmiştir edilemez hücre içi zarlar, gelen prokaryotik taşıyıcılar veya ökaryot taşıyıcılar için uygundur.

Introduction

Burada Elektrojenik membran proteinlerin karakterizasyonu için sağlam bir destek zar (SSM) dayalı yeni bir elektrofizyolojik yaklaşım göstermektedir.

Katı destek, bir cam slayt, sensör çipi üzerinde ince bir altın tabakası oluşur. Hidrofilik altın yüzey, bir alcanethiol reaktif tiyol grubuna bağlamak için kullanılır. Daha sonra, selfassembly bir fosfatidilkolinin monolyer en SSM oluşumunu tamamlar.

Zar proteinlerinin Elektrojenik tepkisini ölçmek için, proteoliposomes veya zar parçaları SSM (Şekil 1) ile absorbe edilir. Membran ve SSM içeren protein daha sonra bir kapasitif olarak birleştirilmiş zar sistemi oluşturur. Bu nedenle, protein ihtiva eden membran şarj translokasyon SSM ile kapasitif kuplaj ile tespit edilebilir. Bu yöntem yalnızca geçici akımlar verir. Akım tepe sabit taşıma aktivitesini temsil eder. Zamana bağlı taşıyıcı currents devre analizi ile yeniden olabilir.

Sensör çipi bir küvet sistemi (Şekil 2) içine monte edilir. Küvet 17 ul silindirik bir küvet hacmi (o-ring ile net ses monte). Bir yaylı kontak pin amplifikatör için temas oluşturur. Bir çıkış konektörü ana kısmının üstüne vidalanır ve referans elektrot, klorlanmış bir gümüş tel taşır.

Küvet bir Faraday kafesi olarak monte edilir. Bu, hızlı bir çözelti değişimi (Şekil 3) karşılık olarak membran proteini taşınma aktivitesi sağlamak için kullanıldığı, bir sıvı yolu, bağlanır. Tek bir çözüm değişimi protokolü iki çözüm, bir aktive edici olmayan ve bir aktive edici bir çözüm, gereklidir. Akış bir arayüz kutusu üzerinde bir bilgisayar veya el anahtarları üzerinde bir vana kontrol yazılımı kullanarak basınçlı hava ile kontrol edilir.

Protocol

1. SSM tabanlı Elektrofizyoloji için bir cihaz ayarlama

Detayları da şematik çizimler ve küvetler fotoğraflarını içeren ve 1, 2 kurmak teknik yayınlar, iki verilmiştir. Farklı bir çözüm Döviz yapılandırmaları ve akış protokolleri aynı zamanda yöntemi kağıt 2 tartışılmıştır.

Aşağıda bir kaç son gelişmeler ve video sunumu için doğrudan ilgili olan teknik ayrıntıları ekleyin.

Valf kontrolü ve veri toplama

Arayüz kutusu ticari bir USB dijital çıkış / analog giriş arabirimi (NI USB 6009 National Instruments) ve valf sürücüleri içerir. Bu çözelti akışını kontrol ve veri toplama için sorumludur. Vanalar normalde hızlı vanalar 18 kadar bir gerilim ile tahrik V. Videoda bir 12 V güç kaynağı kullanmak olabilir geçiş için, Ancak 12 ile tahrik V. vardır. </ P>

Vana sürücü devre kartı dört valf çalışabilir. Bu Biyofizik Max Planck Enstitüsü servis tarafından imal edilmiştir. Vanalar ön panelde anahtarı üzerinden bilgisayar veya el ile kontrol edilebilir. İkinci temizlik işlemleri ve yıkama için uygundur. Ölçüm sırasında, arayüz kutusu bir vana kontrolü ve veri toplama yazılımı (surfe 2 R yazılımı, IonGate Biosciences) kullanarak bilgisayar kontrollü olduğunu.

2. Hazırlıklar

Bu bölümde bir SSM-tabanlı deney elektrofizyoloji hazırlanması için farklı protokoller bahsedilmiştir.

2.1 SSM oluşumu için Lipid çözüm yapma

  1. 25 ul oktadesilamin (Kloroform içerisinde 5 mg / ml) ve bir cam şişe içinde 375 ul Diphytanoylphosphatidylcholine (Kloroform içinde 20 mg / ml) karıştırın.
  2. Bir döner buharlaştırıcı ve sürekli bir nitrojen gazı akışı kullanılarak, için kloroform buharlaşmasıyaklaşık 30 dakika.
  3. N-dekan 500 ul ile çalkalayarak cam şişe duvarlarından lipid çıkarın. Nihai lipit konsantrasyonuna 1:60 (w / w) oktadesilamindir ile 15 mg / ml 'dir.
  4. Cam saklama kabı çözüm aktarın. -20 ° C'de lipid çözüm Mağaza

Referans elektrotunun 2.2 Klorlama

Referans elektrotlar aşınma nedeniyle düzenli aralıklarla klorlu gerekir.

