Desenvolvimento, expansão e * These authors contributed equally

Bioengineering

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Summary

Este protocolo descreve o desenvolvimento, a expansão, e in vivo de imagens de células NK derivadas de hESCs e iPSCs.

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Bock, A. M., Knorr, D., Kaufman, D. S. Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs). J. Vis. Exp. (74), e50337, doi:10.3791/50337 (2013).

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Abstract

Nós apresentamos um método para derivar células natural killer (NK) de hESCs indiferenciadas e iPSCs usando uma abordagem alimentador-free. Este método dá origem a elevados níveis de células NK após 4 semanas de cultura e podem ser submetidos a uma maior expansão 2-log, com as células que apresentam antigénios artificiais. hES e iPSC derivado de células NK desenvolvidos neste sistema tem um fenótipo maduro e função. A produção de grandes números de células NK modificáveis ​​geneticamente é aplicável tanto mecânica básica, bem como os estudos anti-tumorais. A expressão de luciferase do pirilampo nas células NK, células estaminais embrionárias humanas derivadas permite uma abordagem não invasiva para seguir o enxerto de células NK, a distribuição e a função. Nós também descrevem um esquema dual-imagem que permite o monitoramento separado de duas populações celulares diferentes para caracterizar mais claramente suas interações in vivo. Este método de derivação, a expansão, e dual in vivo de imagens proporciona uma abordagem fiável para a produção de células NK e sua avação que é necessário para melhorar as terapias adotivos células NK atuais.

Introduction

As células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), são células indiferenciadas pluripotentes, capazes de auto-renovação e multi-linhagem diferenciação ilimitado. hESCs ter sido diferenciados com sucesso em subconjuntos maduras e funcionais de cada camada germinal, incluindo as células do sistema hematopoiético, 1-3. Células assassinas naturais (NK) são linfócitos do sistema imune inato que pode ser derivada a partir de hESCs por formação de corpos embrióides (EB) a 4,5 ou de co-cultura com as linhas de células estromais 1,2,6-8. As células NK possuem capacidades anti-virais e anti-tumoral e têm o potencial para ser eficaz contra uma vasta gama de doenças malignas, como eles não necessitam de estimulação do antigénio antes de exercer as suas funções efectoras. Assim, as células NK, células estaminais embrionárias humanas derivadas são uma fonte de células atractivo para imunoterapia. Além disso, a derivação de células NK, a partir de hESCs proporciona um sistema geneticamente susceptíveis a estudar o desenvolvimento normal <em> in vitro.

Porque eles fornecem um sistema tratável geneticamente, as células NK, células estaminais embrionárias humanas derivada experimentalmente pode ser modificado para expressar repórteres fluorescentes e bioluminescentes proporcionar um modelo ideal para estudar as funções efectoras de células NK in vitro e in vivo. As células NK derivadas de células estaminais embrionárias humanas possuem actividade contra uma gama de objectivos, incluindo HIV 9, leucemia (K562) e outros tipos de cancro 7,8. No entanto, a capacidade de extrair de forma eficiente as células NK suficientes capazes de tratar pacientes continua a ser um importante obstáculo clínico para a tradução e é, em menor grau, uma grande limitação para a pré-clínicos realizados in vivo do desenvolvimento de células NK e das funções anti-cancro. Aqui, usamos uma abordagem EB rotação para derivar células progenitoras hematopoéticas de hESCs 4,5,10. Após 11 dias o spin EB são transferidas para cultura de células NK, com ou sem alimentadores para 28 dias. Depois de 4 semanas, em meio de cultura de células NK, células NK são transferred a co-cultura com células K562 modificados para expressar ligado à membrana a interleucina 21 (IL-21), que servem como células apresentadoras de antígenos (AAPCS artificiais). Adaptação de um protocolo para a expansão de células NK do sangue periférico, utilizando estes artificial APCs 11,12, somos capazes de expandir as células NK 2-logs, mantendo um fenótipo maduro e capacidades citotóxicos.

Este processo de desenvolvimento e de expansão proporciona células NK, células estaminais embrionárias humanas derivada suficientes para extensa caracterização in vivo. Para estudos in vivo, somos capazes de monitorar de forma não invasiva enxerto a longo prazo e da cinética de injeção luciferase firefly expressando (Fluc +), células NK, células estaminais embrionárias humanas derivadas usando imagem de bioluminescência. Além disso, somos capazes de acompanhar as interações de células NK com as células tumorais usando um esquema de imagem dupla, bioluminescente ou fluorescente. Um estudo anterior do nosso grupo usou imagem de bioluminescência em um modelo anti-tumor para acompanhar a progressão do tumor e clearance de Fluc + células K562 in vivo 7. Agora, pela engenharia nossas hESCs para expressar firefly luciferase 13,14 podemos seguir a biodistribuição e tráfico de células NK para K562 células tumorais que expressam a proteína fluorescente recentemente caracterizada, turboFP650 15. Nós escolhemos este sistema repórter duplo, a fim de seguir simultaneamente as duas populações de células in vivo (Figura 1). A maioria dos modelos duais de imagem têm sido os sistemas dual-luciferase, mas estes sistemas podem ser tecnicamente difícil devido às exigências de entrega de celenterazina, o substrato necessário para a expressão da maioria Renilla e Gaussia repórteres luciferase 16-18. Repórteres fluorescentes têm permitido fácil monitorização de muitas linhas de células e as construções in vitro, mas tem tido um sucesso limitado para imagem in vivo, devido à sobreposição entre o tecido e pele autofluorescência e os espectros de emissão de co muitosmmonly usado repórteres fluorescentes incluindo GFP, DsRed e tdTomato 15,19. Esta preocupação tem incentivado o desenvolvimento de proteínas fluorescentes vermelho-distante, o que permite melhor penetração do tecido e sinal específico maior em relação ao fundo 15,19. TurboFP650, a proteína fluorescente mostrado neste sistema, é deslocou-vermelho distante e supera muitos dos problemas envolvidos com a imagem proteínas fluorescentes em animais vivos.

