Author Produced

Introduction à la membrane solide étayée par électrophysiologie

Biology
 

Summary

Nous présentons ici une méthode électrophysiologique basé sur membranes supportées solides en mettant l'accent sur ses applications pour la caractérisation des transporteurs membranaires électrogènes.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bazzone, A., Costa, W. S., Braner, M., Călinescu, O., Hatahet, L., Fendler, K. Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology. J. Vis. Exp. (75), e50230, doi:10.3791/50230 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

La méthode électrophysiologique nous présentons est basée sur une membrane solide supporté (SSM) composée d'une couche octadécanethiol chimisorbée sur une puce de capteur revêtu d'or et une monocouche de phosphatidylcholine sur le dessus. Cet ensemble est monté dans un système de cuve contenant l'électrode de référence, un fil d'argent chlorée.

Après adsorption de fragments de membrane ou des protéoliposomes contenant la protéine de membrane d'intérêt, un échange de solution rapide est utilisé pour induire l'activité de transport de la protéine de membrane. Dans l'unique solution change protocole deux solutions, l'une non-activation et une solution d'activation, sont nécessaires. Le débit est régulé par l'air sous pression et un système de vanne et le tube intérieur d'une cage de Faraday.

La cinétique de l'activité de transport électrogène est obtenue par l'intermédiaire d'un couplage capacitif entre le MSS et les protéoliposomes ou des fragments de membrane. La méthode, par conséquent, ne cède que transient courants. Le courant de crête représente l'activité de transport fixe. Les courants de transporteur en fonction du temps peuvent être reconstruites par l'analyse du circuit.

Cette méthode est particulièrement adaptée pour les transporteurs procaryotes ou des eucaryotes transporteurs de membranes intracellulaires, qui ne peuvent être étudiés par patch-clamp ou des méthodes de serrage de tension.

Introduction

Ici, nous démontrons une nouvelle approche électrophysiologique basé sur une membrane solide supporté (SSM) pour la caractérisation des protéines membranaires électrogènes.

Le support solide est constitué d'une couche mince d'or sur une lame de verre, la puce de capteur. La surface de l'or hydrophile est utilisé pour lier le groupe thiol d'un réactif alcanethiol. Ensuite, auto-assemblage d'un monolyer de phosphatidylcholine achève la formation de la SSM.

Pour mesurer les réactions électrogènes de protéines membranaires, protéoliposomes ou des fragments de membranes sont adsorbées à la SSM (Figure 1). La protéine contenant la membrane et le MSS former ensuite un système de membrane à couplage capacitif. Par conséquent, la translocation de charge à la membrane contenant des protéines peut être détecté par couplage capacitif via le SSM. Cette méthode ne donne que des courants transitoires. Le courant de crête représente l'activité de transport fixe. Le temps cu transporteur dépendrrents peuvent être reconstruites par l'analyse du circuit.

La puce de capteur est monté dans un système de cuve (figure 2). La cuve a un volume de cuve cylindrique de 17 pi (volume net avec o-ring monté). Une broche de contact à ressort crée le contact à l'amplificateur. Un raccord de sortie est vissé à la partie supérieure de la partie principale et porte l'électrode de référence, un fil d'argent chlorée.

La cuvette est montée dans une cage de Faraday. Elle est reliée à un passage de fluide, qui est utilisé pour induire l'activité de transport de la protéine de la membrane en réponse à un échange de solution rapide (figure 3). Dans l'unique solution change protocole deux solutions, l'une non-activation et une solution d'activation, sont obligatoires. Le débit est régulé par l'air sous pression à l'aide d'un logiciel de commande de soupape sur un ordinateur ou un commutateur manuel sur un boîtier d'interface.

Protocol

1. Mise en place d'un dispositif pour SSM à base d'électrophysiologie

Des détails sont donnés dans deux de nos publications techniques, qui contiennent également des schémas et des photographies de nos cuves et mis en place 1, 2. Différentes configurations de change de solution et les protocoles de flux sont également abordés dans notre document de la méthode 2.

Dans ce qui suit, nous ajoutons quelques améliorations récentes et les détails techniques qui ont un rapport direct à la vidéo de présentation.

Vanne de régulation et d'acquisition de données

Le boîtier d'interface contient un / interface commerciale USB numérique sortie analogique (NI USB 6009 de National Instruments) et les pilotes de la vanne. Il contrôle le débit de la solution et est responsable de l'acquisition des données. Les vannes sont normalement entraînés avec 12 V. Cependant, pour la commutation rapide des vannes peuvent être commandées avec une tension allant jusqu'à 18 V. Dans la vidéo, nous utilisons une alimentation de 12 V. </ P>

Le circuit de commande de la valve peut fonctionner quatre soupapes. Il a été fabriqué par l'atelier de l'Institut Max Planck de biophysique. Les soupapes peuvent être commandées par ordinateur ou manuellement via les interrupteurs sur le panneau avant. Ce dernier est commode nettoyage-procédures-et rinçage. Pendant la mesure, le boîtier d'interface est contrôlée par ordinateur en utilisant une commande de la vanne et le logiciel d'acquisition de données (2 R surfe logiciel, IonGate Biosciences).