  1. Klorlama işleminden önce ince zımpara kullanarak eski gümüşklorid tabakasının dayanağını çıkarın.
  2. 1 M hidroklorik asit solüsyonu içine bir platin elektrot ile birlikte gümüş tel yerleştirin ve 0,5 mA, 15 dakika boyunca klorlama. Klorlama tamamladıktan sonra, gümüş tel homojen bir koyu gri rengini değiştirir.

Poliakrilamid jel köprünün 2.3 hazırlanması

  1. 100 mM pH değerinde KPI = 7, 100 mM KCI, 6 ihtiva eden bir çözelti hazırlayın% Acrylamid.
  2. % 0.3 APS (% 10 Stok) ekleyin ve% 0.6 TEMED ve kısa bir pipet ile çözüm karıştırın.
  3. Hemen çözelti karıştırıldıktan sonra, boş jel köprü kabına karışım, 30 ul enjekte etmek için bir pipet kullanın. Bu enjeksiyon sırasında hava kabarcıklarını önlemek için önemlidir.
  4. 20 dakikalık bir inkübasyon süresi sırasında jel polimerize olur.
  5. Polimerizasyon sonrası jel köprü çözeltisi (100 mM KPI pH 7, 100 mM KCI) depolanır. Jel köprünün ömrünü uzatmak için, çözelti 4 ° C sıcaklıkta saklanır

Ölçüm çözümler 2.4 hazırlanması

Farklı bileşimin çözümler değiştirilmesi durumunda, SSM çözünenlerin kuvvetli etkileşime bağlı olarak, elektrik eserler oluşturulur. Bu nedenle, solüsyonların hazırlanması için önemli bir adımdır. Çözüm Döviz eserler en aza indirmek için çözüm hazırlık sürecinde aşağıdaki önlemleri alın.

  1. Olmayan aktive ve bir partiden çözümler aktive olun, pH ve iyonik kuvvet ayarlayın.
  2. Yüksek tuz arka plan çözüm Döviz eserler azaltmaya yardımcı olur.
  3. Iki cilt halinde toplu çözüm bölün.
  4. Aktive çözeltisine aktive edici bileşik ekleyin. Mümkün olduğunca benzer ozmolarite ve her iki çözüm iyonik gücünü tutmak için olmayan aktifleştirici çözelti içinde bir telafi edici bileşiğin kullanımı.
  5. Çözümleri 4 ° C'de saklanır ise, sıcaklık hatta küçük farklılıklar eserler üretebilir çünkü tüm çözümler, bir ölçüm başlamadan önce oda sıcaklığına ulaşıldığında emin olun.

3. Bir SSM tabanlı Elektrofizyoloji Deney

Burada bir SSM-tabanlı bir deney elektrofizyolojik için tipik bir protokol mevcut.

3.1 SSM Kurulum hazırlanması

SSM Kurulum kullanımda değilken tüpleri% 30 etanol ile doldurulur/ Su çözeltisi bakteri büyümesini önlemek için.

  1. Küvet monte etmeden önce, borunun ikinci etanolü ortadan kaldırmak için saf su ile yıkama sistemi. Su kapları ile etanol kaplar değiştirin. Yüksek basınç (0.6 ila 1.0 bar) yaklaşık 20-30 ml su ile sistem temiz kullanma.
  2. PH 7.6 ya da olmayan aktive çözüm bir 100 mM KPI tampon kullanarak temizleme işlemi tekrarlayın.
  3. Hava kabarcıkları sıvı sistemde kalır emin olun.

3.2 küvet Montaj

  1. Referans elektrot bir o-ring takın
  2. Saklama çözeltisinden jel köprüyü ve referans elektrotu, bağlayın.
  3. Önceden doldurunuz olmayan aktive tamponu ile çıkış konektörü, bir o-ring takın ve referans elektrot montaj tamamlamak için jel köprü bağlayın. Hava kabarcığı jel köprü ve çıkış çözelti akış yolunun kavşağında olduğunu özel dikkat gösterin.
  4. Cuve ana parçası Preassembleyaylı kontak pin (amplifikatör bağlantısı), giriş borusu (terminal vana bağlantı), o-ring (SSM için sızdırmazlık) ve vidaları ekleyerek tte.
  5. Bir cımbız kullanarak, depolama çözümü (etanol içinde 10 mM octadecanethiol) ve sensör çipi çıkarın.
  6. Bir pipet kullanarak, yakl kalan çözüm yıkayın. Saf etanol, 5 ml.
  7. Azot gazı altında elektrot kurutun.
  8. Giriş küvetin ana parçanın menfezi, böylece küvet taban kısmının üzerine doğru bir sensör çipi yerleştirin sensörün dairesel aktif alanına yönlendirilir.
  9. Sensör çipin aktif alanın lipid çözeltinin 1 ul ekleyin. Altın tabakası tam lipid kapalı olduğundan emin olun.
  10. Hemen lipid çözeltisi ilave edildikten sonra, önceden monte edilmiş bir ana bölümü ekleyerek küvet kapatın.
  11. Faraday kafesi içine küvet monte etmeden önce, tüm yüzeyler tamamen kuru olduğundan emin olun.
  12. Idareterminal valf için yaylı kontak pin ve giriş tüp amplifikatör ect. Daha sonra Faraday kafesi içindeki vida ile küvet düzeltmek.
  13. Küvet en üstüne çıkış konektörü takın. Son olarak, çıkış konektörü ve referans elektrot için voltaj jeneratörüne çıkış borusuna bağlanabilir.
  14. Hemen montaj sonra küvet 0,6 barda tamponu ile yıkama sistemi. Bu kendiliğinden SSM oluşumuna yol açar.