Este método para desenvolver e expandir as células NK derivadas de hESCs nos permitiu caracterizar células hESC derivado NK in vitro e in vivo, o que é necessário para entender melhor a função das células NK e clinicamente importante para melhorar as terapias adotivos células NK atuais. Também é favorável à derivação e expansão das células NK iPSC derivados. O esquema de imagens fluorescentes e bioluminescentes dupla é amplamente aplicável a outros que o modelo anti-tumor temos mostrado aqui sistemas.

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Protocol

1. Adaptação hESCs ou iPSCs em TrypLE para Spin EB culturas

  1. A dissociação inicial com TrypLE funciona melhor se os ES / iPS colônias das culturas colagenase várias passagens são relativamente pequenos. A ES início / populações iPS deve ser células não passou mais do que 4-5 dia anterior. 4-5 dias antes do início da passagem TrypLE, passar as células ES, a uma densidade que vai permitir que as células a ser ~ 70% confluentes em 4 dias de tempo. Use a mídia ES regulares para a cultura de células-tronco embrionárias TrypLE-várias passagens. Aqui, estamos usando hESCs estável modificados com uma construção repórter luciferase (Tabela de Materiais). O protocolo também trabalha com iPSCs, utilizando iPSCs não modificadas para comparação de células progenitoras hematopoiéticas e o desenvolvimento de células NK.
  2. Quatro dias antes do início da passagem TrypLE, passe células ES / iPS com colagenase IV, seguindo um protocolo de passagem normal. Nós normalmente passar 01:01 na primeira passagem com TrypLE. Expandir células ES / iPS em conformidade com antecedência.
  3. 5 células / poço. Passe 01:01 (ou 02:01 para difícil de adaptar linhas celulares ou para culturas menos densas) na primeira passagem com TrypLE. Portanto, prepare-se uma placa MEF para cada ES / iPS placa você está pensando em colocar na cultura TrypLE.
  4. Escolher cuidadosamente off colônias diferenciadas (aqueles que não têm uma fronteira circunscrito ou têm características fibroblásticas / epitelial) antes de prosseguir para TrypLE dissociação. As células diferenciadas pode assumir a cultura de forma relativamente fácil, com passagem TrypLE, por isso é importante ter certeza de sua população inicial é muito limpo.
  5. Aspirar a mídia de poços e adicionar 1,0 ml TrypLE pré-aquecido Selecione por poço.
  6. Incubar as células ES / iPS em TrypLE por 5 min em um 37 ° C incubadora. Após 5 minutos, suavemente as células ES de pipeta fora da parte inferior do poço.
  7. Recolher o TrypLE suspensão de células a partir de poços e transferir para um tubo cónico. Pipeta cima e para baixo gently 2-3 vezes para encorajar os maiores aglomerados para quebrar. Diluir TrypLE com pelo menos uma igual mídia ES volume e um DPBS igual volume. TrypLE não é temperada por meio de cultura, por isso é importante para diluir a TrypLE com meios de DPBS e depois removendo as células a partir da placa. Usamos DPBS + media para lavagens para salvar mídia ES.
  8. Girar as células a 1500 rpm durante 5 min, em centrífuga refrigerada (8 ° C).
  9. Aspirar fora tanto do sobrenadante quanto possível, para remover TrypLE.
  10. Ressuspender as células em 4 ml de mídia ES mais 4 ml DPBS e repita rodada para se livrar de vestígios remanescentes de TrypLE.
  11. Aspirar off sobrenadante e ressuspender em media ES volume apropriado para revestimento.
  12. Células-tronco embrionárias chapa 01:01 (ou 02:01 se necessário) para MEFs de baixa densidade na mídia ES.
  13. Após 24 horas, alimentar as células com a mídia ES frescos. Há provavelmente haverá muitas células individuais que não ligam. Alimentar células-tronco embrionárias diariamente com a mídia ES.
  14. Passe com TrypLE em fresco MEFs (0,9-1 x 10 (por exemplo, terça-feira e sexta-feira) usando o mesmo procedimento básico como acima. Normalmente, você não deve ter de escolher células passados ​​com TrypLE.
  15. Para os primeiros várias passagens (até passagem 5-10), as células exigirá passando em 1:1. Isso faz com que a expansão de células difícil. Em nossa experiência, chapeamento eficiência das células-tronco embrionárias cai drasticamente em torno de trechos 4-5 e depois volta-se dentro de um par de passagens. Depois de passagens 5-7, você pode ser capaz de começar a passar as células em 1:2, e eventualmente, 1:3. Além passagem 20, você pode precisar de começar a passar as células de 01:05 ou 01:06. Certifique-se de placa as células-tronco embrionárias em uma alta densidade dos primeiros 5-10 passagens. Uma vez que você chegar a um ponto onde a placa para baixo de forma eficiente o suficiente para que eles possam chegar a ~ 70% de confluência prazo de dois dias após a passagem, você pode tentar começar a passar em 1:2, e, finalmente, deve ser capaz de passar em 1:3 ou células 01:04. iPSCs, em particular, se não várias passagens densamente bastante antes totalmente adapted, tendem a se diferenciar.

2. Preparar soluções estoque para configurar rotação EB culturas

  1. Solução de BSA a 10% em IMDM: Suspender 4 g de BSA em 35 ml de IMDM (de 50 ml cónica). Deixa-se repousar à temperatura ambiente durante 1-2 horas para permitir que o BSA para dissolver totalmente. Ajustar o volume total a 40 ml com IMDM para obter a concentração final de 10%. BSA disponível comercialmente pode ser citotóxico para as células ES. Deionizing a solução pode reduzir o potencial de citotoxicidade. Para deionize, adicione ~ 1,3 g de esferas de resina para 40 ml de solução de BSA e agite bem para misturar.
  2. Ponto solução de BSA (com esferas de resina) a 4 ° C até grânulos mudança de cor de azul para amarelo-verde (o que indica que a capacidade de troca de esgotamento).
  3. Agite solução a cada 20-30 min para facilitar a troca
  4. Cada troca pode levar até 2 horas. Quando a troca é completa, centrifugar solução durante 2 min a 1000 rpm a pelota grânulos do fundo do tubo.
  5. Pipette solução de BSA numa cónico de 50 ml fresco, deixando grânulos a serem descartados.
  6. Repita os passos 2,2-2,5 pelo menos duas vezes adicionais para um total de três ou mais bolsas. Durante a última permuta, a capacidade de os grânulos não podem ser completamente esgotado, mesmo depois de duas horas de incubação com os grânulos.
  7. Filtro estéril a solução de BSA e remover quaisquer grânulos restantes.
  8. A solução de BSA deve ser estável a 4 ° C durante pelo menos 2 meses.
  9. Solução de PVA a 5%: Medir 100 mL de H2O Millipore em frasco de 125 ml de vidro.
  10. Adicionar 5 g de PVA para a água. É importante adicionar o PVA à água de modo que o PVA fica totalmente "molhada". Se você adicionar a água para o PVA, vai demorar muito tempo para o PVA para entrar na solução.
  11. PVA não se dissolve imediatamente. Ponto solução de PVA / água a 4 ° C durante a noite.
  12. Na manhã seguinte, a solução lugar PVA / água em 37 ° C banho-maria por 4-8 horas. PVA deve ser principalmente na solução no final doa incubação.
  13. Coloque a garrafa de volta em 4 ° C durante um adicional de 24-48 horas, ou até estar completamente dissolvido. Solução poderia ser um pouco viscoso.
  14. As soluções de PVA deve ser estável a 4 ° C durante pelo menos 6 semanas.
  15. Ácidos linoléico e linolênico (soluções de 10.000 X): diluir a 1 mg / ml em etanol 200-prova. Adicionar 10 ml de azeite puro a 10 ml de etanol. Alíquota e armazenar a -20 ° C.
  16. α-MTG solução estoque: Diluir 13 mL α-MTG em 1 ml IMDM.
  17. Solução de 2-fosfato de ácido ascórbico (100X): Fazer a 5 mg / ml de solução. 250 mg de ácido ascórbico 2-fosfato, em 50 ml, grau de cultura de tecidos estéril de H 2 O. Se dissolve facilmente.

3. Assembleia da BPEL mídia (para ~ 200 ml Volume Total)

  1. Fazer uma mistura de PVA-lípidos (este passo impede que o PVA a formação de gotículas de insolúveis no meio que se filtrou para fora).
  2. Adicionar 20 ml de IMDM e 20 ml de mistura de nutrientes F-12 a 50ml tubo cônico.
  3. Adicionar 10 ml de 5% de ações PVA, 0,4 ml synthechol, 20 mL de ácido linolênico, ácido linoléico e 20 mL para 200 ml de mídia BPEL. Agitar bem para misturar tubo. Ponha de lado enquanto os outros componentes de mídia são montados.
  4. Adicione todos os componentes de mídia restantes para cima de 250 ml unidade de filtração Stericup. Adicione o equilíbrio de IMDM necessária e F-12 volumes (66 ml cada), BSA, um MTG, 100X STI, Glutamax I, Pen / Strep, Proteína livre de hibridoma mistura II, e ácido ascórbico. Adicionar a mistura de PVA-lípidos a partir do passo 1 para o topo da Stericup. Filtra-se a média. Médio deve ser estável a 4 ° C durante pelo menos 2 semanas. Use média de idade para as etapas de lavagem.

4. Criação de células-tronco embrionárias TrypLE-várias passagens na Fase I Gire EBs

Usar células ES / iPS, que foram adaptados para TrypLE passagem em FAE precisados ​​(ou seja, as células ES / IPS que foram passadas com TrypLE pelo menos 5-7 vezes) menor densidade. Se as células podem ser passadas a ~ 1:3 e tornar-se de 70-80% confluentes em 3-4 dias, As células deve ser bom para usar.

  1. Dois dias antes de configurar diferenciação EB Spin (dia -2): Passe células ES / iPS TrypLE adaptadas para MEFs fresco a uma densidade permitindo que eles sejam 70-80% confluentes no dia da instalação diferenciação. Nós normalmente passar 48 horas antes da rotação configuração EB.
  2. Dia de rotação configuração EB em Fase I Diferenciação (dia 0): Para preparar para Spin EB chapeamento, pipeta 150 uL de água estéril para o interior dos 36 poços exteriores de cada placa de 96 poços para minimizar a evaporação. Use somente anexos, placas de 96 poços de fundo redondo baixos.
  3. Aspirar meios de cultura fora das células ES / iPS e adicionar 1,0 ml TrypLE pré-aquecido Selecione para cada poço.
  4. Placas coloque em incubadora (37 ° C) por 5 min. Pipeta suavemente as células fora da placa.
  5. Coletar células dissociadas em um tubo cônico e pipeta cima e para baixo para quebrar pedaços. Diluir TrypLE com um igual mídia BPEL volume e pelo menos um DPBS igual volume.
  6. Remover o sobrenadante e ressuspender océlulas em 5 ml de meio BPEL mais 5 ml de DPBS. Repita a rotação.
  7. Remover as células sobrenadante e ressuspender em 5-10 ml de mídia BPEL, dependendo do número de células antecipado. Passa células através do filtro 70 mM (BD Falcon # 352350) em 50 ml de um novo cónica, a fim de remover aglomerados (que podem interferir com a formação de EB).
  8. Contar as células filtradas. Alíquotas de células a serem utilizadas para o revestimento em cónico de 50 ml e de rotação. Para revestimento: 3.000 células ES / bem, 60 poços / placa = 1.8x10 5 células ES / placa.
  9. Após centrifugação, as células terão de ser ressuspenso para 4 3x10 células / ml (volume de 100 ul / poço, 3.000 células ES / poço).
  10. Preparar um volume de meio BPEL + citocinas suficientes para ressuspender as células (isto será de 6 ml / placa). Durante a fase I de diferenciação, usamos SCF (40 ng / ml), BMP4 (20 ng / mL) e VEGF (20 ng / ml) para a derivação de células progenitoras hematopoiéticas.
  11. Placa de 100 ul de células / poço (= 3000 células / poço) em cada um dos 60 poços interiores da prepared placas de 96 poços. Isto é mais fácil quando se utiliza um pipetador multicanal e calha estéril. Certifique-se de misturar as células por pipetagem antes de colocar no cocho e trabalhar rapidamente para que as células não têm a chance de resolver fora.
  12. Rodar as placas de 96 poços em centrífuga refrigerada durante 4 min a ~ 1500 rpm, 8 ° C.
  13. Transferir cuidadosamente a partir de placas de centrifugação a 37 ° C incubadora. Evite interromper as placas, tanto quanto possível. Verificar as placas para certificar-se que as células formaram peletes uniformes no fundo dos poços.
  14. Estágio I girar EBs não devem ser alimentados ou não perturbado por dias 3-4 diferenciação até o EBS ter formado uma camada externa mais durável. Se EBS será deixado na fase I além de 10-12 dias, às vezes alimentar EBs com 50 mL de mídia BPEL frescos com citocinas para cada poço (primeiro tirar 50 ul da velha mídia de cada poço). Dentro de 24 horas, as células devem começar a formar uma estrutura 3-D de EB, e 3-5 por dia deve ter uma camada exterior distinta, e comece a desengalopando estruturas císticas.

5. Dissociar Fase I EBs para FACS Análise

Colete EB around18-36 rotação para análise FACS. Se analisar as células antes do dia 6, mais poços são necessários para obter o número de células suficientes.

  1. Preparar o volume necessário de soro de galinha com tripsina a 2%. Coloque em banho-maria de 37 ° C até à sua utilização.
  2. Transferência de spin EBs e mídia de placas de 96 poços a 15 ml tubos cônicos.
  3. Permitir EBS para resolver a parte inferior de tubos cônicos. Com uma pipeta de 5 ml, pipetar cuidadosamente o sobrenadante e transferir para um tubo separado (você pode reunir todo o sobrenadante para um 15 ml ou 50 ml tubo cônico). Como algumas células hematopoiéticas já foram liberados do EB rotação entre os dias 9 e 11, separando o sobrenadante contendo estas células impede tripsinização excessiva.
  4. Ressuspender CEs em tripsina + 2% de soro de galinha: 3-4 ml a cada tubo cónico de 15 ml. Coloque EBs com tripsina em 37 ° C waterbath por 3-7 min. Agitar suavemente ou vórtice cada min 1-2. Em intervalo de tempo anterior (antes do dia 8), EBS vai quebrar mais facilmente e pode demorar tão pouco como 3 min. Em intervalo de tempo mais tarde (dia 8 +), a EBS pode demorar mais para dissociar. Nós geralmente não deixá-los trypsinize por mais de 5 min a 37 ° C. Note, estes tempos são apenas um guia. Para qualquer linha celular particular ou diferenciação EB, pode demorar mais ou menos tempo para dissociar a EBS. Acompanhar de perto a dissociação. É importante não deixar as células em tripsina por muito tempo. É melhor parar a tripsina dissociação quando apenas alguns pequenos aglomerados permanecem visíveis ao invés de tentar eliminar todos os grumos.
  5. Têmpera com tripsina, pelo menos, um volume igual de meio contendo FBS. Girar as células (1.500 rpm, 5 min, 8 ° C).
  6. Ressuspender as células num volume apropriado de meio de contagem (geralmente 3-5 ml).
  7. Células filtrar através de um filtro de células 100 mM. Remove-se uma alíquota de células para contagem. Prossiga com célulascom protocolos padrão de laboratório FACS.

6. Desenvolvimento, expansão e caracterização das células NK de células progenitoras derivadas do HPSC

Porque a centrifugação CEs contêm uma elevada percentagem de células progenitoras hematopoiéticas, eles podem ser transferidos directamente para a cultura de células NK no dia 11. A rotação EB pode ser transferida para placas de 24 poços com ou sem alimentadores. Mostrámos nenhuma diferença no fenótipo ou na função entre as células NK derivadas de cada condição. Portanto, em geral, a transferência para culturas sem alimentadores de ter um sistema completamente definido para o desenvolvimento das células NK. Se você estiver usando uma linha de células estaminais embrionárias humanas / iPSC com diferenciação hematopoética abaixo do ideal o uso de camadas alimentadoras é recomendado 7,8.

  1. Usando uma pipeta multicanal ajustado para 100 mL, a transferência de 6 rotação EBS para cada poço de uma placa de 24 poços.
  2. Com Alimentadores de transferência de spin EBS para placas de 24 poços, contendo 100.000 irradiadas (3000 cGy) EL08-1D2 (um embryoni murinaA linha de células do fígado) c células por poço. Sem alimentadores: transferência EBs diretamente sem revestimento, placas de 24 cavidades.
  3. Adicionar 400 ul de meios de diferenciação NK contendo citocinas (IL-3, IL-15, IL-7, SCF, Flt3L, tudo a partir de Peprotech), de modo que o volume total de cada cavidade é de aproximadamente 1 ml.
  4. Células lugar na incubadora e alimentam a cada 5-7 dias, com media de diferenciação NK contendo todas as citocinas no passo 6.3, exceto IL-3.
  5. As células NK irá expressar um fenótipo maduro no dia 28 após a transferência para a cultura de diferenciação de células NK (Figura 2).
  6. Para testar a citotoxicidade das células NK, um ensaio de libertação de quatro horas de crómio pode ser executada 8.
  7. Se for necessário um grande número de células para estudos in vivo, a co-cultura com células apresentadoras de antígenos (AAPCS artificiais) pode originar um aumento de 2 log ou maior. Para um protocolo detalhado, visite http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood 11,12.

7. Na imagem fluorescente e Bioluminiscente vivo para monitorar hESC derivados de células NK e células tumorais em camundongos imunodeficientes

Usamos diabéticos não obesos / imunodeficiência combinada grave com nocaute de cadeia gama (NOD / SCID / yc - / -) ratos que são de 6 a 8 semanas de idade em todas as nossas experiências. Nós usamos um modelo de imagem dupla para monitorar simultaneamente a progressão do tumor (turboFP650 repórter) e células estaminais embrionárias humanas, as células NK cinética (Fluc repórter expressa em células-tronco embrionárias pais) in vivo. Este esquema de imagiologia é amplamente aplicável a outros do que o modelo antitumoral mostrado sistemas. O Spectrum IVIS (Caliper Life Sciences) é ideal para imagens fluorescentes e bioluminescentes in vivo simultânea.

  1. 24 horas antes da injeção das células tumorais, camundongos irradiam (225-250 cGy).
  2. Ressuspender o número desejado deAs células de tumor (1 x 10 6 células K562 está representado) em 200 ul de Iscove modificado por Dulbecco médio (IMDM) suplementado com 20% de FBS. Dose de células de tumor pode ser variada, dependendo do modelo utilizado. TurboFP650 também podem ser expressas em tipos não-tumorais. O melhor é fotografada com células localizadas em uma única localização anatômica.
  3. Injectar as células de tumor subcutaneamente no tórax superior esquerdo dos ratos utilizando uma agulha de calibre 28 ou 27, e deixa-se enxertar por 4 dias. As células devem formar uma bolha por baixo da pele do rato. Os ratos podem ser raspada nessa porção do corpo para melhor visualizar injecção. Também expõe a área para melhor na imagiologia fluorescente in vivo. Injeção em torno do tórax dos camundongos foi utilizado neste modelo, porque o ip injetadas células NK são melhores visualizados enquanto o mouse é supina. Os métodos alternativos de entrega subcutânea, incluindo a parte traseira ou no flanco, são menos stressante para o animal e deve ser considerada.
  4. Ressuspender o número desejado de células estaminais embrionárias humanas, derived células NK (10 x 10 6 células NK são mostradas) em 300 ul de meio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM), suplementado com FBS a 20% sem antibióticos.
  5. Injetar células NK, células estaminais embrionárias humanas derivadas em cada rato intraperitoneal (IP), utilizando uma agulha de calibre 27 ou 28. Para todas as experiências, os ratos que não receberam nenhum incluem infusão de células de tumor ou NK como um controlo negativo.
  6. Para a manutenção de populações de células NK in vivo, dê ratos uma injecção ip de 250 ul de IL-2 (1x10 4 U / rato) e IL-15 (10 ng / murganho) em DPBS estéreis a cada dia durante os primeiros 7 dias, seguida de IL- 2 apenas a cada 2-3 dias, até que o tempo do sacrifício.
  7. Monitorar o enxerto das células NK hESC derivadas de imagem de bioluminescência. Injectar cada rato com IP 120 ul de D-luciferina (150 mg / kg). Imagem do camundongos 10 min após a injeção D-luciferina.
  8. Anestesiar ratos usando uma câmara permitindo a entrada isoflurano na caixa de 0,8 l / min. Certifique-se que há também o fluxo de oxigênio para dentro da câmara.
  9. Coloque anestesiadoscamundongos em IVIS Spectrum e camundongos seguras em suas costas com fita ou velcro e permitir a entrada isoflurano na caixa de 0,5 l / min para manter a anestesia.
  10. Definir máquina IVIS para corrigir plataforma de imagem (D para 4-5 camundongos, C para 3 ou menos ratos), conjunto binning e médio, f / stop para um e aquisição de imagem para 1 min.
  11. Para executar imagens fluorescentes das células turboFP650 +, use o assistente de imagem para configurar uma varredura de emissão de medição da sonda de interesse, bem como sinal de fundo. A partir da lista de sondas de escolher Em Input / EX, e entrar em excitação e emissão correta. Para turboFP650, use 605 de excitação e de emissão de 660-720 para medir sinal tumor e 570 de excitação e emissão de 640-720 para medir sinal de fundo. Use as configurações de exposição automática e selecionar a plataforma de imagem desejada. A seqüência de imagens inteira geralmente leva 3-5 minutos para adquirir.
  12. Permitir camundongos para se recuperar totalmente da anestesia antes de transportar a partir do sistema de imagem. Analisar imagens utilizando o LiVing Imagem versão do pacote de software 4.2 (Caliper Life Sciences).
  13. Quantificar sinal bioluminescente usando uma região de interesse (ROI) definido para fluxo total (fótons / seg) ou irradiação média (fótons / seg / cm 2 / sr) e definir todas as imagens para a mesma escala (Figura 3). Aqui, imagens representativas são usados ​​para demonstrar as duas populações de células em cada ratinho (Figura 3). Outros estudos do nosso laboratório demonstraram co-localização com esta técnica 20. Colocalização temporização precisa ser optimizada com base no modelo experimental utilizado.
  14. Para quantificar sinal fluorescente a partir da seqüência de varredura de emissão de usar o recurso "espectral desmistura" In Living imagem. Seleccionar as imagens a serem incluídos na análise e desenhar uma máscara sobre a área do rato, contendo o sinal de interesse, neste caso, a parte superior do tórax. Seleccione autofluorescense tecido desconhecido e sonda a ser não misturados. Se os ratos recebem alimentos contendo alfafa, sinal de comida também pode ser unmixed da sonda de interesse e autofluorescência de tecidos.
  15. Se as imagens resultantes não apresentam uma distribuição uniforme da autofluorescência de tecidos (incluindo a área em que o sinal está localizado) constrangimentos podem ser ajustados para obter uma distribuição consistente e melhor separação dos componentes que sejam não misturadas. Isto é típico e frequentemente necessário para as sondas que não estão no software e quando o sinal específico é baixa, ou perto de sinal de fundo. Definir um filtro passa-alto, encontrado sob a aba de actualização, para 640 nm, o que corresponde à extremidade inferior da curva de emissão para turboFP650. A restrição do filtro passa-baixa também pode ser definido, mas não era necessário para a análise de imagens mostradas aqui.
  16. Quantificar sinal fluorescente a partir da imagem sem mistura usando uma região de interesse (ROI) definido para a eficiência radiante (fótons / seg / cm 2 / sr) / μW) e definir todas as imagens para a mesma escala (Figura 3).
  17. Num ponto de tempo desejado, os ratinhos podem ser sacrificados e analisados ​​para brgraftment de células derivadas de células estaminais embrionárias humanas por citometria de fluxo. Por via intraperitoneal células NK injectados que normalmente analisar o sangue periférico (sangramento veia faciais), baço e peritoneu. Lavagens peritoneais pode ser realizada através da exposição apenas da membrana peritoneal e fazendo uma incisão média apenas suficientemente largo para permitir uma pipeta de Pasteur de vidro para aceder à cavidade peritoneal. Utilizando PBS estéril, realizar várias lavagens da cavidade peritoneal, certificando-se de misturar a solução cuidadosamente pela rotação do rato. Coletar bastante líquido até que você tenha um visível pellet seguinte centrifugação (normalmente 5-10 ml de lavagem).

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Representative Results

A geração de células progenitoras hematopoéticas, utilizando a abordagem de EB rotação permite o desenvolvimento óptimo das células NK e dos hESCs iPSCs. Tal como demonstrado na Figura 2, dia 11 de spin EBs contêm percentagens elevadas de células progenitoras que expressam CD34, CD45, CD43 e CD31. Altos níveis de CD34 e CD45 permite a transferência directa às condições NK, sem necessidade de separação ou apoiando células estromais. Se houver subóptima diferenciação EB rotação, recomenda-se que as células estromais, tais como EL08-1D2 são utilizadas nas condições NK secundárias. Após 4 semanas de cultura a centrifugação EBs dar origem a um grande número de células NK (aproximadamente 1-2 x 10 6 culas por po de uma placa de 24 poços). As culturas podem também ser fenotipada em momentos anteriores a ver a progressão gradual de desenvolvimento das células NK neste sistema 7. As células NK manter a expressão de genes repórter que foram modificados para o ES pai / iPS linha e, portanto, pode ser seguido (Figura 3). Usando o recurso de Mistura Espectral em software de imagem viva, autofluorescência de tecidos pode ser subtraída para otimizar o sinal a partir de células marcadas com fluorescência.

Figura 1
Figura 1. Esquema de imagem dupla e cronograma de desenvolvimento. A) Esquema de modelo in vivo. Ratos são injetados IP com a luciferina, e seguindo o tempo de incubação apropriado, as células vaga-lume luciferase + são gravadas para o sinal bioluminescente. Após a aquisição da imagem de bioluminescência, sinal fluorescente de células TurboFP650 + pode ser trabalhada. B) Timeline para o desenvolvimento e teste de hESC-derivAs células NK ed.

Figura 2
Figura 2. Fenótipo de rotação EBs e células NK derivadas de hESCs e iPSCs. A) Após 11 dias em rotação de cultura EB, as células podem ser analisados ​​por citometria de fluxo. No dia 11, ponto de tempo dá elevadas percentagens de CD34, CD43, CD45 e CD31, células que expressam óptimas para a diferenciação de células NK. B) As células NK pode ser detectado utilizando citometria de fluxo após 4 semanas de cultura de células NK. As células no interior da porta de linfócitos (FSC / SSC trama) são analisadas para a expressão de CD56. Células CD56 + podem ser analisadas para co-expressão de marcadores, como CD117, CD94, NKp46, ou outros. Clique aqui para ver a figura maior .


Figura 3. Imagens fluorescentes e bioluminescentes in vivo usando o Spectrum IVIS. No monitoramento vivo é o principal objectivo deste protocolo. Portanto, os ratos não são seguidas fora de folga tumor. O nosso relatório anterior (usando 200 mil células K562) demonstra que a depuração tumor ocorre três semanas 7. A) imagem de bioluminescência de Fluc + células estaminais embrionárias humanas derivadas de células NK no dia 0, 7 e 14 após a injeção das células NK é mostrado na linha superior. Imagem fluorescente de TurboFP650 + células K562 no dia 0, 7 e 14 após a injeção das células NK é mostrado na linha inferior. Imagens fluorescentes foram adquiridas imediatamente após a aquisição da imagem de bioluminescência. B) Seqüência mostrando autofluorescência do tecido e sinal fluorescente de turboFP650 + células, gerados usando o recurso de Mistura Espectral em software de imagem viva. O mouse no canto esquerdo de cada imagem é um controle não-injeção e só mostra o sinal de fundo. Clique aqui para ver a figura maior .

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Discussion

hESCs são uma plataforma ideal para estudar diferentes tipos de células e têm um potencial notável para a tradução clínica. Nós usamos um, rotação abordagem EB definido para diferenciar hESC / iPSCs de células progenitoras hematopoéticas. A abordagem EB rotação rendeu derivação consistente de células progenitoras hematopoiéticas e diferenciação para células NK, ainda, ainda existe variação na eficiência de diferenciação através de linhas de células e podem ter de ser modificado para a produção de outras linhagens de células hematopoiéticas. Embora os resultados comparáveis ​​podem ser obtidos a partir da derivação outro EB ou métodos de cultura de estroma, este sistema é isento de soro e representa uma abordagem mais definida para a produção de células progenitoras hematopoiéticas, em comparação com outros métodos. Temos também padronizado um método eficiente de derivar a partir de células NK estas células progenitoras hematopoiéticas, de uma forma semelhante alimentador-livres, o que supera uma das principais preocupações para a tradução clínica. Ele também fornece um sistema definido para estudar desenvo células NKT in vitro. Extensa pré-clínica, caracterização in vivo de células hematopoiéticas, tais como células NK, também é necessário definir especificamente estes tipos de células derivadas experimentalmente, e da sua aplicação aos ensaios clínicos.

Os avanços na imagiologia e técnicas de microscopia permitiram a longo prazo e não-invasiva a monitorização in vivo de células que expressam os repórteres bioluminescentes e fluorescentes 15-17,19,21. Mais notável é a utilização da construção de luciferase do pirilampo, o que tem sido usada para visualizar diversos tipos celulares, desde a sua caracterização inicial. Isto é ideal para um repórter de imagem in vivo, mas é limitado a monitorização de uma população de células. A maior vantagem de um sistema dual-repórter é a capacidade de acompanhar as interações entre duas populações celulares distintas. No entanto, alguns jornalistas foram desenvolvidos que são fáceis de imagem in vivo e ter sinal suficiente e quantificáveis ​​acimafundo.

TurboFP650, a proteína fluorescente usada em nosso esquema dual-imagem, é muito vermelho-deslocada, o que dá sinal distinto de autofluorescência de fundo. No entanto, a utilização de métodos de separação espectral no software imagem viva (Caliper Life Sciences) foi necessário para maximizar a relação sinal de fundo no nosso sistema. Há muitas características do software imagem viva capaz de ajudar com os desafios intrínsecos da imagem proteína fluorescente. Ainda assim, o sinal de penetrância permanece um desafio. O sistema necessita de uma maior optimização para imagiologia de populações de células pequenas ou de imagem de células dispersas, como seria o caso, se as células de tumor foram injectados IP. No entanto, a consistência e facilidade de imagem fluorescente faz com que a sua utilização uma plataforma ideal para usar em um modelo de imagem dupla. Os animais são anestesiados por menos tempo e não há necessidade de proporcionar um segundo substrato como acontece com a maioria dos sistemas de dupla luciferase.

Este métodode derivação, expansão e dual-imaging in vivo fornece uma abordagem consistente para a produção de células NK, células estaminais embrionárias humanas derivadas ou iPSC derivada e sua avaliação que é necessário para melhorar as terapias adotivos células NK atuais. O modelo de imagiologia bioluminescente dupla fluorescente e é amplamente aplicável para o estudo a longo prazo do que o modelo de outros anti-tumoral que têm mostrado duas populações celulares distintas.

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Disclosures

Este trabalho foi financiado pelo NIH / NHLBI R01-HL77923 (DSK) e pelo NIH MSTP concessão T32 GM008244 (DAK), Stem Cell Biology Training Grant T32 (DAK) (T32HD060536), Graduação Programa de Oportunidades de Pesquisa (UROP) Grant, da Universidade de Minnesota (AMB), o Fundo Leukemia Research, da Universidade de Minnesota Cancer Center, e William L e Fundação Blanche Hughes.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer a Melinda Hexum para início do protocolo EB rotação dentro do nosso laboratório. Gostaríamos de agradecer aos outros membros do laboratório, incluindo Laura E. Bendzick, Michael Lepley e Zhenya Ni para a sua assistência técnica com este trabalho. Os autores também gostariam de agradecer Brad Taylor em Caliper Life Sciences para sua assessoria técnica especializada.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Media
BPEL media for Spin EB generation
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Fisher Scientific SH3022801
F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I Invitrogen 31765035
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3311 Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity.
Poly(vinyl alcohol) Sigma-Aldrich P8136
Linoleic Acid Sigma-Aldrich L1012
Linolenic Acid Sigma-Aldrich L2376
Synthechol 500X solution Sigma-Aldrich S5442
a-monothioglycerol (a-MTG) Sigma-Aldrich S5442
Protein-free hybridoma mix II Invitrogen 12040077
Ascorbic Acid 2-phosphate Sigma-Aldrich A8960
Glutamax I Invitrogen 35050061
Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS) Invitrogen 41400-045
Pen-Strep Invitrogen 15140122
NK Differentiation Media
Dubecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Invitrogen 11965-118
F-12 Media Invitrogen CX30315
15% Human AB serum Valley Biomed HP1022HI
5 ng/ml Sodium Selenite Sigma-Aldrich S5261
50 uM ethanolamine Sigma-Aldrich E9508
20 ng/ml ascorbic acid Sigma-Aldrich A8960
25 uM 2-mercapt–thanol (BME) Gibco 21985
2 mM L-glutamine Gibco CX30310
1% Pen-Strep Invitrogen 15140122
Cytokines
(all cytokines used fresh from frozen aliquots)
SCF PeproTech, Inc. 300-07 40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot.
rhBMP-4 R & D Systems 314-BP 20 ng/ml in BPEL media
rhVEGF R&D Systems 293-VE 20 ng/ml in BPEL media
IL-2 PeproTech, Inc. 200-02 1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol
IL-15 PeproTech, Inc. 200-15 10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only)
IL-3 PeproTech, Inc. 200-03 5 ng/ml in NK media
IL-7 PeproTech, Inc. 200-07 20 ng/ml in NK media
Flt-3-Ligand PeproTech, Inc. 300-19 10 ng/ml in NK media
In vivo Imaging
D-Luciferin Sodium Salt Gold BioTechnology Lucna-500
TurboFP650 plasmid Evrogen, Moscow, Russia FP731 Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab.
Equipment
IVIS Spectrum Imaging System Caliper Life Sciences
Cells
Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells MD Anderson, Houston, TX contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood
Firefly luciferase expressing hESCs University of Minnesota, Minneapolis, MN contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5' end of a GFP:zeocin fusion construct.
TurboFP650 expressing K562 cells University of Minnesota, Minneapolis, MN contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section

Materials Table.

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References

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