2. Préparatifs

Dans cette section, les différents protocoles pour la préparation d'une expérience électrophysiologie SSM à base sont mentionnés.

Faire 2.1 la solution de lipide pour la formation du SSM

  1. Mélanger 25 pl Octadecylamine (5 mg / ml dans le chloroforme) et 375 Diphytanoylphosphatidylcholine ul (20 mg / ml dans le chloroforme) dans un flacon de verre.
  2. L'utilisation d'un évaporateur rotatif et le flux continu de gaz d'azote, on évapore le chloroforme pourenviron 30 min.
  3. Retirez le lipidique sur les parois de la fiole de verre en le secouant avec 500 pi de n-décane. La concentration finale en lipides est de 15 mg / ml avec de 1:60 (p / p) octadécylamine.
  4. Transférer la solution dans le flacon de stockage en verre. Conserver la solution de lipide à -20 ° C.

2.2 La chloration de l'électrode de référence

Les électrodes de référence doivent être chloré dans des intervalles réguliers due à l'abrasion.

  1. Retirer le reste de l'ancienne couche de silverchloride utilisant du papier abrasif fin avant le processus de chloration.
  2. Placer le fil d'argent avec une électrode de platine dans une solution d'acide chlorhydrique 1 M et chlorer pendant 15 min à 0,5 mA. Après avoir effectué la chloration, le fil d'argent change de couleur pour une couleur gris foncé homogène.

2.3 Préparation du pont sur gel de polyacrylamide

  1. Préparer une solution contenant 100 mM KPi à pH = 7, 100 mM de KCl et 6% D'acrylamide.
  2. Ajouter 0,3% APS (10% actions) et 0,6% TEMED et mélanger rapidement la solution avec une pipette.
  3. Immédiatement après le mélange de la solution, utiliser une pipette pour injecter 30 ul du mélange dans le récipient de pont de gel vide. Il est important d'éviter les bulles d'air lors de l'injection.
  4. Pendant un temps d'incubation de 20 min, le gel polymérise.
  5. Après polymérisation, le pont de gel est stocké dans une solution (KPI 100 mM pH 7, 100 mM KCl). Pour prolonger la durée de vie du pont de gel, la solution est conservée à 4 ° C.

2.4 Préparation des solutions de mesure

En raison de la forte interaction des solutés avec le SSM, des artefacts électriques sont produites lorsque des solutions de composition différente sont échangés. Par conséquent, la préparation des solutions est une étape cruciale. Prenez les précautions suivantes pendant le processus de préparation de la solution pour réduire les artefacts de change de la solution.

  1. Faire de non-activation et activer des solutions d'un lot, d'ajuster le pH et la force ionique.
  2. Fond riche en sel contribue à réduire les artefacts de change de la solution.
  3. Diviser la solution de lot en deux volumes.
  4. Ajouter le composé d'activation de la solution d'activation. Utilisation d'un composé de compensation dans la solution non-activation pour maintenir l'osmolarité et la force ionique des deux solutions aussi semblables que possible.
  5. Si les solutions sont conservées à 4 ° C, assurez-vous que toutes les solutions ont atteint la température ambiante avant de commencer une mesure, parce que même de petites différences de température peuvent produire des artefacts.

3. Une expérience électrophysiologie SSM basée

Nous présentons ici un protocole typique pour une expérience électrophysiologique SSM basée.

3.1 Préparation de l'installation de SSM

Bien que la configuration de la SSM n'est pas utilisé, les tubes sont remplis avec un 30% d'éthanolSolution / eau afin d'éviter la prolifération bactérienne.

  1. Laver le système avec de l'eau pure pour éliminer l'éthanol à partir de la tuyauterie avant le montage de la cuvette. Remplacer les conteneurs d'éthanol avec des conteneurs d'eau. Utilisation de haute pression (0,6 à 1,0 bar) nettoyer le système avec 20-30 ml d'eau.
  2. Répétez la procédure de nettoyage en utilisant un tampon de 100 mM KPi à pH 7,6 ou solution non-activation.
  3. Assurez-vous qu'aucune bulle d'air dans le système de fluide.