3.3 Ölçüm membran parametreleri

SSM kalitesini kontrol etmek için, kapasite ve iletkenlik fonksiyon jeneratörü kullanılarak ölçülür.

  1. Fonksiyon jeneratörü kullanarak, iletkenlik ölçmek için 100 mV DC gerilim uygulanır.
  2. Iletkenlik hesaplayın: Mevcut çürüme membran kondansatör şarj gösterir. Kapasitör sonra tam olarak ölçülen akım verimleri Ohm kanunu kullanarak membran iletkenlik tahsil edilir. Basitlik uğruna biz cu kullanınrrent 1 saniye voltaj sonra iletkenlik G = I / ABD hesaplamak için uygulanan
  3. Genlik ve kapasite ölçmek için 0,5 Hz frekans zirve için 50 mV tepe bir üçgen AC gerilim uygulanmalıdır.
  4. Kapasite hesaplayın: elde edilen kare dalga akım genliği kapasitör şarj akımları temsil eder. Kapasite C transfer yüküne eşittir Q = ΔU = 100 mV bölünmesiyle IΔt. (Ben üçgen gerilim fark mevcut olumlu eksi negatif eğim olduğu için ΔU iki kez 50 mV uygulanan gerilimdir.)
  5. Art arda membran için yaklaşık her 10 dakikada bir elektriksel parametreler izleyin. Sabit değerler ulaşana kadar 30 ila 40 dk. 1-0,6 yaklaşık bar aralığında yüksek basınçta KPI tamponu ile arasında yıkayın.
  6. SSM kalitesi tahmin: optimal koşulların 0,1-0,2 nS ve 2-3,5 nF aralığında bulunmaktadır. 1 nF altında 0.8 nS ve düşük kapasite üzerinde bir yüksek iletkenlik gösterirSSM doğru oluşmuş olmadığını. 4 nF üzerinde bir yüksek kapasite aktif bölge SSM tarafından tamamen kapalı olmadığını anlamına gelebilir.
  7. Parametreleri uygun aralık içinde değilse, membran atılmalıdır ve başka SSM taze hazırlanmış bir elektrot çipi kullanılarak hazırlanmıştır.

Çözüm Döviz eserler için 3.4 Denetimi

Membran parametreleri kontrol edildikten sonra, ölçüm tamponlar çözüm alışverişi eserler için test edilmelidir.

  1. Sıvı sistemi için ilgili çözelti kapları yerleştirin.
  2. Manuel vanalar kullanarak, akışkan sistem hava kabarcıklarını çıkarın.
  3. Veri toplama yazılımı kullanmak, deneyde kullanmak istediğiniz akış protokolü seçti.
  4. 0,6 bar basınç ayarlayın ve ölçüm başlar.
  5. Ayrı mekanik kapak anahtarlama eserler, ideal bir eser akım ölçülmelidir ya da çok SMA olmalıdırbeklenen protein taşıma sinyalleri daha ller. Çözüm Döviz eserler gözlenmesi halinde, deney devam etmeden önce tampon kompozisyon ve / veya hazırlık işlemi optimize etmek için deneyin.

3.5 protein örnek ekleme

Ortalama proteoliposomes ya da zar parçalarının -80 ° C'de saklanır Bir ölçüm için yaklaşık 30 ul'lik bir kısım gereklidir.

  1. Olmayan bir aktive edici çözeltisi ile SSM durulayın.
  2. Buz üzerinde protein örnek çözülme.
  3. Üç 10-saniye sonikasyon döngüleri buz üzerinde 10 sn soğutma aralıklarla dönüştürülebilir. Proteoliposomes banyo sonikatör kullanarak sonicated vardır. Membran parçaları için bir ipucu sonikatör (50W, 30 kHz, 1 mm sonotrode çapı, yoğunluğu% 20, çevrim 0.5) kullanılır. Son Sonication adımdan sonra buz geri örnek koymayın, ancak küvet içinde hemen enjekte.
  4. Sökün çıkış referans elektrot asse ile birlikte konektörümontajları.
  5. Bir pipet kullanarak, protein örnek 30 ul aspire ve delik prizine pipet monte edin.
  6. Atık kaba olmayan aktive yolunda manuel vanasını açın ve küvet hacmi içine proteoliposomes enjekte. Sensör ile küvet hacmi içine hava enjekte dikkat edin.
  7. Pipet çıkarmadan önce, daha fazla çözüm akışını önlemek için el vanasını kapatın.
  8. Proteoliposomes 1 ile 2 saat bir inkübasyon süresi için SSM yapışır izin verin. Bu, gece boyunca inkübe etmek de mümkündür.

Bir SSM-tabanlı deney 3,6 Genel Prosedür

  1. 4 ° C'de saklandığında, zaman içinde ölçüm tamponlar Isınma Tüm ölçüm tamponlar eserler önlemek için ölçüm başlamadan önce oda sıcaklığında olması gerekir.
  2. Çözümler değiştirirken, ilk olmayan bir tüylenme doku ile çözüm kaplar içindeki tüpler temizleyin, sonra yeni şişe yerleştirin.
  3. Ölçüm başlamadan önce, değişen işlem evrimleşmiş olabilir hava kabarcıkları, kaldırmak için el vanaları kullanın.
  4. Sadece bir ölçüm başlamadan önce basıncını ayarlayın. Biz rutin özel valf ve boru yapılandırması, yaklaşık 1.0 ml / sn 'lik bir akış hızı sağlar 0.6 barlık bir basınç kullanımı.
  5. İlk birkaç ölçümler birbiri ardına düz bir yapılabilir ve tepe akımı sabit kalır kadar reddedilmelidir. Solüsyonları pH farklılık varsa, en az 3 dakika arasında bir inkübasyon süresi ölçümlerine başlamadan önce proteoliposomes iç pH değerini ayarlamak için gereklidir.
  6. Şimdi kurulum ölçüm için hazırdır. Gürültüyü azaltmak için en az 3 ölçüm yapılmış ve ortalaması alınmalıdır.

3.7 Kontrol Ölçümleri

Ölçümler bir dizi sırasında bir sinyal özet protein yıkımı veya adsorpsiyon bir kaybı nedeniyle oluşabilir. Her SSM deney i olmalıdıryıkık bir denetim nclude. Bu aynı çözümleri ile tekrarlanan ölçümler yapılır. En az bir özet kontrolü aynı çözeltisi kullanılarak, tek bir ölçüm başında ve deney sonunda biri anlamına gelir.

Biz deney en yüksek tepe genlik bekliyoruz koşullar altında yıkık kontrolü yapmak için tavsiye. Bu daha kolay sinyalin özet ölçmek için yapar.

Sinyal özet iki özet kontrollerin zirve amplitüdleri arasında bir karşılaştırma ile tayin edilebilir. Elde edilen yüzde değeri hatlarıyla lineer bir zaman bağımlılığı varsayılarak ölçülen sinyallerin düzeltmek için kullanılabilir.

3.8 Artifact kontrolleri

Mümkünse deney sonra ilgi inhibe protein, sonuçlarınızı doğrulamak için deneyin. Kalan sinyalleri muhtemelen çözüm Döviz eserler bulunmaktadır. Sinyallerin, daha sonra ölçülen eserler için düzeltilmesi gerekir.

  1. Saf 20-30 ml su ve% 30 etanol / 20-30 ml su ile yıkama sistemi. Sistem kullanımda değilken etanolik çözüm bakteri üremesi önler.
  2. Bu temizleme işleminden sonra, sistemden basıncı serbest bırakmak ve tüm aletleri kapatın.
  3. Faraday kafesi gelen küvet çıkarın ve bağlantısını kesmek. Küvet tüm parçaları bir banyo sonikatörü kullanılarak, gerekirse su ve saf etanol ile temizlenebilir.
  4. Saf etanol ile bir cam beher sensör çipi yerleştirin. Banyo sonikatör kullanılarak 2-1 dakika boyunca sonikasyon beher.
  5. Azot gazı altında sensör çipi kurutun.
  6. 10 mM'lik bir Octadecanthiol etanolik çözelti içinde ışıktan uzak sensör çipi saklayın. Yaklaşık 30 dakika arasında bir inkübasyon süresinden sonra sensör çipi yeniden kullanım için hazırdır.

Representative Results

Şimdiye kadar, SSM-tabanlı elektrofizyoloji çoğunlukla prokaryotik kökenli 20'den fazla taşıyıcılar, örneğin MELB 3, 4 ve NhaA PutP 5 (6 özetlenmektedir) karakterize etmek için kullanıldı. Ama aynı zamanda hücre içi zarlar ökaryotik taşıyıcılar, örneğin ClC7 7 hem de iyon kanalları, nikotinik asetilkolin reseptörü 8 araştırılmıştır örn.

Burada 5 9 bir LPR, 10 Lacy odaklı dışarı en az% 85 sağ tarafı ile proteoliposomes kullanarak Escherichia coli Lacy şeker / H + kotransportuna bir örnek ölçümleri olarak sunuyoruz. Bu taşıyıcı protein asgari bir kinetik model giden ana adımları odaklanın.

1. Wild tip Lacy Elektrofizyolojik karakterizasyonu

İlk adım, farklı pH değerinde ölçülmesi ile Elektrojenik Reaksiyon genel bir karakterizasyonu ( > Şekil 4), substrat konsantrasyonları (Şekil 5) ve alt tabakalar. Teknik doğrulamak için, literatürde verilen K M ve pKa değerleri yeniden üretildi.

Lacy arasında pH bağımlılığı iki farklı Elektrojenik reaksiyon gösterir. PH 5 ila pH 8.5 arasında, aynı zamanda, kapasitif birleştiğinde akımı arttıkça şekil değiştirir. Asidik pH değerinin, sadece hızlı bir reaksiyon Elektrojenik kalır değerleri ise alkalin koşullar altında, kararlı durum taşıma görülmektedir. Biz taşıyıcı akımları (Şekil 6) yeniden oluşturmak için devre analizi kullanılan hızlı Elektrojenik reaksiyonlardan kararlı durum sinyalleri ayırt etmek.

PH 7 'de tek fazlı sinyali iki fazlı olur. Bu aynı zamanda iki farklı Elektrojenik tepkiler olduğunu gösterir. Transfer yük (sinyallerinin integrali) tahmin edilen, iki reaksiyon yaklaşık% 6 ve taşıma döngüsünün toplam electrogenicity% 94 vardır.

Elektrojenik reaksiyonların ove_step "> 2. Atama

Lacy bir reaksiyon döngüsünde belirli adımlar için iki Elektrojenik reaksiyonları atamak için, E325A dantelli varyant (Şekil 7) ölçüldü. Bu varyant sadece laktoz Döviz gösterir ama çünkü proton sürümü inhibisyonunun, tüm aktif taşıma modları için eksiktir. Lacy E325A bir sinyal hızlı geçici temsil eder ve tüm ölçülen pH değerleri için sabittir. Sinyalin şekli ve büyüklüğü, asidik koşullar altında Lacy vahşi tip bir sinyal benzer. Ayrıca biz kapasitif birleştiğinde sistemlerinde ölçülen hızlı geçici akımlar için karakteristik olan azalan tepe akımı, sonra küçük bir negatif faz gözlemlemek. Laktoz bağlayıcı ve serbest Elektrojenik olmadığı için, hızlı geçici laktoz bağlayıcı ardından bir Elektrojenik yapısal geçiş ile ilişkili olmalıdır.

Bu proton bırakma adım hızı limiti olduğu bilinmektedirlaktoz konsantrasyonu farkı motorlu taşıma modunda Lacy ciro için ng. Proton serbest tercih edilir, çünkü bu durumda biz, alkali pH ile taşıma hızı bir artış bekliyoruz. Bu, kararlı durum nakil Lacy vahşi tip sinyal korelasyon için geçerlidir. Üstelik sadece iç pH dantelli en kararlı durum taşıma (yayınlanmamış) etkilediğini pH degrade ölçümü ile gösterilebilir. Bu nedenle büyük Elektrojenik reaksiyon proton serbest adıma atanabilir.

3. Kinetik analizi için ölçüm

Taşıma oranları ve kapalı Elektrojenik reaksiyonların belirlenmesi sonra yaklaşık 4.5 msn, yüksek zaman çözünürlüğü ile SSM Kurulum kullanılarak belirlenmiştir. Bir reaksiyon sinyal hakim Bu, koşullar altında mümkündür. Bu durumda hız sabitleri, tekrarlanan bir en küçük kareler de kullanılarak sinyallerin zaman çözünürlüğü göz önünde bulundurularak, geçici akımlar türetilebilir evrişim algoritması (Şekil 8). Belirlenen hız sabitleri hem de önerilen minimum kinetik model (Şekil 9) nihayet taşıyıcı kinetik simülasyonu için kullanılmıştır. Simüle eğrileri ek olarak kinetik model kanıtlıyor SSM verileri yeniden.

Şekil 1
Şekil 1. SSM hakkında proteoliposomes adsorpsiyonu geometrisi. SSM bir sensör çipi, yapısal bir altın kaplı cam slayt oluşur. Membran proteinlerinin Elektrojenik reaksiyonları ölçmek için, proteoliposomes veya membran parçaları SSM için emilirler. Iki geo-zar, bir kapasitif akuple sistemi oluşturur. Sadece geçici akımlar tespit edilir nedeni budur.

tp_upload/50230/50230fig2highres.jpg "/>
Şekil 2. SSM küvet sensör çipi ve referans elektrot taşır. Sensör çipi küvet taban ve küvet kafası arasında sıkışmış. Referans elektrot, bir poliakrilamid jel tuz köprüsü tarafından akış yolu izole edilir.

Şekil 3,
Şekil 3,. SSM Kur sıvı Yolu ve Elektrik Devre. Tek bir çözüm değişim protokolü sadece olmayan bir aktive (NA) ve bir aktive (A) çözümü gereklidir. Akışı iki 2 yollu vana (V1) ve bir uç kapak (V2) tarafından kontrol edilir. Olmayan aktive ve aktive çözümleri arasında Terminal vana anahtarları, küvet ve bir atık kabı (W) için başka bir çözüm için çözümlerden birini yönetiyor. Sensör çipi (SSM), yükseltici (I / U) bağlanmıştır referans elektrot (AgCl) harici elektrik devresindeki fonksiyon jeneratörü (F) bağlıyken. Bir bilgisayar (PC) ve bir arayüz kutusu kapak operasyonu ve veri toplama için kullanılır.

Şekil 4,
Şekil 4. Aktive edici çözelti 100 mM laktoz içerirken, farklı pH değerlerinde, 100 mM laktoz konsantrasyonunda atlar sonra yabani tip Lacy proteoliposomes ile ölçülmüştür geçici akımlar. Olmayan aktifleştirici çözelti 100 mM glukoz içermektedir. Bütün çözeltiler, 1 mM DTT, belirtilen pH'da 100 mM potasyum fosfat tamponu içinde hazırlanmıştır. Bu ölçüm koşulları ile ilgili ayrıntılı bilgileri ve aşağıdaki rakamlar 9 ve 10 bakınız.

ftp_upload/50230/50230fig5highres.jpg "/>
Şekil 5,. Ortalama Normalize Tepe akımları farklı konsantrasyonlarda ve pH değerlerinde laktoz konsantrasyonunda atlar sonra yabani tip Lacy proteoliposomes ile ölçüldü. K M değerleri hiperbolik uyan elde edilir.

Şekil 6,
6 Şekil. Taşıyıcı akımların İmar. Geçici akımlar (A) taşıyıcı akımları (B) yeniden oluşturmak için kullanılan pH 8.5 (mavi iz) ve pH 5.2 (kırmızı iz) de 100 mM laktoz konsantrasyonu atlar sonra vahşi tip Lacy proteoliposomes ile ölçüldü. PH 5.2 de hızlı bir Elektrojenik tepkime meydana pH 8.5 sürekli cirosu görülmektedir. Bu, açık bir şekilde yeniden akımı (B) 'de görülmektedir.

files/ftp_upload/50230/50230fig7.jpg "alt =" Şekil 7 "fo: içerik-width =" 4in "fo: src =" / files/ftp_upload/50230/50230fig7highres.jpg "/>
Şekil 7. Geçici akım pH 5.2 100 mM laktoz konsantrasyonu atlamadan sonra E325A Lacy proteoliposomes ile ölçüldü. Bu Lacy varyant taşıma döngüsünün proton serbest adımda inhibe ve bu nedenle ulaşım eksikliği olduğunu. Gözlenen küçük negatif bileşeni kapasitif olarak bağlı sistemler ölçülür hızlı geçici akımlar için karakteristik olan ve hızlı bir reaksiyon Elektrojenik sonra membran kapasitans deşarj neden olur. Bu zaman sabiti π0 sistemi (Şekil 1) kapasitans ve iletkenlikleri tarafından belirlenir.

Şekil 8,
Şekil 8. Vahşi tip Lacy proteoliposomes ile ölçülen geçici akımlar aftepH 5.2 de r farklı laktoz konsantrasyonu atlar. Bu koşullar altında herhangi bir kararlı durum ulaşım görülen, ancak laktoz üzerine bir Elektrojenik yapısal geçiş bağlama edilir. Kesikli bir çizgi, sistemin zaman çözünürlüğü temsil transfer fonksiyonunu gösterir. Ilave verilere bir hiperbolik oturuş gözlenen oranı sabit Kobs gelen hız sabitleri ve kapalı belirlenmesi gösterir. Gözlemlenen hız sabiti, tekrarlanan bir en küçük kareler ters evrişim algoritması 10 ile geçici akımlar tespit edildi.

Şekil 9,
9 Şekil. Lacy. İki Elektrojenik adımların reaksiyon döngüsü için bir kinetik model tespit ve SSM ölçümleri ile karakterize edilebilir. Tepki olarak toplam yük deplasman ~% 94 temsil eden güçlü Elektrojenik tepkidöngüsü sadece nötr ve temel pH değerlerinde görülmektedir. Bu proton serbest adım (mavi ok) atanabilir. Yabani tip Lacy devamlı bir devir inhibe edildiğinde bir zayıf Elektrojenik aşamasında asidik pH'ta görülmektedir. Biz reaksiyon döngüsünde toplam yük deplasman 6% temsil laktoz bağlama, üzerine bir Elektrojenik yapısal geçiş için bu tepki atanmış.

Discussion

1. SSM-tabanlı elektrofizyoloji avantajları geleneksel yöntemlere göre

SSM tabanlı elektrofizyoloji elektrofizyolojik araç değerli bir araç olarak kendini kanıtlamıştır. Bu kongre elektrofizyoloji, yani yama kelepçe ve gerilim kelepçe yöntemleri, uygulanamaz durumlarda özellikle yararlıdır: Apart birkaç nadir istisnalar dışında bakteriyel nakil nedeniyle bakterilerin küçük boyutu ve bu nedenle gerilim kelepçe veya yama kelepçe yöntemleri kullanılarak incelenmiştir edilemez Bu memeli hücrelerinde veya oositlerde ifade etmek zordur. Ama aynı zamanda fizyolojik ilgili memeli nakil incelenebilir. Bu durumda SSM tabanlı elektrofizyoloji hücre içi membranlardan ve nedeniyle sağlamlık ve otomasyon potansiyelinin ilaç keşfi tarama uygulamaları için taşıyıcılar için cazip.

Şeffaf SSM-basedUsing geleneksel elektrofizyoloji, zaman çözülmesi karakterizasyonuorters zordur. Nakil cirosu düşük olduğu için bir 'dev yama' ya da 'tam hücre' yapılandırma gereklidir, bir çözüm değişim deneyde bir doğal düşük zaman çözünürlüğe sahip olan. Komplikasyon fotolitik yüzey sürümü kullanılarak aşılabilir. Bununla birlikte, yüzeyler arasında sadece sınırlı sayıda bu yaklaşım için uygundur. Burada SSM'de hızlı çözüm Döviz keyfi maddeleri kullanarak yüksek zaman çözünürlüğü ile elektrofizyolojik çalışmalar yapmak için eşsiz bir fırsat sunuyor.

2. Sınırlamalar ve kritik adımlar

Yama kelepçe ve voltaj-kıskaç teknikleri aksine, SSM-tabanlı elektrofizyoloji potansiyel bir uygulamak için kullanılamaz. Transporter karakterizasyonu bu nedenle membran potansiyeli güvenmeyin modları taşıma ile sınırlıdır.

Genel olarak, SSM tabanlı elektrofizyoloji (Elektrojenik) taşıyıcı türüne ilişkin herhangi bir sınırlama vardır. Ama gerilim clbağlayıcı proteinler gibi hücre içi bileşenleri protein işlevleri için ise amfi veya yama kelepçe yöntemleri, avantajları olabilir.

Çözüm Döviz büyük eser akımları oluşturursa Sınırlamalar, ortaya çıkabilir. Alt tabaka lipofilik bileşiklerin durumunda olduğu gibi, SSM ile güçlü bir etkileşim meydana gelir. Artefaktı kontroller ölçülen sinyallerin düzeltmek için kullanılabilir. Tüm ölçüm tampon Ayrıca yüksek tuz arka plan eserler azaltmak için kullanılabilir. Ancak durumlarda, insan yapımı büyüklüğü protein sinyali ile karşılaştırılabilir olduğu, bu obje ikinci protein ilişkili sinyal izole etmek için hemen hemen imkansızdır. Neyse ki, yüksek eserler bir optimize edilmiş bir çözüm karşılığında sıradışı.

Bir SSM tabanlı elektrofizyoloji deney başarılı gerçekleşmesi için kritik olan birkaç adım vardır. Protein numunesinin hazırlanması en önemli bir parçasıdır. Proteoliposomes kullanıldığında, emin olun reconsAnayasasının süreci yeterli LPR bir temiz, tekrarlanabilir örnek verir ve taşıyıcı doğru şekilde aydınlatmaktadır. Antikorlar olup olmadığını LPR bir ELISA deneyle dondurma kırık elektron mikroskobu ve yönünü kontrol edilebilir.

Sadece protein inkübe için en iyi parametreleri gösteren bir SSM kullanın. Protein enjeksiyonu bir başka önemli bir adımdır. Sonikasyon önemlidir ve hava kabarcıkları enjeksiyon sırasında kaçınılmalıdır. Hava kabarcıkları, sensör çip adsorbe protein örnek kaldırır, çünkü örnek inkübasyondan sonra ölçümler kendisi kritik bir öneme sahiptir. Bu nedenle her zaman çözüm değiştirdikten sonra hava kabarcıklarını çıkarmak. Yine de bir sinyal özet oluşabilir. Olası bir sinyal özet düzeltmek için, bu deney sırasında yıkık kontrolleri gerçekleştirmek için gereklidir.

3. İhtisas Sistemleri

SSM-Kur, uygulamaya göre değiştirilebilir. Ayrıca tburada mevcut tamamen farklı, son derece uzmanlaşmış kurulumları vardır.

PH degrade altında örneğin asimetrik koşullar altında protein sinyalleri ölçmek için olasılığı vardır. Üçüncü bir çözüm içinde ve proteoliposomes dışında asimetrik tampon kompozisyonlar kurmak, dinlenme çözüm, ortaya konulmak zorundadır ve bu bir çift değişim yapılandırma gerektirir. Burada olmayan aktive ve dinlenme çözümleri arasında geçiş ek bir üç yollu vana gereklidir.

Biz terminal kapak eksik, ancak küvet farklı bir türü kullanılarak bir alternatif akım yolu geliştirilen sistemin zaman çözünürlüğü artırmak için. Burada aktive olan ve olmayan aktive çözüm kavşak SSM önünde 3 mm, küvet içinde yer almaktadır. Bu kurulum iyi hızlı ulaşım süreçlerinin kinetik analizi için uygundur. Bu 2 msn gibi düşük bir zaman çözünürlüğü mümkün olduğu gösterilebilir.

Ticari fully otomatik sistemler ilaç tarama için daha yüksek verim amaçlayan mevcuttur. Bir hareketli birim çözümler toplar ve standart bir mikrotiter levha formatında 96-yuvalı plakalar içinde sensör yüzeye enjekte eder.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

Biz destek ve yararlı tartışmalar için dantelli ölçümleri ve E. Bamberg katkı J. Garcia-Celma, ben Smirnova ve R. Kaback teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Waterbath Sonicator Bandelin RK 52 H
Tip Sonicator Hielscher Ultrasonics GmbH UP50H
2-way valve NResearch, West Caldwell, USA NR225T011
Terminal valve NResearch, West Caldwell, USA NR225T031
Manometer Greisinger electronics GDH 14 AN
Faraday cage Max Planck Institute of Biophysics
Cuvette Max Planck Institute of Biophysics
100 ml solution containers Kartell 1623
O-rings Seal Science Inc.
Oscilloscope Tektronix TDS 1002
Reference electrode Max Planck Institute of Biophysics
Function generator Max Planck Institute of Biophysics
Tubings SAINT-GOBAIN Performance Plastics AAC00006
Sensor chip Fraunhofer Institut für Schicht und Oberflächentechnik
Interface box Max Planck Institute of Biophysics
Amplifier Keithley 427
Manual cog Vygon GmbH 876
USB analog-to-digital converter National Instruments 6009
Regeants
1,2‑Diphytanoyl-sn-glycero-3-Phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids, Inc. 850356
Acrylamide/Bis-acrylamide Sigma Aldrich A3574
Ammonium persulfate Sigma Aldrich A3678
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich G8270
Dithiothreitol Sigma Aldrich 43819
Ethanol absolut VWR AnalaR NORMAPUR 603-002-00-5
Natural E. coli lipids polar extract Avanti Polar Lipids, Inc. 100600 for LacY reconstitution
n-Decane Sigma Aldrich D901
Octadecanethiol Sigma Aldrich O1858
Octadecylamine Sigma Aldrich 74750
Potassium chloride Merck 1049360500
Potassium phosphate dibasic Sigma Aldrich P3786
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P9791
Tetramethylethylenediamine BIO RAD 1610801
α-Lactose monohydrate Sigma Aldrich L8783

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seifert, K., Fendler, K., Bamberg, E. Charge transport by ion translocating membrane proteins on solid supported membranes. Biophys. J. 64, 384-391 (1993).
  2. Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. SSM-based electrophysiology. Methods. 46, 97-103 (2008).
  3. Garcia-Celma, J. J., et al. Rapid activation of the melibiose permease MelB immobilized on a solid-supported membrane. Langmuir. 24, 8119-8126 (2008).
  4. Mager, T., Rimon, A., Padan, E., Fendler, K. Transport mechanism and pH regulation of the Na+/H+ antiporter NhaA from Escherichia coli: an electrophysiological study. J. Biol. Chem. 286, 23570-23581 (2011).
  5. Zhou, A., et al. Charge translocation during cosubstrate binding in the Na+/proline transporter of E.coli. J. Mol. Biol. 343, 931-942 (2004).
  6. Ganea, C., Fendler, K. Bacterial transporters: charge translocation and mechanism. Biochim. Biophys. Acta. 1787, 706-713 (2009).
  7. Schulz, P., Werner, J., Stauber, T., Henriksen, K., Fendler, K. The G215R mutation in the Cl-/H+-antiporter ClC-7 found in ADO II osteopetrosis does not abolish function but causes a severe trafficking defect. PLoS ONE. 5, e12585 (2010).
  8. Schulz, P., Dueck, B., Mourot, A., Hatahet, L., Fendler, K. Measuring ion channels on solid supported membranes. Biophys. J. 97, 388-396 (2009).
  9. Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. Electrophysiological characterization of LacY. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 7373-7378 (2009).
  10. Garcia-Celma, J. J., Ploch, J., Smirnova, I., Kaback, H. R., Fendler, K. Delineating electrogenic reactions during lactose/H+ symport. Biochemistry. 49, 6115-6121 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics