개발, 확대, * These authors contributed equally

Bioengineering

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Summary

이 프로토콜의 개발, 확대, hESCs에와 유도 만능에서 파생 된 NK 세포의 생체 내 이미징에 대해 설명합니다.

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Bock, A. M., Knorr, D., Kaufman, D. S. Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs). J. Vis. Exp. (74), e50337, doi:10.3791/50337 (2013).

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Abstract

우리는 장치가없는 방식을 사용하여 미분화 hESCs에와 유도 만능의 자연 킬러 (NK) 세포를 유도하기위한 방법을 제시한다. 이 방법은 4 주 배양 후 NK 세포의 높은 수준에 상승을 제공하고 인공 항원 제시 세포와 추가로 2 로그 확장을 겪을 수 있습니다. 이 시스템에서 개발 hESC의 및 IPSC 유래 NK 세포는 성숙한 표현형과 기능이 있습니다. 유전자 수정 NK 세포의 큰 숫자의 생산은 모두 기본 기계론뿐만 아니라 안티 종양 연구에 적용 할 수 있습니다. hESC의 유래 NK 세포의 반딧불 루시 페라 제의 발현은 비 침습적 방법은 NK 세포의 생착, 배포 및 기능을 따라 할 수 있습니다. 우리는 또한 두 개의 서로 다른 세포 집단 별도의 모니터링이 더 뚜렷하게 생체 내에서의 상호 작용을 특성화 할 수있는 이중 영상 방식을 설명합니다. 생체 내 이미징에서 파생, 확장 및 듀얼이 방법은 신뢰할 수있는 NK 세포를 생산하는 방법과 그 evalu를 제공합니다현재 NK 세포 입양 요법을 개선 할 필요가있다 ATION.

Introduction

인간 배아 줄기 세포 (hESCs에)와 유도 만능 줄기 세포 (유도 만능)는 무제한 자기 갱신과 멀티 혈통 분화 할 수있는 미분화, 만능 세포입니다. hESCs는 성공적으로 1-3 조혈 시스템의 세포를 포함한 각 세균 층의 성숙과 기능 하위 집합으로 구분되었다. 자연 킬러 (NK) 세포 기질 세포 라인 1,2,6-8와 배아 체 형성 (사채) 4,5 또는 공동 문화 hESCs는에서 파생 될 수있는 타고난 면역 시스템의 림프구이다. NK 세포는 항 바이러스 및 항 종양 기능을 보유하고 이전 항원 자극이 자신의 이펙터 기능을 수행하기 위해 필요로하지 않는 한, 악성의 넓은 범위에 적용 할 수있는 잠재력이있다. 따라서, hESC의 유래 NK 세포는 면역에 대한 세포의 매력적인 소스입니다. 또한, hESCs는에서 NK 세포의 유도는 정상적인 발달을 연구하는 유전자 의무가 시스템을 제공합니다 <EM> 체외합니다.

그들은 유전자 다루기 쉬운 시스템을 제공하기 때문에, hESC의 유래 NK 세포는 실험적으로 in vitro와 in vivo에서 NK 세포 이펙터 기능을 연구하는 최적의 모델을 제공 형광 발광 기자를 표현하기 위해 수정할 수 있습니다. hESC의 유래 NK 세포는 HIV 9 백혈병 (K562) 및 기타 암 종류 7,8 등 대상의 범위에 대한 활동을 소유한다. 그러나 능력을 효율적으로 낮은 수준, NK 세포 개발 및 항암 기능의 생체 내 연구에서 광범위한 전임상에 대한 제한, 환자를 치료 할 수있는 충분한 NK 세포는 임상 번역에 대한 중요한 장벽이 남아있다 파생한다. 여기, 우리는 hESCs는 4,5,10에서 조혈 전구 세포를 파생 스핀 EB 방식을 사용합니다. 십일일 다음 스핀 사채 28 명의 일 지류의 유무에 관계없이 NK 세포 배양에 전송됩니다. NK 세포 배양 배지에서 4 주 후에, NK 세포는 트란 있습니다인공 항원 제시 세포 (AAPCS)의 역할을 막 바인딩 된 인터루킨 21 (IL-21)을 표현하도록 수정 K562 세포와 공동 배양에 sferred. 이러한 인공 장갑차 11,12을 사용하여 말초 혈액 NK 세포의 확장을위한 프로토콜을 적응, 우리는 성숙한 표현형과 세포 독성 기능을 유지하면서 NK 세포 2 - 로그를 확장 할 수 있습니다.

개발 및 확장이 과정은 생체 내 특성의 광범위에 충분한 hESC의 유래 NK 세포를 제공합니다. 생체 연구를 위해, 우리가 표현하는 비 침습적 주입 반딧불 루시 페라 제의 장기간의 생착과 반응 속도를 모니터링 할 수 있습니다 (Fluc이 +), 생물 발광 영상을 사용하여 hESC의 유래 NK 세포. 또한, 우리는 이중 발광 또는 형광 이미징 기법을 사용하여 종양 세포와 NK 세포의 상호 작용을 따를 수 있습니다. 우리 그룹에 의해 이전 연구는 종양의 진행과 사이클을 따라 안티 종양 모델에서 생물 발광 영상을 사용생체 내 7 Fluc + K562 세포의 arance. 지금, 익스프레스 반딧불 루시 페라 제 13,14에 우리의 hESCs는 꾸민하여 우리는 최근 특징 형광 단백질, turboFP650 15을 표현 K562 종양 세포에 대한 NK 세포의 생체 분포와 인신 매매를 볼 수 있습니다. 우리는 동시에 생체 내에서 두 개의 세포 집단 (그림 1)에 따라하기 위해이 이중 리포터 시스템을 선택했습니다. 대부분의 듀얼 이미징 모델은 듀얼 - 루시퍼 시스템 왔지만, 이러한 시스템은 기술적으로 인해 coelenterazine의 배달 요구 사항에 도전 할 수있는, 기판은 대부분 Renilla의와 Gaussia 루시 페라 제 기자 16-18의 표현이 필요합니다. 형광 기자는 많은 세포 라인과 생체 구조를 쉽게 모니터링을 허용했지만, 때문에 조직과 모피자가 형광과 많은 공동의 방출 스펙트럼 사이의 중복에 생체 내 이미징에 대한 제한적인 성공을 거두었습니다mmonly GFP,는 DsRed, 그리고 TdTomato 15,19 등의 형광 기자를 사용했습니다. 이러한 우려는 더 나은 조직 투과도 및 배경 15,19에 비해 높은 특정 신호 수 원적외선 형광 단백질의 발전을 격려했다. TurboFP650이 시스템에 표시되는 형광 단백질은 원적외선 이동하고 살아있는 동물 이미징 형광 단백질과 관련된 많은 문제를 극복한다.

hESCs는에서 파생 된 NK 세포를 개발하고 확장이 방법은 우리가 더 체외에서 더 나은 현재 NK 세포 입양 요법을 개선하는 NK 세포의 기능 및 임상 적으로 중요한을 이해하는 데 필요한 생체 내에서 hESC의 유래 NK 세포를 특성화 할 수있다. 또한 유도와 IPSC 파생 NK 세포의 확장 의무이다. 이중 형광 및 발광 생물 이미징 방식은 우리가 여기에 표시 한 항 종양 모델보다 다른 시스템에 광범위하게 적용 할 수 있습니다.

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Protocol

1. 스핀 EB의 문화에 대한 TrypLE에서 hESCs는 나 유도 만능 적응

  1. 콜라게나-계대 배양에서 ES / IPS 식민지가 상대적으로 작은 경우 TrypLE와 초기 해리가 가장 잘 작동합니다. / IPS 인구 세포 있어야 시작 ES는 4~5일 이전보다 더 이상 전달하지 않습니다. TrypLE 통과 시작하기 전에 4~5일는 세포 4 일 시간 ~ 70 % 합류 할 수 있도록 밀도 ES 세포를 전달합니다. TrypLE - 계대 ES 세포의 배양을 위해 정기적 ES 미디어를 사용합니다. 여기, 우리는 안정적 루시 페라 제 리포터 구조 (자료 표)로 수정 hESCs에 사용하고 있습니다. 프로토콜은 조혈 전구 세포와 NK 세포 발달의 비교를 위해 수정되지 않은 유도 만능를 사용하여 유도 만능와 함께 작동합니다.
  2. TrypLE 통과 개시 4 일전은 정상적인 통로 프로토콜에 따라, 콜라게나 제 IV와 ES / IPS 세포를 전달합니다. 우리는 일반적으로 TrypLE와 함께 첫 번째 구절에서 1:1 전달합니다. 그에 따라 미리 ES / IPS 세포를 확장합니다.
  3. 5 세포 /도에서 6 - 잘 접시에 TrypLE 통로, 플레이트 MEFs가 개시 이전에 어느 날. TrypLE와 함께 첫 번째 구절에서 (하드 - 투 - 적응 세포주 이하의 밀도 문화 또는 2 : 1) 1:1 전달합니다. 따라서 TrypLE 문화에 넣는 계획이 모든 ES / IPS 플레이트 1 MEF 플레이트를 준비합니다.
  4. 조심스럽게 TrypLE 해리로 진행하기 전에 차별화 된 식민지 (외접 테두리를 부족 또는 섬유 모세포 / 상피 특성을 가지고있는 것) 오프 선택합니다. 차별화 된 세포는 TrypLE 통로로 비교적 쉽게 문화를 통해 걸릴 수 있습니다, 그래서 당신의 시작 인구는 매우 깨끗한 있는지 확인하는 것이 중요합니다.
  5. 우물에서 미디어를 대기음 및 1.0 ML 미리 예열 TrypLE 당 잘 선택 추가합니다.
  6. 37 ° C 배양기에서 5 분 TrypLE에 품어 ES / IPS 세포. 후 5 분, 잘 아래쪽에서 부드럽게 피펫 ES 세포.
  7. 우물에서 TrypLE 세포 현탁액을 수집하고 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다. GE를 아래로 피펫ntly 2 ~ 3 배 큰 덩어리가 떨어져 휴식을 권장합니다. 적어도 동등한 1 볼륨 ES 매체와 동등한 1 볼륨 DPBS로 TrypLE을 희석. TrypLE는 문화 매체 침묵, 그래서 접시에서 세포를 제거한 후 미디어와 DPBS로 TrypLE을 희석하는 것이 중요하지 않습니다. 우리는 ES 미디어를 저장하기 위해 세척을 위해 DPBS + 미디어를 사용하십시오.
  8. 냉장 원심 분리기 5 분 (11 ° C)에 대한 1,500 rpm으로 세포를 스핀 다운.
  9. TrypLE를 제거 할만큼 뜨는 가능한을 대기음.
  10. 4 ML ES 미디어 플러스 4 ML의 DPBS와 TrypLE의 남은 흔적을 없애 스핀을 반복있는 세포를 resuspend.
  11. 도금에 적합한 볼륨 ES 미디어에서 뜨는을 Resuspend을 대기음.
  12. 판 ES 세포 1시 1분 ES 미디어 저밀도 MEFs가에 (또는 2:1 필요하다면).
  13. 24 시간 후, 신선한 ES 매체와 세포를 공급. 대부분 부착하지 않은 많은 단일 세포있을 것입니다. ES 매체와 매일 ES 세포를 공급합니다.
  14. 신선한 MEFs가 (0.9-1 X 10에 TrypLE로 전달 (예를 들어 화요일과 금요일) 위와 같은 기본 절차를 사용하여. 일반적으로, 당신은 TrypLE 함께 전달 세포를 선택할 필요가 없습니다.
  15. 처음 몇 구절 (최대 5-10 통로), 세포 1:1 통과해야합니다. 이 세포의 확장 어려워집니다. 우리의 경험에서 ES 세포의 효율성을 도금하는 4-5 구절 주위에 극적으로 삭제하고 다음 구절 몇 이내에 다시 온다. 본문 5-7 후에, 당신은 결국 1시 3분 1:2 세포를 통과 시작할 수, 그리고 수 있습니다. 본문 20 이상, 당신 1:5 또는 1시 6분에서 세포를 통과하는 시작해야 할 수 있습니다. 판 고밀도의 첫 번째 5-10 구절에서 ES 세포를해야합니다. 일단 당신이 지점에 도착 위치를 아래로 효율적으로 충분히 그들이 통과 후, 당신은 1:2 통과 시작할 것을 시도 할 수 있고, 결국 또는 1:3 전달할 수 있어야 이틀 ~ 70 %의 합류에 도달 할 수있는 세포 판 1시 4분. 유도 만능는 특히 완전히 전에 밀도가 충분히 계대하지 않은 경우dapted, 차별화하는 경향이있다.

2. 스핀 EB 문화를 설정하는 주식 솔루션을 준비합니다

  1. IMDM 10 % BSA 용액 : 35 ML IMDM (50 ML 원뿔)에있는 BSA의 4g를 일시 중단합니다. BSA가 완전히 용해 할 수 있도록 1 ~ 2 시간 동안 실온에서 앉아 솔루션을 허용합니다. 10 %의 최종 농도를 얻기 위해 IMDM 40 ML에 전체 볼륨을 조절합니다. 시판 BSA는 ES 세포에 독성이 될 수 있습니다. 솔루션을 Deionizing은 독성의 가능성을 줄일 수 있습니다. , 탈 이온화 BSA 용액 40 ml로한다 ~ 1.3 g 수지 구슬을 추가하고 섞어 잘 흔들어 섞은합니다.
  2. 4시 장소 BSA 용액 (수지 구슬) ° C 푸른 녹색에서 (교환 용량이 소진되었음을 나타내는) 노란색 구슬 색상이 변경 될 때까지.
  3. 솔루션에게 교환을 용이하게하기 위해 모든 20 ~ 30 분 흔들
  4. 각각의 교환은 2 시간까지 걸릴 수 있습니다. 교환이 완료되면 튜브의 하단에있는 펠릿 구슬로 1,000 rpm에서 2 분간 솔루션을 원심 분리기.
  5. 삐악 삐악 울다신선한 50 ML 원뿔에 ETTE BSA, 솔루션, 구슬이 취소 할 수 떠나.
  6. 반복은 세 개 이상의 교류의 총 2.2-2.5 적어도 두 번 더 추가 단계를 반복합니다. 마지막으로 교환하는 동안, 구슬의 용량이 완전히 구슬 후에도 2 시간 배양 소진되지 않을 수 있습니다.
  7. BSA 용액 남은 구슬을 제거 살균 필터입니다.
  8. BSA 솔루션은 최소 2 개월 동안 4 ° C에서 안정적이어야한다.
  9. 5 % PVA 용액 : 측정 100 ML 밀리 포아 H 2 O 125 ​​ML 유리 병에.
  10. 물에 5g PVA를 추가합니다. 그것은 PVA가 완전히 얻을 수 있도록 물에 PVA를 추가하는 것이 중요하다 "젖은." 당신이 PVA에 물을 추가하면 PVA의 솔루션으로 이동하는, 매우 오랜 시간이 걸릴 것입니다.
  11. PVA는 즉시 용해되지 않습니다. 4 ° C 하룻밤에 자리 PVA / 물 솔루션을 제공합니다.
  12. 37 다음날 아침, 장소 PVA / 물 솔루션을 4-8 시간 동안 ° C 수조. PVA의 말에 대부분의 솔루션에 있어야합니다배양.
  13. 추가로 48 시간 동안 다시 4 ° C에서 개최 병, 또는 완전히 용해 될 때까지. 솔루션은 약간 점성 수 있습니다.
  14. PVA 솔루션은 적어도 6 주 동안 4 ° C에서 안정적이어야한다.
  15. 리놀레산과 리놀렌산 (10,000 X 솔루션) : 200 - 증거 에탄올에 희석 1 MG / ML. 10 ㎖의 에탄올 10 ㎖ 순수한 오일을 추가합니다. -20 ° C.에서 나누어지는 및 저장
  16. α-MTG 원액 1 ML의 IMDM에 희석 13 μl의 α-MTG.
  17. 아스 코르 빈산 2 - 인산 용액 (100X)는 : 5 밀리그램 / ML 솔루션을합니다. 250 MG 아스 코르 빈산 2 - 인산 50 ML 멸균, 조직 문화 학년 H 2 O 쉽게 용해.

3. BPEL 미디어 어셈블리 (~ 200 ML 전체 볼륨을위한)

  1. PVA-지질 혼합물 (이 단계 필터링 얻을 것이다 매체에 불용성 방울을 형성 PVA를 방지)합니다.
  2. 50-20 ML의 IMDM 20 ML F-12 영양 혼합물을 추가ML 원뿔 튜브.
  3. 5 % PVA 주식의 10 mL를 넣고 0.4 ML synthechol, 20 μL 리놀렌산, 200 ML BPEL 미디어 20 μL 리놀레산. 혼합에 잘 튜브를 흔들어. 기타 미디어 구성 요소를 조립하는 동안 따로 설정할 수 있습니다.
  4. 250 ML Stericup 여과 장치의 정상에 남아있는 모든 미디어 구성 요소를 추가합니다. 필요한 IMDM와 F-12 볼륨의 균형 (66 ML 각), BSA,-MTG, 100X ITS, Glutamax I, 펜 / Strep의, 단백질 무료 브리 도마 혼​​합 II, 및 아스 코르 빈산을 추가합니다. 1 단계 Stericup의 상단에 PVA-지질 혼합물을 추가합니다. 매체를 필터링합니다. 매체는 최소한 2 주 동안 4 ° C에서 안정적이어야한다. 세척 단계는 오래된 매체를 사용합니다.

4. 무대에 TrypLE - 계대 ES 세포를 설정하면 내가 EBS을 (를) 스핀

낮은 밀도 MEFs가 (적어도 5-7 시간에 TrypLE으로 계대 된 즉, ES / IPS 세포)에 통과 TrypLE 적응 된 ES / IPS 세포를 사용합니다. 세포는 2 ~ 1:3의 전달 3-4 일에 70-80% 합류 될 수있는 경우, 세포를 사용하는 것이 좋을 것이다.

  1. 이틀 스핀 EB 분화 (일 -2)를 설정하기 전에 : 그들을 차별화 설치의 날에 합류 70-80% 할 수 있도록 밀도 신선한 MEFs가에 TrypLE 적응 ES / IPS 세포를 전달합니다. 우리는 일반적으로 EB 설정을 회전하기 전에 48 시간을 전달합니다.
  2. 스핀 EB 도금을 준비하기 위해, 피펫 150 μL 멸균 각 96 - 웰 플레이트의 36 외부 우물에 증발을 최소화하기 위해 : 단계에 스핀 EB 설정 I는 차별화 (0 일) 일. 만 둥근 바닥, 낮은 첨부 96 잘 접시를 사용합니다.
  3. ES / IPS 세포 배양 매체를 대기음 및 1.0 ML 미리 예열 TrypLE 각 well에 추가를 선택합니다.
  4. 5 분 인큐베이터에 넣어 플레이트 (37 ° C). 조심스럽게 접시의 세포를 피펫.
  5. 원뿔 튜브에 해리 세포를 수집하고 덩어리를 분열하고 아래로 피펫. 1 동일한 볼륨 BPEL 미디어 적어도 동등한 1 볼륨 DPBS로 TrypLE을 희석.
  6. 상층 액을 제거하고를 resuspend을5 ML BPEL 미디어 플러스 5 ML의 DPBS에있는 세포. 스핀을 반복합니다.
  7. 예상 세포의 수에 따라 5 ~ 10 ML BPEL 미디어에서 뜨는 세포를 resuspend를 제거합니다. 70 μm의 필터 (BD 팔콘 # 352350)를 통해 수풀 (이는 EB 형성을 방해 할 수있는)를 제거하기 위해 원뿔 신선한 50 ML로 세포를 전달합니다.
  8. 필터링 세포를 계산합니다. 50 ML 원뿔 스핀으로 도금에 사용하는 나누어지는 세포. 도금 : 3000 ES 세포 / 물론 60 우물 / 판 = 1.8x10 5 ES 세포 / 판.
  9. 원심 분리 후, 세포는 3X10 4 세포 / ㎖ (100 ㎕의 양 / 음, 3000 ES 세포 /도)에 재 부유해야합니다.
  10. BPEL 미디어 볼륨 + 세포를 (이 6 ML / 판 예정) 현탁 충분한 사이토 카인을 준비합니다. 단계 I 차별화를 위해, 우리는 조혈 전구 세포의 유도를위한 SCF (40 NG / ML), BMP4 (20 NG / ML) 및 VEGF를 (20 NG / ML)를 사용합니다.
  11. 플레이트 (100) μL 세포 /도 (= 3,000 세포 /도) 준비 할 것이다의 내부 60 우물 각각에ED 96 - 웰 플레이트. 멀티 채널 피펫 멸균 통을 사용할 때 가장 쉬운 방법입니다. 세포가 가라 할 수있는 기회를하지 않아도 이렇게 빨리 통에 넣기 전에 pipetting하여 세포를 혼합하고 작동해야합니다.
  12. ~의 4 분 1,500 rpm으로, 11 ° C.에 대한 냉장 원심 분리기에서 96 - 웰 플레이트 스핀
  13. 원심 분리기에서 37 ° C 배양기에 플레이트를주의 깊게 전송합니다. 최대한 판을 방해하지 마십시오. 세포가 우물의 바닥에 균일 한 펠릿을 형성하는지 확인하기 위해 번호판을 확인합니다.
  14. 사채가 더 튼튼한 외부 층을 형성 할 때까지 나는 사채는 일 3-4 차별​​화를 통해 공급하거나 방해해서는 안 회전 무대. 사채 10-12 일 저쪽에 발송 단계에 나는 남아있을 경우, 우리는 때로는 각각의 well에 사이토 카인 50 μL 신선한 BPEL 미디어 (먼저 각 우물에서 이전 미디어의 50 μl를 꺼내)와 교환 사채를 공급. 24 시간 내에 세포는 3-D EB 구조를 형성하기 시작하며, 하루 3-5 별개의 외부 층을 가지고 있어야하고 deve을 시작낭성 구조를 loping.

5. FACS 분석을위한 해리 단계 I 사채

FACS 분석을위한 around18-36 스핀 EB를 수집합니다. 6 일 전 세포를 분석하면, 더 많은 우물 충분한 세포 수를 얻기 위해 필요합니다.

  1. 2 % 닭 혈청과 트립신의 필요한 양을 준비합니다. 37 자리까지 사용 ° C 수조.
  2. 15 ML 원뿔 튜브에 96 - 웰 플레이트에서 스핀 사채와 미디어를 전송합니다.
  3. 사채는 원뿔 튜브의 바닥에 정착하도록 허용합니다. 5 ML 피펫으로 조심스럽게 상층 액과 분리 튜브 (한 15 ML, 50 ML 원뿔 튜브에 풀 상층 액을 모두 할 수있는)로 전송을 피펫. 일부 조혈 세포가 이미 분리, 일 9 11 사이의 스핀 EB에서 출시 된 이러한 세포를 포함하는 상층 과도한 트립신을 방지합니다.
  4. 트립신의를 Resuspend 사채 + 혈청 2 % 닭 : 각 15 ML 원뿔 튜브에 3-4 ML. 37 트립신과 사채를 놓고 ° C 물 공급3-7 분 rbath. 모든 1-2 분 흔들거나 부드럽게 소용돌이. 이전 timepoints에서 (8 일 전), 교환 사채는 더 쉽게 떨어져 휴식하고 같은 작은으로 3 분 걸릴 수 있습니다. 나중에 timepoints에 (하루 8 +) 사채는 해리하는 데 시간이 오래 걸릴 수 있습니다. 우리는 일반적으로 37에서 그들보다 5 분 trypsinize하지 않습니다 ° C. 참고이 시간은 단지 가이드입니다. 특정 세포주 또는 EB 차별화 들어, EBS을 (를) 해리 다소 시간이 걸릴 수 있습니다. 밀접하게 해리를 모니터링합니다. 너무 오래 트립신으로 세포를 남겨하지 않는 것이 중요합니다. 그것은 트립신 단지 몇 가지 작은 덩어​​리가 계속 표시 해리보다는 모든 덩어리를 제거하는 시도를 중지하는 것이 좋습니다.
  5. FBS 함유 매체의 적어도 1 개의 동일한 볼륨 트립신을 끄다. 세포 (1,500 rpm으로 5 분, 11 ° C) 스핀 다운.
  6. (보통 3-5 ML) 계산을위한 매체의 적절한 볼륨 세포를 resuspend을.
  7. 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 필터 세포. 계산에 대한 세포의 나누어지는을 제거합니다. 세포로 진행표준 실험실 외과 프로토콜.

6. hPSC 유래 전구 세포에서 NK 세포의 개발, 확장, 및 특성

스핀 사채는 조혈 전구 세포의 높은 비율을 포함하기 때문에, 그들은 직접 하루 11 NK 세포 배양에 전송할 수 있습니다. 스핀 사채는 지류의 유무에 관계없이 24 잘 접시로 전송 될 수 있습니다. 우리는 각 조건에서 파생 된 NK 세포 사이의 표현형이나 기능의 차이를 보여주지있다. 그러므로, 우리는 일반적으로 NK 세포 개발을위한 완전히 정의 된 시스템을 가지고 지류없이 문화를 전송할 수 있습니다. 최적 조혈 차별화 hESC의 / IPSC 라인을 사용하는 경우 피더 레이어의 사용은 7,8를 추천합니다.

  1. 100 μL, 24 웰 플레이트로 전송 6 회전 사채로 설정 멀티 채널 피펫을 사용하여.
  2. 전송 스핀 사채 조사 100,000 (3,000 CGY) EL08-1D2을 (쥐 embryoni 포함하는 24 - 웰 플레이트에 : 지류C 간 세포 라인) 세포를 잘 당. 피더없이 : 전송 사채는 직접 24 잘 접시를 코팅합니다.
  3. 사이토 카인을 포함한 400 μL NK 분화 미디어 (IL-3, IL-15, IL-7, SCF, Flt3L, Peprotech에서 모두)를 추가 각 우물의 전체 볼륨이 ~ 1 ML 그래서.
  4. 장소 인큐베이터에있는 세포와 IL-3를 제외하고 단계 6.3의 모든 사이토 카인을 포함하는 NK 분화 매체와 모든 5-7일 피드.
  5. NK 세포는 NK 세포 분화 배양에 하루 28 다음 전송 (그림 2)에서 성숙한 표현형을 표현합니다.
  6. NK 세포의 세포 독성을 테스트하려면, 4 시간 크롬 출시 분석은 8을 수행 할 수 있습니다.
  7. 세포의 큰 숫자가 생체 내 연구에 필요한 경우 인공 항원 제시 세포 (AAPCS)와 공동 배양은 2 로그 또는 더 큰 확장을 얻을 수 있습니다. 자세한 프로토콜은 다음 웹 사이트를 방문 http://www.jove을.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood 11,12.

7. 면역 결핍 쥐에 hESC의 유래 NK 세포 및 종양 세포를 모니터링하는 생체 내 형광 및 바이오 루미 네 센트 이미징

우리의 모든 실험에서 6-8주 오래된 마우스. 우리는 nonobese 당뇨병 / 심한 감마 체인 녹아웃 (- - / NOD / SCID / γC)와 면역 결합을 사용 우리는 동시에 종양의 진행 (turboFP650 기자)와 생체 내에서 hESC의-NK 세포 동력학을 (Fluc 기자가 부모 ES 세포에서 발현) 추적하는 듀얼 이미징 모델을 사용합니다. 이 영상 방식은 여기에 표시된 항 종양 모델보다 다른 시스템에 광범위하게 적용 할 수 있습니다. IVIS 스펙트럼 (캘리퍼스 생명 과학) 동시에 생체 내 형광 및 발광 생물 이미징을위한 최적입니다.

  1. 종양 세포 주입하기 전에 24 시간, 비춘다 마우스 (225-250 CGY).
  2. 의를 Resuspend 원하는 번호200 μL Iscove에 종양 세포 (1 × 10 6 K562 세포가 표시됩니다) 20 % FBS와 보충 Dulbecco 매체 (IMDM) 수정했습니다. 종양 세포 투여가 사용 모델에 따라 변경 될 수 있습니다. TurboFP650는 비 종양 형태로 표현 될 수있다. 그것은 가장 한 해부학 적 위치로 지역화 된 세포와 이미지가됩니다.
  3. 27 또는 28 게이지 바늘을 사용하여 마우스의 왼쪽 가슴에 피하 종양 세포를 주입 4 일 동안 합치다 할 수 있습니다. 세포는 쥐의 피부 밑에 거품을 형성해야한다. 마우스는 더 주사를 시각화하기 위해 신체의이 부분에 면도 할 수 있습니다. 또한 생체 내 형광 이미징 더 나은 영역을 표시합니다. 마우스가 누운 상태에서 IP 주입 NK 세포가 가장 시각화 있기 때문에 생쥐의 가슴 주위에 주입이 모델에 사용되었습니다. 후면 또는 측면 등의 피하 배송 다른 방법은, 동물에 스트레스를 덜하고 고려되어야한다.
  4. hESC의-DERI의 수를 resuspend을300 μL Iscove의 VED NK 세포 (10 × 10 6 NK 세포가 표시됩니다) 항생제없이 20 % FBS와 보충 Dulbecco 매체 (IMDM) 수정했습니다.
  5. 27 또는 28 게이지 바늘을 사용하여 각 마우스 복강 (IP)에 hESC의 유래 NK 세포를 주입. 모든 실험, 음성 대조군으로 아무런 종양 또는 NK 세포의 주입을 수신하지 마우스 (가) 있습니다.
  6. 다음에 첫번째 7 일 동안 매일 생체 내에서 NK 세포 인구를 유지하기 위해, 생쥐 IL-2의 250 μL IP 주사 (1X10 4 U / 마우스)를주고 살균 DPBS에서 IL-15 (10 NG / 마우스) IL- 희생의 시간까지 2 만 모든 2~3일.
  7. 생물 발광 영상으로 hESC의 파생 NK 세포의 생착을 모니터링합니다. 120 μL D-루시페린 (150 ㎎ / ㎏) 각 마우스 IP를 주입한다. D-루시페린 주입 후 생쥐 10 분 이미지.
  8. 0.8 L / 분에서 상자에 isoflurane을 입력을 허용하는 챔버를 사용하여 마우스를 마취. 챔버에 산소 유량도 있는지 확인합니다.
  9. 마취 배치자신의 허리에 IVIS 스펙트럼 및 보안 생쥐에서 생쥐 테이프 또는 벨크로를 사용하여 0.5 L / 마취를 유지하기 위해 최소한의 상자에 isoflurane을 입력 할 수 있습니다.
  10. 중간, F / 1 중지하고 1 분 동안 이미지를 얻기 위해 비닝 (binning) 설정 (4-5 마우스에 대한 D, 3 개 이하의 마우스에 대한 C) 이미징 플랫폼을 해결하기 위해 IVIS 시스템을 설정합니다.
  11. turboFP650 + 세포에 대한 형광 이미징을 수행하려면 관심뿐만 아니라, 배경 신호 프로브를 측정 방출 스캔을 설정 이미징 마법사를 사용합니다. 프로브 목록에서 입력 엠 / 예는 선택할 수 있고, 올바른 여기 및 방출을 입력합니다. turboFP650의 경우, 종양의 신호와 570 여기의 배경 신호를 측정하는 640-720 방출을 측정하는 605 여기와 660-720 방출을 사용합니다. 자동 노출 설정을 사용하여 원하는 영상 플랫폼을 선택합니다. 전체 이미지 시퀀스는 일반적으로 취득하는 3-5 분 소요됩니다.
  12. 마우스가 완전히 이미징 시스템에서 이동하기 전에 마취에서 회복 할 수 있습니다. 리를 사용하여 이미지를 분석이미지 소프트웨어 패키지 버전 4.2 (캘리퍼스 생명 과학)에서 Move.
  13. 광속 (광자 / 초) 또는 평균 래디언스 (광자 / 초 / cm 2 / SR)와 동일한 축척 (그림 3)에 모든 이미지를 설정하려면 설정 관심 영역 (ROI)를 사용하여 발광 신호를 정량화. 여기에 대표적인 이미지는 각 마우스의 두 세포 집단 (그림 3)을 설명하는 데 사용됩니다. 우리 연구실의 다른 연구는이 기술을 20를 사용하여 colocalization을을 증명하고있다. colocalization을 타이밍은 사용 된 실험 모델을 기반으로 최적화해야합니다.
  14. 방출 스캔 순서에서 형광 신호를 정량화하기 위해 "스펙트럼 Unmixing"기능 생활 이미지에 사용합니다. 분석에 포함이 경우, 상부 흉부의 관심의 신호를 포함하는 마우스의 영역에 마스크를 그리려면 이미지를 선택합니다. 섞이지 할 조직 autofluorescense 알 수없는 프로브를 선택합니다. 마우스는 알팔파를 포함하는 음식을 제공하는 경우, 음식 신호는 U 수 있습니다관심과 조직의자가 형광의 프로브에서 nmixed.
  15. 결과 이미지는 조직의자가 형광 (신호가있는 지역 포함)의 균일 한 분포를 표시하지 않는 경우 제약 조건이 일치 분포와 섞이지되는 구성 요소의 더 나은 분리를 얻기 위해 설정 될 수 있습니다. 이 전형적인 특정 신호가 낮거나 주변 배경 신호 때 소프트웨어 아니며 프로브 종종 필요합니다. turboFP650에 대한 배출 곡선의 하단에 해당하는 640 nm의에 대한 업데이트 탭에서 볼 수있는 하이 패스 필터를 설정,. 로우 패스 필터 제약 조건도 설정하지만, 여기에 표시된 영상 분석을위한 불필요한 될 수 있습니다.
  16. 방사 효율 (광자 / 초 / cm 2 / SR) / μW로 설정된 관심 영역 (ROI)를 사용하여 섞이지 않은 이미지에서 형광 신호를 정량화)와 동일한 축척 (그림 3)에 모든 이미지를 설정합니다.
  17. 원하는 시점에서, 마우스는 EN을 위해 희생하고 분석 할 수 있습니다유동 세포 계측법에 의해 hESC의 파생 세포의 graftment. 복강 내로 주입 NK 세포를 위해 우리는 일반적으로 말초 혈액 (얼굴 정맥 출혈), 비장, 및 복막을 분석합니다. 복막 세척 단지 복막 막 노출 및 유리 파스퇴르 피펫은 복강에 액세스 할 수 있도록 충분히 내측 절개 빗나함으로써 수행 할 수 있습니다. 멸균 PBS 사용하여 마우스를 회전하여 철저 솔루션을 섞어 확인하고 복강 여러 세척을 수행합니다. 당신이 볼 수 펠릿 다음 원심 분리 (세척 일반적으로 5-10 ML) 할 때까지 충분히 유체 수집합니다.

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Representative Results

스핀 EB 방식을 사용하여 조혈 전구 세포의 생성은 hESCs에와 유도 만능에서 최적의 NK 세포 발달 할 수 있습니다. 그림 2에서 보여, 하루 11 회전 사채 높은 CD34를 표현 전구 세포의 비율, CD45, CD43, 및 CD31가 포함되어 있습니다. CD34 및 CD45의 높은 수준의 간질 세포를 정렬 또는 지원에 대한 필요없이 NK 조건을 직접 전송할 수 있습니다. 최적 스핀 EB 차별화가 있다면, 그것은 같은 EL08-1D2 등의 기질 세포는 보조 NK 조건에서 사용하는 것이 좋습니다. 문화 4 주간의 스핀 사채는 NK 세포 (24 - 웰 플레이트 잘 당 약 1-2 X 10 6 세포)의 큰 숫자에 상승을 제공합니다. 문화는 또한이 시스템 7에 NK 세포 개발의 점진적 진행을보고 이전 시간의 지점에서 phenotyped 할 수 있습니다. NK 세포는 따라서 부모 ES / IPS 라인에 수정 된 리포터 유전자의 발현은 그 다음에 할 수있는 유지 보수 (그림 3)에서 NK 세포와 종양 세포 모두 동시에 영상을 보여 IVIS 스펙트럼을 사용했습니다. 스펙트럼 unmixing 기능 생활 이미지 소프트웨어를 사용하여 조직의자가 형광이 찬란 세포에서 신호를 최적화하기 위해 공제 할 수 있습니다.

그림 1
그림 1. 이중 영상 방식 및 개발 타임 라인. 생체 모델의 A) 도식. 마우스가 루시페린과 IP를 주입하고 적절한 배양 시간에 따라 있으며, 반딧불 루시 페라 제 + 세포 생물 발광 신호를 몇 군데 있습니다. hESC의 - 변환 해주는 개발 및 테스트 발광 이미지 TurboFP650 + 세포에서 형광 신호를 인수 한 것은 이미지화 할 수 있습니다. B) 타임 라인ED NK 세포.

그림 2
그림 2. hESCs에와 유도 만능에서 파생 된 스핀 사채와 NK 세포의 표현형. 스핀 EB 문화에서) 다음 최대 11 일 세포 유동 세포 계측법에 의해 분석 할 수 있습니다. 하루 11 시간 포인트는 CD34의 높은 비율, CD43, CD45, 및 NK 세포 분화에 대한 최적의 CD31 발현하는 세포를 제공합니다. B) NK 세포가 NK 세포 배양 4 주 후 유동 세포 계측법을 사용하여 검색 할 수 있습니다. 림프구 게이트 (FSC / SSC 플롯) 내에서 세포는 CD56의 발현에 대한 분석됩니다. CD56 + 세포는 더 이상 같은 CD117 같은 마커 CD94, NKp46, 또는 다른 사람의 공동 발현 분석 할 수 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .


그림 3. IVIS 스펙트럼을 사용하여 생체 내 형광 및 발광 생물 이미징. 생체 모니터링이 프로토콜의 기본 목표입니다. 따라서, 생쥐 종양 통관을 위해 밖으로 따라하지 않습니다. 우리의 이전 보고서는 (200,000 K562 세포를 사용하여)은 종양의 정리 3 주에서 7 발생을 보여줍니다.의) 바이오 루미 네 센트 영상 Fluc + hESC의 유래 NK 세포 주입이 맨 윗줄에 표시 한 후 0 일, 7 일 및 14 일에 NK 세포를. TurboFP650의 형광 영상 + 0 일, 7, NK 세포 주사 후 14 K562 세포는 맨 아래 행에 표시됩니다. 형광 이미지는 발광 영상 획득 직후에 인수되었다. B) 시퀀스 보여주는 조직의자가 형광과 turboFP6에서 형광 신호50 + 세포, 생활 이미지 소프트웨어 스펙트럼 unmixing 기능을 사용하여 생성됩니다. 지금까지 각 이미지의 왼쪽에 마우스가 아닌 주입 컨트롤 만 배경 신호를 보여줍니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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Discussion

hESCs는이 다양한 세포 유형을 연구 및 임상 번역에 대한 놀라운 잠재력을 보유하는 이상적인 플랫폼입니다. 우리는 조혈 전구 세포로 hESC의 / 유도 만능를 구분하는 정의, 스핀 EB 방식을 사용합니다. 스핀 EB 방식은 NK 세포 조혈 전구 세포 분화의 일관성있는 유도를 나왔고, 아직 변화는 여전히 세포 라인에 걸쳐 분화 효율 존재하고 다른 조혈 세포 계통의 생성을 위해 수정해야 할 수도 있습니다. 비교 결과가 다른 EB 또는 간질 배양 방법에서 파생에서 얻을 수 있지만,이 시스템은 혈청 무료이며, 다른 방법에 비해 조혈 전구 세포를 생산하는 이상의 정의 된 접근 방식을 나타냅니다. 우리는 또한 임상 번역에 대한 주요 관심사를 극복 유사 장치가없는 방식으로, 이러한 조혈 전구 세포에서 NK 세포를 파생 표준화 효율적인 방법이 있습니다. 또한 NK 세포 developmen에 공부를 정의 시스템을 제공합니다체외에서 t. 사전 임상 광대 같은 NK 세포와 같은 조혈 세포의 생체 내 특성에 특별히 임상 시험이 실험적으로 파생 된 세포 유형과 구현을 정의하는 것이 필요하다.

이미징 및 현미경 기술의 발전은 생물 발광 및 형광 기자에게 15-17,19,21을 표현하는 세포의 생체 모니터링 장기 비 침습적 사용할 수있다. 가장 주목할만한 초기 특성 때문에 다양한 종류의 세포를 시각화하는 데 사용되었습니다 반딧불 루시 페라 구조의 사용입니다. 이 생체 내 이미징을위한 이상적인 기자입니다 만, 하나의 세포 인구를 모니터링으로 제한됩니다. 듀얼 기자 시스템의 가장 큰 장점은 두 가지 세포 집단 사이의 상호 작용을 따라하는 기능입니다. 그러나 몇몇 기자는 모두 생체 내에서 이미지 쉽게 이상 충분하고 정량화 신호를 가지고 개발되었습니다배경입니다.

TurboFP650, 우리의 이중 영상 기법에 사용되는 형광 단백질은, 배경 autofluorescence를 구별 신호를 제공하는 원적외선 이동합니다. 그러나 생활 이미지 소프트웨어 (캘리퍼스 생명 과학)의 스펙트럼 unmixing 방법의 활용은 우리의 시스템 배경 비율에 신호를 극대화 할 필요가 있었다. 형광 단백질 이미징의 본질적인 과제를 도울 수있는 생활 이미지 소프트웨어의 많은 기능이 있습니다. 아직 신호 투과도는 도전 할 부분이 남아있다. 종양 세포가 IP 주입 한 경우의 경우 될 것이라고 시스템은 작은 세포 집단 또는 분산 된 세포 영상의 이미지에 대한 최적화가 필요합니다. 그러나 형광 이미징의 일관성 및 용이성의 사용 듀얼 이미징 모델에 사용할 수있는 이상적인 플랫폼입니다. 동물은 적은 시간 동안 마취하에 있으며 대부분의 듀얼 - 루시퍼 시스템과 제 2 기판을 제공 할 필요가 없습니다.

이 방법은유도의, 생체 내 확장 및 듀얼 이미징 hESC의 유래 나 IPSC 파생 NK 세포와 현재 NK 세포 입양 요법을 개선 할 필요가있다 자신의 평가를 생산하기위한 일관된 방법을 제공합니다. 이중 형광 및 발광 생물 이미징 모델은 우리가 보여준 항 종양 모델보다 다른 두 가지 세포 인구의 장기 연구에 광범위하게 적용 할 수 있습니다.

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Disclosures

이 작품은 NIH / NHLBI R01-HL77923 (DSK)에서와 NIH MSTP 부여 T32 GM008244 (DAK), 줄기 세포 생물학 교육 그랜트 T32 (DAK) (T32HD060536), 학부 연구 기회 프로그램 (UROP) 미네소타 그랜트 대학에 의해 지원되었다 (AMB), 미네소타 암 센터의 대학, 그리고 윌리엄 L 및 위임장 휴즈 재단의 백혈병 연구 기금.

Acknowledgments

저자는 우리가 실험실에서 스핀 EB 프로토콜의 초기화에 대한 멜린다 Hexum에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 로라 E. Bendzick, 마이클 Lepley,이 작품과의 기술 지원을 Zhenya 니켈 등 실험실의 다른 구성원을 감사드립니다. 저자는 또한 그의 전문 기술 조언 캘리퍼스 생명 과학에서 브래드 테일러에게 감사의 말씀을 전합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Media
BPEL media for Spin EB generation
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Fisher Scientific SH3022801
F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I Invitrogen 31765035
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3311 Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity.
Poly(vinyl alcohol) Sigma-Aldrich P8136
Linoleic Acid Sigma-Aldrich L1012
Linolenic Acid Sigma-Aldrich L2376
Synthechol 500X solution Sigma-Aldrich S5442
a-monothioglycerol (a-MTG) Sigma-Aldrich S5442
Protein-free hybridoma mix II Invitrogen 12040077
Ascorbic Acid 2-phosphate Sigma-Aldrich A8960
Glutamax I Invitrogen 35050061
Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS) Invitrogen 41400-045
Pen-Strep Invitrogen 15140122
NK Differentiation Media
Dubecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Invitrogen 11965-118
F-12 Media Invitrogen CX30315
15% Human AB serum Valley Biomed HP1022HI
5 ng/ml Sodium Selenite Sigma-Aldrich S5261
50 uM ethanolamine Sigma-Aldrich E9508
20 ng/ml ascorbic acid Sigma-Aldrich A8960
25 uM 2-mercapt–thanol (BME) Gibco 21985
2 mM L-glutamine Gibco CX30310
1% Pen-Strep Invitrogen 15140122
Cytokines
(all cytokines used fresh from frozen aliquots)
SCF PeproTech, Inc. 300-07 40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot.
rhBMP-4 R & D Systems 314-BP 20 ng/ml in BPEL media
rhVEGF R&D Systems 293-VE 20 ng/ml in BPEL media
IL-2 PeproTech, Inc. 200-02 1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol
IL-15 PeproTech, Inc. 200-15 10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only)
IL-3 PeproTech, Inc. 200-03 5 ng/ml in NK media
IL-7 PeproTech, Inc. 200-07 20 ng/ml in NK media
Flt-3-Ligand PeproTech, Inc. 300-19 10 ng/ml in NK media
In vivo Imaging
D-Luciferin Sodium Salt Gold BioTechnology Lucna-500
TurboFP650 plasmid Evrogen, Moscow, Russia FP731 Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab.
Equipment
IVIS Spectrum Imaging System Caliper Life Sciences
Cells
Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells MD Anderson, Houston, TX contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood
Firefly luciferase expressing hESCs University of Minnesota, Minneapolis, MN contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5' end of a GFP:zeocin fusion construct.
TurboFP650 expressing K562 cells University of Minnesota, Minneapolis, MN contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section

Materials Table.

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References

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