3.2 Montage de la cuvette

  1. Fixer un joint torique à l'électrode de référence
  2. Prenez le pont de gel de la solution de stockage et connectez l'électrode de référence.
  3. Le raccord de sortie avec un tampon non-activation de pré-remplissage, à insérer un joint torique et relier le pont gel pour achever l'assemblage de l'électrode de référence. Faites attention à ce qu'aucune bulle d'air sont à la jonction du pont de gel et de la voie d'écoulement de la solution de sortie.
  4. Prémonter la partie principale de la cuve,TTE par adjonction de la broche de contact à ressort (connexion à l'amplificateur), le tube d'entrée (connexion à la valve de terminal), le joint torique (l'étanchéité de la SSM) et les vis.
  5. Utilisation d'une pince à épiler, prendre la puce de capteur de la solution de stockage (10 octadécanethiol mM dans l'éthanol).
  6. Avec une pipette, laver la solution restante avec env. 5 ml d'éthanol pur.
  7. Sécher l'électrode sous azote gazeux.
  8. Placer la puce de capteur avec précision sur la partie de base de la cuvette de telle sorte que l'orifice d'entrée de l'alésage de la partie principale de la cuve est dirigé vers la zone active circulaire du capteur.
  9. Ajouter 1 ul de la solution lipidique à la surface active de la puce de capteur. Assurez-vous que la couche d'or est entièrement couverte par le lipide.
  10. Immédiatement après l'ajout de la solution de lipide, fermer la cuve par l'addition de la partie principale préassemblé.
  11. Avant de monter la cuvette dans la cage de Faraday, assurez-vous que toutes les surfaces soient complètement sèches.
  12. Connect l'amplificateur à la broche de contact à ressort et le tube d'entrée de la soupape de raccordement. Fixez ensuite la cuvette avec les vis à l'intérieur de la cage de Faraday.
  13. Visser le raccord de sortie vers le haut de la cuvette. Enfin relier le tube de sortie pour le raccord de sortie et le générateur de tension à l'électrode de référence.
  14. Immédiatement après le montage laver la cuve du système avec un tampon à 0,6 bar. Cela conduit à la formation de SSM spontanée.

3.3 Paramètres de la membrane de mesure

Pour vérifier la qualité de la SSM, la capacité et de la conductance sont évalués en utilisant le générateur de fonction.

  1. Utilisation du générateur de fonction, appliquer 100 mV tension continue de mesurer la conductance.
  2. Calculer la conductance: La décroissance du courant montre la charge de la capacité de la membrane. Après le condensateur est complètement chargée, les rendements actuels de mesure de la conductance de la membrane en utilisant la loi d'Ohm. Par souci de simplicité, nous utilisons le current 1 seconde après que la tension est appliquée pour calculer la conductance G = I / U.
  3. Appliquer une tension alternative triangulaire de 50 mV crête à crête d'amplitude et d'une fréquence de 0,5 Hz à mesurer la capacité.
  4. Calcul de la capacité: L'amplitude du courant d'onde carrée qui en résulte représente les courants de charge du condensateur. La capacité C est égale à la charge transférée Q = IΔt divisé par ΔU = 100 mV. (ΔU est le double de la tension appliquée de 50 mV parce que j'ai est la différence pente positive moins courant négatif de la tension triangulaire.)
  5. Surveiller les paramètres électriques de la membrane de façon répétée toutes les 10 minutes pendant env. De 30 à 40 min, jusqu'à ce que des valeurs constantes sont atteintes. Laver avec du tampon entre en KPi à haute pression dans la plage d'environ 0,6 à 1 bar.
  6. Estimer la qualité de la SSM: Les paramètres optimaux sont dans la gamme de 0,1 à 0,2 Ns et de 2 à 3,5 nF. Une conductance élevée au-dessus de 0,8 ns et une faible capacité inférieure à 1 nF indiqueque le MSS n'est pas correctement formé. Une capacité élevée au-dessus de 4 nF peut signifier que la zone active n'est pas complètement couvert par le SSM.
  7. Si les paramètres ne sont pas dans la plage optimale, la membrane doit être jeté et un autre SSM préparé, en utilisant une puce d'électrode fraîchement préparée.

3.4 Vérification des artefacts de change de la solution

Après les paramètres de la membrane ont été vérifiés, les tampons de mesure doivent être testés pour des objets d'échange de solution.

  1. Insérer les récipients de solution respectives pour le système de fluide.
  2. Retirer les bulles d'air du système de fluide, en utilisant les vannes manuelles.
  3. Utilisation du logiciel d'acquisition de données a choisi le protocole de flux que vous souhaitez utiliser dans votre expérience.
  4. Régler la pression à 0,6 bar et lancer la mesure.
  5. Mis à part les artefacts de commutation de valve mécanique, idéalement, pas de courants d'artefacts doivent être mesurés ou ils devraient être beaucoup smaller que les signaux de transport de protéines attendus. Si les artefacts de change de solution sont observés, essayer d'optimiser les compositions de tampon et / ou la procédure de préparation avant de poursuivre l'expérience.

3,5 ajouter l'échantillon de protéine

Habituellement protéoliposomes ou des fragments de membranes sont conservés congelés à -80 ° C. Pour une mesure d'une aliquote d'environ 30 pi est nécessaire.

  1. Rincer le SSM avec une solution non-activation.
  2. Décongeler l'échantillon de protéine sur la glace.
  3. Trois 10 sec cycles de sonication sont alternées avec 10 sec intervalles de refroidissement sur glace. Protéoliposomes sont traitées par ultrasons à l'aide d'un bain sonique. Pour des fragments de membrane d'un appareil à ultrasons de la pointe (50 W, 30 kHz, 1 mm de diamètre de la sonotrode, l'intensité de 20%, le cycle 0,5) est utilisé. Après la dernière étape de sonication ne pas mettre l'échantillon de retour sur la glace, mais l'injecter immédiatement dans la cuvette.
  4. Dévissez le connecteur de sortie avec l'électrode de référence assembly.
  5. Avec une pipette, aspirer 30 pl de l'échantillon de protéines et de monter la pointe de la pipette à l'alésage de sortie.
  6. Ouvrir la vanne manuelle de la voie non-activation pour le conteneur de déchets et de les injecter dans le volume protéoliposomes cuvette. Veillez à ne pas injecter de l'air dans le volume cuvette avec le capteur.
  7. Avant de retirer la pointe de la pipette, fermer la vanne manuelle pour éviter d'autres flux de solution.
  8. Laisser les protéoliposomes d'adsorption sur le SSM pour une durée d'incubation de 1 à 2 heures. Il est également possible d'incuber pendant la nuit.

3.6 Procédure générale d'une expérience basée sur SSM

  1. Réchauffez les tampons de mesure dans le temps, s'il est conservé à 4 ° C. Tous les tampons de mesure doivent être à température ambiante avant de commencer la mesure pour éviter les artefacts.
  2. Lors du changement de solutions, d'abord nettoyer les tubes à l'intérieur des récipients de solution avec un tissu non-fuzzing, puis insérer les nouvelles bouteilles.
  3. Avant de démarrer la mesure, utilisez les vannes manuelles pour enlever les bulles d'air, qui pourrait avoir évolué à partir de la procédure de changement.
  4. Régler la pression juste avant le démarrage d'une mesure. On utilise couramment une pression de 0,6 bar, qui dans notre vanne et le tube spécifique configuration donne un débit d'environ 1,0 ml / sec.
  5. Les premières mesures peuvent être effectuées directement l'un après l'autre et doivent être rejetées jusqu'à ce que le courant de crête reste constante. Si les solutions proposées diffèrent dans pH un temps d'incubation d'au moins 3 min est nécessaire pour ajuster le pH interne des protéoliposomes avant de commencer la mesure.
  6. Maintenant, la mise en place est prêt pour la mesure. Pour réduire le bruit au moins 3 mesures doivent être prises et une moyenne.

3.7 Mesures de contrôle

Un récapitulatif du signal lors d'une série de mesures pourrait se produire en raison de la dégradation des protéines ou une perte d'adsorption. Chaque expérience de SSM dois-jenclure un contrôle de diminution des effectifs. Cela se fait par des mesures répétées avec des solutions identiques. Les moyens de commande de vissage minimale une mesure au début et l'autre à la fin de l'expérience, en utilisant la même solution.

Nous vous recommandons de faire le contrôle de diminution des effectifs dans des conditions où que vous attendez le plus haut pic d'amplitude dans l'expérience. Cela rend plus facile à quantifier la diminution des effectifs du signal.

La diminution des effectifs du signal peut être quantifiée par une comparaison des amplitudes des pics des deux contrôles délabrés. Le pourcentage ainsi obtenu peut être utilisé pour corriger les signaux mesurés par l'hypothèse d'une dépendance du temps linéaire de la diminution des effectifs.

3.8 Contrôles d'artefacts

Si possible, essayez de valider vos résultats par inhibition de la protéine d'intérêt après l'expérience. Signaux restants sont probablement des artefacts de change de la solution. Les signaux doivent alors être corrigées pour les objets mesurés.

  1. Laver le système avec de 20 à 30 ml d'eau pure et de 20 à 30 ml d'éthanol 30% / eau. La solution éthanolique d'éviter la croissance bactérienne lorsque le système n'est pas en cours d'utilisation.
  2. Après cette opération de nettoyage, relâchez la pression du système et de désactiver tous les instruments.
  3. Retirer la cuvette de la cage de Faraday et démonter. Toutes les parties de la cuve peuvent être nettoyés avec de l'eau et de l'éthanol pur, si nécessaire, en utilisant un bain de sonication.
  4. Placer la puce de capteur dans un bécher de verre avec de l'éthanol pur. Soniquer le bécher pendant environ 1 à 2 min à l'aide d'un bain de sonication.
  5. Sécher la puce de capteur sous azote gazeux.
  6. Conserver la puce de capteur à une distance de la lumière dans une solution éthanolique Octadecanthiol 10 mM. Après un temps d'incubation d'environ 30 minutes, la puce de détecteur est prêt à être réutilisé.

Representative Results

Jusqu'à présent, SSM basée électrophysiologie a été utilisé pour caractériser plus de 20 transporteurs, principalement d'origine procaryotes, par exemple MELB 3, 4 et NHAA PutP 5 (résumé dans 6). Mais aussi des transporteurs eucaryotes à partir membranes intracellulaires, par exemple ClC7 7 ainsi que les canaux ioniques, par exemple le récepteur nicotinique de l'acétylcholine 8 ont été étudiés.

Ici, nous présentons comme un exemple des mesures du sucre / H + cotransporter LacY d'Escherichia coli en utilisant protéoliposomes avec au moins 85% à droite sur orientée LacY à un LPR sur 5 9, 10. Nous nous concentrons sur les principales étapes menant à un modèle cinétique minimale de cette protéine de transport.

1. Caractérisation électrophysiologique de type sauvage LacY

La première étape est une caractérisation générale de la réaction électrogène par la mesure de différentes valeurs de pH ( > Figure 4), les concentrations de substrat (Figure 5) et de substrats. Pour valider la technique, les valeurs pK K M et donné dans la littérature ont été reproduites.

La dépendance au pH de LacY montre deux réactions différentes électrogènes. Le courant augmente couplage capacitif entre pH 5 et pH 8,5, mais aussi des changements de forme. Dans des conditions alcalines transport de l'état d'équilibre est observé, tandis que pour les valeurs de pH acide seulement une réaction rapide électrogène reste. Pour distinguer les signaux de l'état d'équilibre des réactions rapides électrogènes, nous avons utilisé l'analyse des circuits de reconstruire les courants de transporteur (Figure 6).

A un pH de 7 le signal monophasique devient biphasique. Cela indique également qu'il ya deux réactions différentes électrogènes. Estimée à partir de la charge transférée (intégrale des signaux), les deux réactions ont environ 6% et 94% de la electrogenicity totale du cycle de transport.

ove_step ". Affectation des réactions électrogènes> 2

Pour attribuer les deux réactions électrogènes à des étapes particulières du cycle de réaction de dentelle, la variante LacY E325A a été mesurée (Figure 7). Cette variante ne montre échange lactose mais est insuffisante pour tous les modes de transport actifs, en raison de l'inhibition de la libération de protons. Le signal de E325A LacY représente un transitoire rapide et constante pour toutes les valeurs de pH mesurées. La forme et l'amplitude du signal est semblable au signal de type sauvage LacY dans des conditions acides. En outre, nous observons une petite phase négative après le pic de courant en baisse, ce qui est caractéristique pour les courants transitoires rapides mesurées dans les systèmes de couplage capacitif. Parce contraignant lactose et la libération n'est pas électrogène, le transitoire rapide doit être en corrélation avec une transition conformationnelle électrogène suite lactose contraignant.

On sait que l'étape de libération du proton est le taux limiting pour LacY chiffre d'affaires dans le gradient mode de transport axée sur la concentration en lactose. Dans ce cas, nous nous attendons à une augmentation de la vitesse de transport à pH alcalin, parce libération de protons est favorisée. C'est le cas pour le transport à l'état stable signal du type sauvage LacY corrélées. En outre, il a pu être démontré par la mesure de gradient de pH que seul le pH interne influe sur le transport à l'état stable de LacY (inédit). Par conséquent, la grande réaction électrogène pourrait être confiée à l'étape de libération de protons.

3. Mesures pour l'analyse cinétique

Après l'identification des réactions électrogènes sur et en dehors des tarifs de transport ont été déterminés en utilisant une configuration de SSM avec une haute résolution temporelle de l'ordre de 4,5 ms. Cela n'est possible que dans des conditions de réaction quand on domine le signal. Dans ce cas, les constantes de vitesse peuvent être obtenus à partir des courants transitoires à l'examen de la résolution temporelle des signaux en utilisant un processus itératif des moindres carrés de algorithme de convolution (Figure 8). Les constantes de vitesse déterminées ainsi que le modèle cinétique minimale proposée (Figure 9) a finalement été utilisées pour la simulation de la cinétique des transporteurs. Les courbes simulées reproduisent les données de SSM qui prouve en outre le modèle cinétique.

Figure 1
Figure 1. Adsorption géométrie des protéoliposomes sur la SSM. La SSM est formé sur une puce de capteur, une lame de verre d'or revêtue structurée. Pour mesurer les réactions électrogènes de protéines membranaires, protéoliposomes ou fragments de membranes sont adsorbées à la SSM. Les deux membranes constituent un système couplé de manière capacitive. C'est pourquoi seuls les courants transitoires sont détectés.

tp_upload/50230/50230fig2highres.jpg "/>
Figure 2. Le MSS cuvette porte la puce de capteur et l'électrode de référence. La puce de capteur est prise en sandwich entre le fond de cuve et la tête de cuvette. L'électrode de référence est isolée de la voie d'écoulement par un pont salin sur gel de polyacrylamide.

Figure 3
Figure 3. Pathway fluide et le circuit électrique de l'installation de SSM. Dans le protocole d'échange de solution unique un non-activation (NA) et un activateur (A) solution sont nécessaires. Le flux est contrôlé par deux vannes 2 voies (V1) et une vanne de connexion (V2). Les interrupteurs de valves terminales entre les solutions non-activation et à activer, en dirigeant une des solutions à la cuvette et l'autre solution à un conteneur de déchets (W). La puce de capteur (SSM) est relié à l'amplificateur (E / G), tandis que l'électrode de référence (AgCl) est reliée au générateur de fonction (F) dans le circuit électrique extérieur. Un ordinateur (PC) et un boîtier d'interface sont utilisés pour le fonctionnement de la vanne et de l'acquisition des données.

Figure 4
Figure 4. Courants transitoires mesurés avec protéoliposomes Lacy type sauvage après 100 mm lactose concentration sauts à différentes valeurs de pH. L'solution non-activation contenait 100 mM de glucose tandis que la solution d'activation contient du lactose 100 mM. Toutes les solutions sont préparées dans du tampon phosphate de potassium 100 mM à pH indiqué avec 1 mM de DTT. Pour plus de détails sur les conditions de mesure dans ce domaine et les figures suivantes veuillez vous référer à 9 et 10.

ftp_upload/50230/50230fig5highres.jpg "/>
Figure 5. Des courants normalisée moyenne mesurée avec protéoliposomes Lacy type sauvage après des sauts de concentration en lactose à différentes concentrations et les valeurs de pH. Les valeurs K m sont obtenues à partir des crises hyperboliques.

Figure 6
Figure 6. Reconstruction des courants de transporteur. Les courants transitoires (A) utilisé pour reconstruire les courants de transporteur (B) ont été mesurées avec protéoliposomes Lacy type sauvage après 100 mm lactose concentration sauts à pH 8,5 (bleu trace) et pH 5,2 (trace rouge). À pH 8,5 chiffre d'affaires continue est observée alors à pH 5,2 une réaction rapide électrogène survient. Ceci est clairement observé dans le courant reconstruit (B).

files/ftp_upload/50230/50230fig7.jpg "alt =" Figure 7 "fo: content-width =" 4in "fo: src =" / files/ftp_upload/50230/50230fig7highres.jpg "/>
Figure 7. Courant transitoire mesurée avec E325A protéoliposomes Lacy après une mM lactose concentration saut 100 à pH 5,2. Cette variante LacY est inhibée dans l'étape de libération de protons du cycle de transport et donc le transport déficient. La petite composante négative observée est caractéristique de courants transitoires rapides mesurés dans les systèmes à couplage capacitif et est provoqué par la décharge de la capacité de la membrane après une réaction rapide électrogène. Son π0 constante de temps est déterminée par les capacités et les conductances du système (figure 1).

Figure 8
Figure 8. Courants transitoires mesurés avec protéoliposomes Lacy type sauvage AFTEr concentration différente sauts de lactose à pH 5,2. Dans ces conditions, aucune de transport à l'état stable est observée, mais une transition conformationnelle électrogène sur lactose contraignant. La ligne en pointillés montre la fonction de transfert représentant la résolution dans le temps du système. L'encart montre la détermination de la sur et en dehors des constantes de vitesse des kobs constantes de vitesse observées avec un ajustement hyperbolique aux données. La constante de vitesse observée a été déterminée à partir des courants transitoires avec un algorithme de déconvolution itératif des moindres carrés 10.

Figure 9
Figure 9. Un modèle cinétique pour le cycle de réaction de dentelle. Deux étapes électrogènes pourrait être identifiée et caractérisée par des mesures de SSM. Une réaction fortement électrogène représente ~ 94% du déplacement total de charge dans la réactionle cycle n'est observée que pour des valeurs de pH neutres et basiques. Il pourrait être confiée à l'étape de libération de protons (flèche bleue). Une étape faiblement électrogène est observée à pH acide lorsque le roulement continu de type sauvage LacY est inhibée. Nous avons attribué cette réaction à une transition conformationnelle électrogénique sur lactose liaison, qui représente 6% de la course totale de la charge dans le cycle de réaction.

Discussion

1. Avantages de l'électrophysiologie SSM basée par rapport aux méthodes conventionnelles

Électrophysiologie SSM à base s'est avérée un outil précieux de la boîte à outils électrophysiologiques. Il est particulièrement utile dans les cas où la convention électrophysiologie, à savoir patch clamp et méthodes de serrage de tension, ne peut être appliqué: Mis à part quelques rares exceptions près transporteurs bactériens ne peuvent pas être étudiés en utilisant pince de tension ou de méthodes de patch-clamp en raison de la petite taille des bactéries et parce que ils sont difficiles à exprimer dans des cellules de mammifères ou des ovocytes. Mais aussi les transporteurs mammifères pertinentes peuvent être étudiés physiologiquement. Dans ce cas, l'électrophysiologie SSM basée est attractive pour les transporteurs de membranes intracellulaires et pour les applications de dépistage dans la découverte de médicaments en raison de sa robustesse et de son potentiel pour l'automatisation.

SSM-basedUsing électrophysiologie, le temps caractérisation conventionnelle résolu de transporters est difficile. Depuis le chiffre d'affaires des transporteurs est faible, un «correctif géant» ou une configuration «cellule entière» est nécessaire, qui ont une résolution intrinsèquement faible de temps dans une expérience d'échange de solution. La complication peut être surmonté en utilisant communiqué de substrat photolyse. Toutefois, seul un nombre limité de substrats sont adaptés à cette approche. Voici l'échange de solution rapide à la SSM offre l'opportunité unique de réaliser des études électrophysiologiques avec une haute résolution temporelle en utilisant des substrats arbitraires.

2. Limitations et les étapes critiques

Contrairement au patch-clamp et techniques de serrage de tension, l'électrophysiologie SSM à base ne peut pas être utilisé pour appliquer un potentiel. Caractérisation Transporter est donc limitée aux modes de transport qui ne reposent pas sur un potentiel de membrane.

En général, l'électrophysiologie SSM-fondé a aucune limitation concernant le type de transporteur (électrogène). Mais cl tensionamp ou un patch méthodes de serrage peut avoir des avantages, si les composants intracellulaires comme les protéines de liaison sont nécessaires pour la fonctionnalité des protéines.

Limitations peuvent survenir, si l'échange de solution crée des courants d'artefacts. Cela se produit lorsque le substrat interagit fortement avec la SSM comme dans le cas de composés lipophiles. contrôles d'artefacts peuvent être utilisés pour corriger les signaux mesurés. Fond de sel plus élevée dans tous les tampons de mesure peut être utilisée pour réduire les artefacts. Mais dans les cas où la taille de l'artefact est comparable au signal de la protéine, il est presque impossible d'isoler le signal associé à une protéine à partir de l'artefact. Heureusement, les artefacts sont élevés inhabituel dans un échange de solution optimisée.

Il ya quelques étapes qui sont essentielles pour la réalisation réussie d'une expérience électrophysiologie SSM basée. La préparation de l'échantillon de protéine est la partie la plus importante. Si protéoliposomes sont utilisés, s'assurer que les reconsprocessus de titution donne un échantillon reproductible propre d'un LPR suffisante et le transporteur est orienté dans le bon sens. Le LPR peut être vérifiée par microscopie électronique d'une fracture de gel et de l'orientation par une expérience ELISA si les anticorps sont disponibles.

Utilisez uniquement un SSM qui affiche les paramètres optimaux pour l'incubation de l'échantillon de protéine. L'injection de la protéine est une autre étape critique. Sonication est essentielle et les bulles d'air doit être évitée pendant l'injection. Après incubation de l'échantillon lui-même les mesures sont critiques, car les bulles d'air vont éliminer l'échantillon de la protéine adsorbée à partir de la puce de capteur. Il faut donc toujours éliminer les bulles d'air après le changement solutions. Néanmoins un aperçu du signal peut se produire. Pour corriger une possible diminution des effectifs du signal, il est indispensable de réaliser des contrôles dégradés au cours de l'expérience.

3. Systèmes spécialisés

Le SSM-configuration peut être modifiée en fonction de son application. En outre tici sont complètement différentes configurations hautement spécialisés disponibles.

Il ya la possibilité de mesurer des signaux de protéines dans des conditions asymétriques, par exemple sous un gradient de pH. Pour établir compositions tampons asymétriques à l'intérieur et à l'extérieur des protéoliposomes une troisième solution, la solution au repos, doit être introduite et cela nécessite une configuration à double échange. Ici une vanne trois voies supplémentaire de commutation entre les solutions non-activation et de repos sont nécessaires.

Pour augmenter la résolution temporelle du système que nous avons développé une voie de circulation alternatif manque la soupape de terminal, mais en utilisant un autre type de cuvette. Ici, la jonction de la solution d'activation et de non-activation se trouve à l'intérieur de la cuve, 3 mm en avant de la SSM. Cette configuration est bien adaptée pour l'analyse cinétique des processus de transport rapides. Il a pu être démontré qu'une résolution temporelle aussi bas que 2 msec est possible.

F CommercialUlly systèmes automatisés sont disponibles visant à un débit nettement plus élevé pour le criblage de médicaments. Une unité mobile recueille les solutions et les injecte sur la surface de capteur dans des plaques à 96 puits dans un format de plaque de microtitration standard.

Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgements

Nous remercions J. Garcia-Celma, je Smirnova et R. Kaback pour les contributions à des mesures Lacy et E. Bamberg pour le soutien et discussions utiles.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Waterbath Sonicator Bandelin RK 52 H
Tip Sonicator Hielscher Ultrasonics GmbH UP50H
2-way valve NResearch, West Caldwell, USA NR225T011
Terminal valve NResearch, West Caldwell, USA NR225T031
Manometer Greisinger electronics GDH 14 AN
Faraday cage Max Planck Institute of Biophysics
Cuvette Max Planck Institute of Biophysics
100 ml solution containers Kartell 1623
O-rings Seal Science Inc.
Oscilloscope Tektronix TDS 1002
Reference electrode Max Planck Institute of Biophysics
Function generator Max Planck Institute of Biophysics
Tubings SAINT-GOBAIN Performance Plastics AAC00006
Sensor chip Fraunhofer Institut für Schicht und Oberflächentechnik
Interface box Max Planck Institute of Biophysics
Amplifier Keithley 427
Manual cog Vygon GmbH 876
USB analog-to-digital converter National Instruments 6009
Regeants
1,2‑Diphytanoyl-sn-glycero-3-Phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids, Inc. 850356
Acrylamide/Bis-acrylamide Sigma Aldrich A3574
Ammonium persulfate Sigma Aldrich A3678
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich G8270
Dithiothreitol Sigma Aldrich 43819
Ethanol absolut VWR AnalaR NORMAPUR 603-002-00-5
Natural E. coli lipids polar extract Avanti Polar Lipids, Inc. 100600 for LacY reconstitution
n-Decane Sigma Aldrich D901
Octadecanethiol Sigma Aldrich O1858
Octadecylamine Sigma Aldrich 74750
Potassium chloride Merck 1049360500
Potassium phosphate dibasic Sigma Aldrich P3786
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P9791
Tetramethylethylenediamine BIO RAD 1610801
α-Lactose monohydrate Sigma Aldrich L8783

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seifert, K., Fendler, K., Bamberg, E. Charge transport by ion translocating membrane proteins on solid supported membranes. Biophys. J. 64, 384-391 (1993).
  2. Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. SSM-based electrophysiology. Methods. 46, 97-103 (2008).
  3. Garcia-Celma, J. J., et al. Rapid activation of the melibiose permease MelB immobilized on a solid-supported membrane. Langmuir. 24, 8119-8126 (2008).
  4. Mager, T., Rimon, A., Padan, E., Fendler, K. Transport mechanism and pH regulation of the Na+/H+ antiporter NhaA from Escherichia coli: an electrophysiological study. J. Biol. Chem. 286, 23570-23581 (2011).
  5. Zhou, A., et al. Charge translocation during cosubstrate binding in the Na+/proline transporter of E.coli. J. Mol. Biol. 343, 931-942 (2004).
  6. Ganea, C., Fendler, K. Bacterial transporters: charge translocation and mechanism. Biochim. Biophys. Acta. 1787, 706-713 (2009).
  7. Schulz, P., Werner, J., Stauber, T., Henriksen, K., Fendler, K. The G215R mutation in the Cl-/H+-antiporter ClC-7 found in ADO II osteopetrosis does not abolish function but causes a severe trafficking defect. PLoS ONE. 5, e12585 (2010).
  8. Schulz, P., Dueck, B., Mourot, A., Hatahet, L., Fendler, K. Measuring ion channels on solid supported membranes. Biophys. J. 97, 388-396 (2009).
  9. Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. Electrophysiological characterization of LacY. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 7373-7378 (2009).
  10. Garcia-Celma, J. J., Ploch, J., Smirnova, I., Kaback, H. R., Fendler, K. Delineating electrogenic reactions during lactose/H+ symport. Biochemistry. 49, 6115-6121 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics