Le développement, l'expansion et * These authors contributed equally

Bioengineering

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Summary

Ce protocole décrit le développement, l'expansion et l'imagerie in vivo des cellules NK dérivées de CSEh et iPSCs.

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Bock, A. M., Knorr, D., Kaufman, D. S. Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs). J. Vis. Exp. (74), e50337, doi:10.3791/50337 (2013).

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Abstract

Nous présentons une méthode pour dériver des cellules tueuses naturelles (NK) à partir de CSEh et iPSCs indifférenciées en utilisant une approche chargeur sans. Cette méthode donne lieu à des taux élevés de cellules NK après 4 semaines de culture et peut subir une expansion de 2 log avec des cellules présentatrices de l'antigène artificielles. Les cellules NK CSEh et iPSC dérivé développés dans ce système ont un phénotype et la fonction mature. La production d'un grand nombre de cellules NK modifiables génétiquement est applicable à la fois mécaniste de base ainsi que des études anti-tumorales. Expression de la luciférase de luciole dans les cellules NK CSEh dérivées permet une approche non invasive pour suivre la prise de greffe de cellules NK, la distribution, et la fonction. Nous décrivons également un double système d'imagerie qui permet une surveillance séparée des deux populations de cellules différentes de caractériser plus nettement leurs interactions in vivo. Ce mode de dérivation, l'expansion, et la double imagerie in vivo fournit une approche fiable de production de cellules NK et leur évaation qui est nécessaire pour améliorer les thérapies actuelles adoptifs de cellules NK.

Introduction

Cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et des cellules souches pluripotentes induites (CISP) sont des cellules pluripotentes indifférenciées capables d'auto-renouvellement et de multi-lignée différenciation illimitée. hESCs ont été différenciés avec succès en sous-ensembles matures et fonctionnelles de chaque couche de germe, y compris des cellules du système hématopoïétique 3.1. Les cellules tueuses naturelles (NK) sont des lymphocytes du système immunitaire inné qui peut être obtenue à partir de cellules hES par la formation de corps embryoïdes (EBS) 4,5 ou co-culture avec des lignées de cellules stromales 1,2,6-8. Les cellules NK possèdent des capacités anti-virales et anti-tumorale et ont le potentiel pour être efficace contre un large éventail de cancers, car ils ne nécessitent pas la stimulation antigénique avant d'exercer leurs fonctions effectrices. Ainsi, les cellules CSEh dérivées NK sont une source intéressante de cellules pour l'immunothérapie. En outre, la dérivation de cellules NK de CSEh fournit un système génétiquement prête à étudier le développement normal <em> in vitro.

Parce qu'ils fournissent un système génétiquement traitable, les cellules NK CSEh dérivées peuvent être expérimentalement modifiées pour exprimer les journalistes fluorescentes et bioluminescente fournissant un modèle optimal pour étudier NK fonctions effectrices cellulaires in vitro et in vivo. Les cellules NK CSEh dérivées possèdent une activité contre une gamme d'objectifs, y compris le VIH 9, la leucémie (K562) et d'autres types de cancer 7,8. Cependant, la capacité à tirer efficacement suffisamment de cellules NK capables de traiter les patients reste un obstacle important pour la traduction clinique et, dans une moindre mesure, une limitation pour une vaste pré-cliniques in vivo du développement des cellules NK et des fonctions anti-cancéreuses. Ici, nous utilisons une approche de EB de spin de tirer progéniteurs hématopoïétiques à partir de CSEh 4,5,10. Après 11 jours, le tour EB sont transférés à la culture des cellules NK avec ou sans mangeoires pour 28 jours. Après 4 semaines dans un milieu de culture de cellules NK, les cellules NK sont transferred de co-culture avec des cellules K562 modifiées pour exprimer liée à la membrane de l'interleukine 21 (IL-21), qui servent de cellules présentatrices de l'antigène artificielles (VAMP). Adaptation d'un protocole pour l'expansion des cellules NK du sang périphérique à l'aide de ces APC artificielle 11,12, nous sommes en mesure de développer des cellules NK 2-logs tout en conservant un phénotype mature et capacités cytotoxiques.

Ce processus de développement et d'expansion prévoit cellules CSEh dérivées NK suffisantes pour extensif dans la caractérisation in vivo. Pour les études in vivo, nous sommes en mesure de surveiller de manière non invasive la prise de greffe à long terme et la cinétique de la luciférase de luciole injecté exprimer (Fluc +), les cellules NK CSEh dérivées utilisant l'imagerie par bioluminescence. En outre, nous sommes en mesure de suivre les interactions des cellules NK avec des cellules tumorales en utilisant un schéma d'imagerie double, bioluminescents ou fluorescent. Une étude antérieure de notre groupe a utilisé l'imagerie par bioluminescence dans un modèle anti-tumorale de suivre la progression tumorale et clearance de + cellules Fluc K562 in vivo 7. Maintenant, en repensant nos CSEh pour exprimer la luciférase de luciole 13,14, nous pouvons suivre la biodistribution et la traite des cellules NK à K562 cellules tumorales qui expriment la protéine fluorescente récemment caractérisé, turboFP650 15. Nous avons choisi ce système de double journaliste afin de suivre simultanément les deux populations de cellules in vivo (figure 1). La plupart des modèles double d'imagerie ont été systèmes à double luciférase, mais ces systèmes peuvent être techniquement difficile en raison des exigences de livraison de coelentérazine, le substrat nécessaire à l'expression de la plupart Renilla et Gaussia journalistes luciférase 16-18. Reporters fluorescents ont permis un contrôle facile de nombreuses lignées cellulaires et des constructions in vitro, mais a eu un succès limité pour l'imagerie in vivo en raison du chevauchement entre les tissus et autofluorescence de la fourrure et les spectres d'émission de plusieurs commonly utilisé reporters fluorescents dont GFP, DsRed et tdTomato 15,19. Cette préoccupation a encouragé le développement de protéines fluorescentes rouge lointain, qui permettent de mieux pénétrance de tissu et un signal spécifique plus élevée par rapport au fond 15,19. TurboFP650, la protéine fluorescente montré dans ce système, est décalée rouge lointain et à bout de bien des enjeux avec des protéines fluorescentes imagerie chez les animaux vivants.

Cette méthode de développement et l'expansion des cellules NK provenant de CSEh nous a permis de mieux caractériser les cellules CSEh dérivées NK in vitro et in vivo, ce qui est nécessaire pour mieux comprendre la fonction des cellules NK et cliniquement important d'améliorer les thérapies actuelles adoptifs de cellules NK. Il est également prête à la dérivation et l'expansion des cellules NK iPSC-dérivées. Le système d'imagerie double fluorescent et bioluminescence est largement applicable à d'autres systèmes que le modèle anti-tumorale, nous avons montré ici.

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Protocol

1. Adaptation CSEh ou iPSCs dans TrypLE pour Spin Cultures EB

  1. La dissociation initiale avec TrypLE fonctionne mieux si les colonies ES / iPS à partir de cultures collagénase repiquées sont relativement faibles. L'ES départ / populations iPS devraient être des cellules passé plus de 4-5 jours précédent. 4-5 jours avant le début du passage TrypLE, passent des cellules ES à une densité qui permettent aux cellules d'être ~ 70% de confluence en 4 jours le temps. Utiliser les médias ES réguliers pour la culture des cellules souches embryonnaires TrypLE-repiquées. Ici, nous utilisons CSEh stable modifiés avec une construction rapporteur de la luciférase (Table des matières). Le protocole fonctionne également avec iPSCs, en utilisant iPSCs non modifiés pour la comparaison des cellules progénitrices hématopoïétiques et le développement des cellules NK.
  2. Quatre jours avant le début du passage TrypLE, passent cellules ES / IPS avec de la collagénase IV, suivant un protocole de passage normal. Nous passons généralement de 1:1 dans le premier passage avec TrypLE. Développer cellules ES / IPS en conséquence au préalable.
  3. 5 cellules / puits. Passez 1:1 (ou 2:1 pour difficiles à adapter des lignées cellulaires ou des cultures moins denses) dans le premier passage avec TrypLE. Par conséquent, préparer une plaque de MEF pour chaque plaque ES / IPS vous envisagez de mettre en culture TrypLE.
  4. Cueillir avec précaution colonies différenciées (ceux qui n'ont pas de frontière circonscrit ou ont des caractéristiques fibroblastiques / épithéliale) avant de procéder à TrypLE dissociation. Les cellules différenciées peuvent prendre en charge la culture relativement facilement avec passage TrypLE, il est donc important de s'assurer que votre population de départ est très propre.
  5. Aspirer médias de puits et ajoutez 1,0 ml TrypLE préchauffé Choisir par puits.
  6. Incuber les cellules ES / IPS dans TrypLE pendant 5 min à 37 ° C incubateur. Après 5 min, en douceur les cellules ES pipette du fond du puits.
  7. Recueillir la suspension de cellules dans des puits TrypLE et transférer dans un tube conique. Introduire à la pipette de haut en bas gently 2-3 fois pour encourager les grandes touffes à se briser. Diluer TrypLE avec au moins 1 volume égal médias ES et 1 dPBS de volume égaux. TrypLE n'est pas stoppée par les milieux de culture, il est donc important de diluer la TrypLE avec les médias et dPBS après l'élimination des cellules de la plaque. Nous utilisons dPBS + médias pour les lavages de sauver médias ES.
  8. Isoler les cellules à 1500 rpm pendant 5 min dans la centrifugeuse réfrigérée (8 ° C).
  9. Aspirer autant de surnageant que possible pour enlever TrypLE.
  10. Remettre les cellules dans 4 ml de milieu ES plus 4 ml dPBS et répétez tour pour se débarrasser de toute trace de TrypLE.
  11. Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans un milieu ES de volumes appropriés pour le placage.
  12. Plate cellules ES 1:1 (ou 2:1 si besoin est) sur basse densité FAE dans les médias ES.
  13. Après 24 h, nourrir les cellules avec les médias ES frais. Il y aura probablement de nombreuses cellules individuelles qui ne se fixent pas. Nourrir les cellules ES quotidien avec les médias ES.
  14. Passez avec TrypLE sur frais MEF (0,9-1 x 10 (par exemple, les mardi et vendredi) en utilisant la même procédure de base que ci-dessus. Normalement, vous ne devriez pas avoir à choisir cellules passés avec TrypLE.
  15. Pour les premiers passages (jusqu'à passage 5-10), les cellules vont nécessiter le passage à 1:1. Cela rend difficile l'expansion des cellules. Dans notre expérience, le placage efficacité des cellules ES chute considérablement autour passages 4-5 puis remonte en quelques passages. Après des passages 5-7, vous pourriez être en mesure de commencer à passer les cellules à 1:2, et finalement, 1:3. Au-delà de passage 20, vous devrez peut-être commencer à passer les cellules à 01h05 ou 01h06. Assurez-vous de plaquer les cellules ES à haute densité les premiers passages 5-10. Une fois que vous arrivez à un point où la plaque vers le bas de manière suffisamment efficace qu'ils peuvent atteindre ~ 70% de confluence dans les deux jours après le passage, vous pouvez essayer de commencer à passer à 1:2, et finalement devriez être en mesure de passer à 01h03 ou de cellules 01:04. iPSCs, en particulier, si ce n'est pas assez dense repiquées avant tout undapté, ont tendance à se différencier.

2. Préparer solutions mères Configuration Cultures EB Spin

  1. Solution à 10% de BSA dans IMDM: Suspension 4 g de BSA dans 35 ml IMDM (en ml conique 50). Laisser la solution reposer à température ambiante pendant 1-2 heures pour permettre BSA pour dissoudre complètement. Régler le volume total à 40 ml avec IMDM pour obtenir une concentration finale de 10%. BSA disponibles dans le commerce peuvent être cytotoxiques pour les cellules ES. Désionisation la solution peut réduire le risque de cytotoxicité. Pour désioniser, ajouter ~ 1,3 g billes de résine à 40 ml de solution de BSA et bien agiter pour mélanger.
  2. Place solution BSA (avec des billes de résine) à 4 ° C jusqu'à ce que des perles changement de couleur du bleu-vert au jaune (ce qui indique que la capacité d'échange a été épuisé).
  3. Agiter solution toutes les 20-30 min pour faciliter l'échange
  4. Chaque échange peut prendre jusqu'à 2 heures. Lorsque l'échange est terminée, centrifuger solution pendant 2 min à 1000 rpm à billes à granulés au fond du tube.
  5. Pipette solution BSA dans une douce 50 ml conique, laissant perles à être jetés.
  6. Répétez les étapes 2.2-2.5 au moins deux fois supplémentaires pour un total de trois ou plusieurs bourses. Pendant le dernier échange, la capacité des billes ne peut être totalement épuisé, même après deux heures d'incubation avec les billes.
  7. Filtre stérile la solution BSA et éliminer toutes les billes restantes.
  8. La solution de BSA doit être stable à 4 ° C pendant au moins 2 mois.
  9. Solution PVA 5%: Mesurer 100 ml Millipore H 2 O en flacon de 125 ml en verre.
  10. Ajouter 5 g de PVA à l'eau. Il est important d'ajouter le PVA à l'eau de sorte que le PVA obtient complètement "humide". Si vous ajoutez à l'eau de la PVA, il faudra très longtemps pour le PVA pour aller en solution.
  11. PVA ne se dissout pas immédiatement. solution Place PVA / eau à 4 ° C pendant la nuit.
  12. Le lendemain matin, le lieu solution PVA / eau à 37 ° C bain-marie pendant 4-8 heures. PVA devrait être surtout dans une solution d'ici la fin del'incubation.
  13. Lieu bouteille de retour dans 4 ° C pendant une heure 24-48 supplémentaire, ou jusqu'à dissolution complète. Solution pourrait être légèrement visqueuse.
  14. Solutions PVA devrait être stable à 4 ° C pendant au moins 6 semaines.
  15. Acides linoléique et linolénique (10.000 solutions X): diluer à 1 mg / ml dans de l'éthanol 200 preuve. Ajouter 10 ml d'huile pure pour 10 ml d'éthanol. Aliquote et conserver à -20 ° C.
  16. α-MTG solution mère: prélever 13 ul α-MTG dans 1 ml de IMDM.
  17. Solution 2-phosphate d'acide ascorbique (100X): Faire un 5 mg / ml solution. 250 mg d'acide ascorbique 2-phosphate à 50, grade de culture tissulaire stérile ml H 2 O. Dissout facilement.

3. Assemblée des BPEL médias (pour ~ 200 ml Volume total)

  1. Faire un mélange de PVA lipides (cette étape empêche le PVA de former des gouttelettes insoluble dans le milieu qui sont filtrés).
  2. Ajouter 20 ml et 20 ml IMDM mélange F-12 nutriments à 50Tube conique ml.
  3. Ajouter 10 ml de 5% de PVA actions, 0,4 ml synthechol, 20 pl d'acide linolénique et l'acide linoléique 20 pl pour 200 ml médias BPEL. Agiter le tube bien mélanger. Mettez de côté alors que les autres composantes médias sont assemblés.
  4. Ajouter tous les composants de médias restants en haut de 250 unité de filtration Stericup ml. Ajouter le reste de IMDM requise et F-12 volumes (66 ml chacun), BSA, une MTG, 100X SA, acide Pen / Strep, exempt de protéines hybridome mélange II, et l'acide ascorbique Glutamax I,. Ajouter le mélange PVA-lipides à partir de l'étape 1 vers le haut de la Stericup. Filtrer le milieu. Medium devrait être stable à 4 ° C pendant au moins 2 semaines. Utilisez ancien milieu pour les étapes de lavage.

4. Mise en place des cellules ES TrypLE-repiquées dans la phase I Spin EB

Utiliser des cellules ES / IPS qui ont été adaptés à TrypLE passage à faible densité FAE (c.-à-ES / cellules iPS qui ont été exposées à TrypLE à 5-7 fois moins). Si les cellules peuvent être transmises à ~ 01:03 et deviennent 70-80% de confluence dans 3-4 jours, Les cellules devraient être bonnes à utiliser.

  1. Deux jours avant la mise en place Spin différenciation EB (jour -2): Passez cellules ES / IPS TrypLE adaptées sur frais MEF à une densité leur permettant d'être 70-80% de confluence le jour de l'installation de différenciation. Nous passons généralement 48 heures avant Spin configuration de EB.
  2. Journée de la configuration de EB Spin dans la phase I de différenciation (jour 0): Pour se préparer à Spin EB placage, pipette 150 ul d'eau stérile dans les 36 puits extérieurs de chaque plaque 96 puits pour minimiser l'évaporation. Utilisez fixation des plaques 96 puits à fond rond, bas seulement.
  3. Aspirer milieux de culture hors des cellules ES / IPS et ajoutez 1,0 ml TrypLE préchauffé Choisir à chaque puits.
  4. Placer les plaques dans l'incubateur (37 ° C) pendant 5 min. Pipette en douceur les cellules hors de la plaque.
  5. Recueillir des cellules dissociées dans un tube conique et la pipette de haut en bas pour séparer les morceaux. Diluer avec 1 TrypLE égales médias BPEL de volume et au moins 1 dPBS de volume égaux.
  6. Retirer le surnageant et remettre lecellules dans 5 ml médias BPEL plus 5 ml DPBS. Répétez rotation.
  7. Éliminer les cellules surnageant et remettre en suspension dans 5-10 ml médias BPEL, selon le nombre de cellules anticipée. Passez cellules à travers 70 filtre um (BD Falcon # 352350) dans un nouveau 50 ml conique afin d'enlever des amas (ce qui peut interférer avec la formation EB).
  8. Compter les cellules filtrées. cellules aliquotes à être utilisé pour le placage dans un ml conique 50 et de spin. Pour placage: 3.000 cellules ES / puits, 60 puits / plaque = 1.8x10 5 cellules ES / plaque.
  9. Après centrifugation, les cellules devront être remises en suspension à 3x10 4 cellules / mL (volume de 100 pl / puits, 3.000 cellules ES / puits).
  10. Préparer un volume de médias BPEL + cytokines suffisantes pour remettre en suspension les cellules (ce sera 6 ml / plaque). Pour la phase I différenciation, nous utilisons SCF (40 ng / ml), BMP4 (20 ng / ml), et le VEGF (20 ng / ml) pour la dérivation de cellules souches hématopoïétiques.
  11. Plaque 100 cellules / puits (= 3.000 cellules / puits) dans chacun des 60 puits intérieurs de la prépaplaques à 96 puits éd. C'est plus facile lorsque vous utilisez une pipette multicanaux et le creux stérile. Assurez-vous de mélanger des cellules par pipetage avant la mise en cuve et travailler rapidement, de sorte que les cellules n'ont pas la chance de se déposer.
  12. Faites tourner les plaques à 96 puits en centrifugeuse réfrigérée pendant 4 min à ~ 1500 rpm, 8 ° C.
  13. Soigneusement transférer les plaques d'une centrifugeuse à 37 ° C incubateur. Éviter de perturber les plaques autant que possible. Vérifiez plaques pour s'assurer que les cellules formées granulés uniformes dans le fond des puits.
  14. Stade je file EB ne doit pas être alimenté ou autrement perturbé par 3-4 jours jusqu'à ce que la différenciation EB ont formé une couche extérieure plus durable. Si EB sera laissé au stade I au-delà de 10-12 jours, nous alimentons parfois EB avec 50 pi médias BPEL fraîches avec des cytokines dans chaque puits (d'abord prendre 50 pi de vieux médias de chaque puits). Dans les 24 heures, les cellules devraient commencer à former une structure EB 3-D, et en 3-5 jours devraient avoir une couche externe distinct, et commencer à déveloping structures kystiques.

5. Dissocier la phase I EB pour FACS analyse

Recueillir EB around18-36 spin pour l'analyse FACS. Si l'analyse des cellules avant le jour 6, d'autres puits sont nécessaires pour obtenir le nombre de cellules suffisant.

  1. Préparer le volume nécessaire de la trypsine avec du sérum de poulet de 2%. Place à 37 ° C bain-marie jusqu'à utilisation.
  2. Transfert de spin EB et des médias à partir de plaques à 96 puits pour tubes coniques de 15 ml.
  3. Laisser EBS pour s'établir à fond des tubes coniques. Avec une pipette de 5 ml, une pipette soigneusement le surnageant et transférer dans un tube séparé (vous pouvez regrouper tout le surnageant dans un tube de 15 ml ou conique de 50 ml). Comme certaines cellules hématopoïétiques ont déjà été libérés de l'EB de spin entre les jours 9 et 11, qui sépare le surnageant contenant ces cellules empêche la trypsine excessive.
  4. Remettre en suspension dans de la trypsine EB + 2% de sérum de poulet: 3-4 ml dans chaque tube conique de 15 ml. Placez EB à la trypsine dans 37 ° C waterbath de 3-7 min. Secouer doucement ou vortex chaque 1-2 min. Au timepoints antérieures (avant le jour 8), EBS briser plus facilement et peut prendre aussi peu que 3 min. Au timepoints plus tard (jour 8 +) EBS peut prendre plus de temps à se dissocier. Nous n'avons généralement pas les laisser trypsiniser pendant plus de 5 minutes à 37 ° C. Remarque, ces temps sont un guide seulement. Pour toute lignée cellulaire particulière ou la différenciation des EB, cela peut prendre plus ou moins de temps pour dissocier l'EBS. Suivre de près la dissociation. Il est important de ne pas laisser les cellules de la trypsine pendant trop longtemps. Il est préférable d'arrêter la trypsine dissociation lorsque seulement quelques petites touffes restent visibles plutôt que d'essayer d'éliminer tous les grumeaux.
  5. Étancher la trypsine avec au moins 1 volume égal de milieu contenant FBS. Isoler les cellules (1500 rpm, 5 min, 8 ° C).
  6. Reprendre les cellules dans un volume approprié des médias pour le comptage (habituellement 3-5 ml).
  7. Cellules filtrer à travers un tamis cellulaire 100 um. Retirer une aliquote de cellules de comptage. Procéder à des cellulesdes protocoles standard de laboratoire FACS.

6. Développement, l'expansion et la caractérisation des cellules NK à partir de cellules progénitrices dérivées HPSC

Parce que le spin EB contient un pourcentage élevé de cellules progénitrices hématopoïétiques, ils peuvent être directement transférés à la culture de cellules NK au jour 11. Le spin EB peut être transféré à plaques à 24 puits avec ou sans mangeoires. Nous avons montré aucune différence dans le phénotype ou fonction entre les cellules NK obtenues à chaque état. Par conséquent, nous transférer généralement aux cultures sans mangeoires d'avoir un système complètement défini pour le développement des cellules NK. Si vous utilisez une lignée de CSEh / de iPSC avec différenciation hématopoïétique optimale l'utilisation des couches d'alimentation est recommandé 7,8.

  1. En utilisant une pipette multicanaux réglé à 100 pi, 6 transfert de spin EBS pour chaque puits d'une plaque à 24 puits.
  2. Avec Feeders: transfert de spin EBS pour plaques à 24 puits contenant 100.000 irradiés (3000 cGY) EL08-1D2 (un embryoni murinec cellules de la lignée des cellules du foie) par puits. Sans mangeoires: transfert EB directement non couché, plaques à 24 puits.
  3. Ajouter 400 ul de milieu de différenciation NK contenant des cytokines (IL-3, IL-15, IL-7, SCF, Flt3L, tous de Peprotech) si le volume total dans chaque puits est d'environ 1 ml.
  4. Placez les cellules dans l'incubateur et nourrir tous les 5-7 jours avec les médias de différenciation NK contenant toutes les cytokines dans l'étape 6.3, sauf IL-3.
  5. Les cellules NK vont exprimer un phénotype adulte à 28 jours après le transfert à la culture de la différenciation des cellules NK (Figure 2).
  6. Pour tester la cytotoxicité des cellules NK, une heure dosage de libération 4 chrome peut être effectué 8.
  7. Si un grand nombre de cellules sont nécessaires pour les études in vivo, co-culture avec des cellules présentatrices de l'antigène artificielles (VAMP) peut produire une expansion de 2 log ou plus. Pour un protocole détaillé, visitez http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood 11,12.

7. D'imagerie par fluorescence et bioluminescence in vivo pour surveiller les CSEh dérivées de cellules NK et les cellules tumorales dans des souris immunodéficientes

Nous utilisons des diabétiques non obèses / déficit immunitaire combiné sévère avec KO chaîne gamma (NOD / SCID / yc - / -) des souris qui sont âgés de 6 à 8 semaines dans toutes nos expériences. Nous utilisons un modèle dual d'imagerie pour suivre simultanément la progression tumorale (turboFP650 journaliste) et CSEh cellules NK cinétique (Fluc journaliste exprimé dans les cellules ES de parents) in vivo. Ce système d'imagerie est largement applicable à d'autres systèmes que le modèle anti-tumorale montré ici. Le spectre SIIV (Caliper Life Sciences) est optimale pour l'imagerie de fluorescence et bioluminescence in vivo simultanée.

  1. 24 heures avant l'injection des cellules tumorales, les souris (225-250 irradient cGY).
  2. Remettre en suspension nombre souhaité decellules tumorales (1 x 10 6 cellules K562 sont affichées) dans 200 ul Iscove modifié Dulbecco moyenne (IMDM) supplémenté avec 20% de FBS. La dose de cellules tumorales peut être varié selon le modèle utilisé. TurboFP650 pourrait également être exprimé en types non-tumorales. Il est préférable d'imager des cellules localisées à un seul emplacement anatomique.
  3. Injecter des cellules tumorales sous-cutanée dans la partie supérieure du thorax gauche de la souris en utilisant une aiguille de calibre 27 ou 28 et permettre de greffer pendant 4 jours. Les cellules doivent former une bulle sous la peau de la souris. Les souris peuvent être rasés dans cette partie du corps afin de mieux visualiser injection. Il expose également la région pour mieux en imagerie de fluorescence in vivo. Injection dans le thorax des souris a été utilisée dans ce modèle, car l'adresse IP cellules NK injectées sont mieux visualisées alors que la souris est en décubitus dorsal. D'autres méthodes d'administration sous-cutanée, y compris le dos ou le flanc, sont moins stressant pour l'animal et doivent être considérés.
  4. Reprendre le nombre souhaité de CSEh DeriLes cellules NK ved (10 x 10 6 cellules NK sont affichées) dans 300 ul Iscove modifié Dulbecco moyenne (IMDM) supplémenté avec 20% de FBS sans antibiotiques.
  5. Injecter des cellules NK CSEh dérivées dans chaque voie intrapéritonéale souris (IP) en utilisant une aiguille de calibre 27 ou 28. Pour toutes les expériences, les souris recevant pas de perfusion des cellules tumorales ou NK comme contrôle négatif.
  6. Pour maintenir les populations de cellules NK in vivo, donner des souris un ul injection 250 IP de l'IL-2 (1x10 4 U / souris) et de l'IL-15 (10 ng / souris) dans DPBS stérile chaque jour pendant les 7 premiers jours, suivie par l'IL- 2 seulement tous les 2 à 3 jours jusqu'à ce que le moment du sacrifice.
  7. Surveiller la greffe de cellules NK CSEh dérivées de l'imagerie par bioluminescence. Injecter chaque IP de la souris avec 120 ul D-luciférine (150 mg / kg). L'image de la souris 10 minutes après l'injection D-luciférine.
  8. Anesthésier la souris en utilisant une chambre permettant l'entrée isoflurane dans la boîte à 0,8 l / min. Assurez-vous qu'il est également le flux d'oxygène dans la chambre.
  9. Placez anesthésiésouris dans SIIV spectre et souris sécurisées sur le dos avec du ruban adhésif velcro et permettre l'entrée isoflurane dans la boîte à 0,5 l / min pour maintenir l'anesthésie.
  10. Régler la machine SIIV pour corriger plate-forme d'imagerie (D 4-5 souris, C pendant 3 ou moins de la souris), mis en binning à moyen, f / stop à 1 et l'image acquérir pendant 1 min.
  11. Pour effectuer l'imagerie de fluorescence pour turboFP650 cellules +, utilisez l'assistant d'imagerie de mettre en place une analyse des émissions de mesurer la sonde d'intérêt ainsi que le signal de fond. Dans la liste des sondes choisissent Em d'entrée / EX, et entrent en excitation et d'émission correct. Pour turboFP650, utiliser 605 excitation et d'émission de 660 à 720 pour mesurer signal de la tumeur et 570 excitation et 640-720 émission de mesurer le signal de fond. Utiliser les paramètres d'exposition auto et sélectionnez la plate-forme d'imagerie désiré. La séquence d'imagerie entière prendra généralement 3-5 min à acquérir.
  12. Permettre souris se remettre complètement de l'anesthésie avant de le transporter à partir du système d'imagerie. Analyser des images en utilisant le LiVing logiciel Image version du paquet 4.2 (Caliper Life Sciences).
  13. Quantifier signal de bioluminescence en utilisant une région d'intérêt (ROI) mis à flux total (photons / s) ou radiance moyenne (photons / sec / cm 2 / sr) et régler toutes les images à la même échelle (figure 3). Ici, des images représentatives sont utilisés pour démontrer les deux populations de cellules dans chaque souris (figure 3). D'autres études de notre laboratoire ont démontré colocalisation utilisant cette technique 20. synchronisation de colocalisation devra être optimisé basé sur le modèle expérimental utilisé.
  14. Pour quantifier signal fluorescent à partir de la séquence de balayage des émissions utiliser la fonction "Déconvolution spectrale" In Living image. Sélectionnez les images à inclure dans l'analyse et d'en tirer un masque sur la zone de la souris contenant le signal d'intérêt, dans ce cas, la partie supérieure du thorax. Sélectionnez autofluorescense des tissus et de la sonde inconnue à mélange. Si les souris reçoivent de la nourriture contenant la luzerne, le signal de la nourriture peut aussi être unmixed de la sonde d'intérêt et l'auto-fluorescence des tissus.
  15. Si les images obtenues ne montrent pas une répartition uniforme de l'autofluorescence des tissus (y compris la zone où se trouve le signal) contraintes peuvent être définies pour obtenir une distribution homogène et une meilleure séparation des composants étant non mélangées. Ceci est typique et souvent nécessaire pour les sondes qui ne sont pas dans le logiciel et lorsque le signal spécifique est faible, soit près de signal de fond. Définir un filtre passe-haut, qui se trouve sous l'onglet mise à jour, pour 640 nm, ce qui correspond à l'extrémité inférieure de la courbe d'émission pour turboFP650. Une contrainte de filtre passe-bas peut également être réglé, mais il n'était pas nécessaire pour l'analyse d'imagerie montré ici.
  16. Quantifier signal fluorescent de l'image sans mélange avec une région d'intérêt (ROI) mettre à l'efficacité énergétique (photons / sec / cm 2 / sr) / mW) et régler toutes les images à la même échelle (figure 3).
  17. Lors d'un point de temps souhaité, les souris peuvent être sacrifiés et analysés pour engraftment de cellules dérivées de CSEh par cytométrie de flux. Pour les cellules NK par voie intrapéritonéale, nous analysons généralement le sang périphérique (saignement des veines du visage), de la rate, et du péritoine. Lavages péritonéaux peuvent être effectuées tout en exposant la membrane péritonéale et en faisant une incision médiane juste assez large pour permettre une pipette Pasteur en verre pour accéder à la cavité péritonéale. Utilisation de PBS stérile, effectuer plusieurs lavages de la cavité péritonéale en veillant à mélanger la solution à fond en faisant pivoter la souris. Recueillir suffisamment de liquide jusqu'à ce que vous avez une pastille après centrifugation visible (typiquement 5-10 ml de lavage).

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Representative Results

La génération de cellules progénitrices hématopoïétiques en utilisant l'approche de EB de rotation permet un développement optimal des cellules NK à partir de CSEh et iPSCs. Comme le montre la figure 2, jour 11 de spin EB contient un pourcentage élevé de cellules progénitrices exprimant CD34, CD45, CD43, CD31 et. Des niveaux élevés de CD34 et CD45 permet le transfert direct des conditions NK sans avoir besoin de tri ou de soutenir les cellules stromales. Si il n'est pas optimale rotation EB différenciation, il est recommandé que les cellules stromales comme EL08-1D2 sont utilisés dans les conditions NK secondaires. Après 4 semaines de culture du spin EB donnent lieu à un grand nombre de cellules NK (environ 1-2 x 10 6 cellules par puits d'une plaque de 24 puits). Les cultures peuvent également être phénotypées au antérieures points dans le temps pour voir la progression graduelle du développement des cellules NK dans ce système 7. Les cellules NK maintenir l'expression des gènes reporters qui ont été modifiés dans le parent ES / IPS ligne et donc peut alors être suivie (figure 3). Utilisation de la fonction de déconvolution spectrale dans Living logiciel d'image, autofluorescence des tissus peut être soustraite à optimiser signaux des cellules marquées par fluorescence.

Figure 1
Figure 1. Système d'imagerie double et un calendrier de développement. A) Schéma du modèle in vivo. Les souris sont injectés IP avec luciférine, et après le temps d'incubation approprié, la luciférase de luciole + cellules sont imagées pour le signal de bioluminescence. Suite à l'acquisition de l'image de bioluminescence, signal fluorescent de TurboFP650 cellules + peut être imagé. B) Timeline pour le développement et le test de CSEh DerivLes cellules NK éd.

Figure 2
Figure 2. Phénotype de rotation EB et les cellules NK dérivé de CSEh et iPSCs. A) après 11 jours en rotation culture EB, les cellules peuvent être analysées par cytométrie de flux. Le jour de 11 points de temps donne des pourcentages élevés de CD34, CD43, CD45, CD31 et des cellules exprimant optimales pour la différenciation des cellules NK. B) Les cellules NK peuvent être détectés en utilisant la cytométrie de flux après 4 semaines de culture des cellules NK. Cellules dans la porte lymphocytes (FSC / SSC parcelle) sont analysés pour l'expression de CD56. Cellules CD56 + peuvent être analysés pour la co-expression de marqueurs tels que CD94, CD117, NKp46, ou autres. Cliquez ici pour agrandir la figure .


Figure 3. Imagerie de fluorescence et bioluminescence in vivo en utilisant le spectre SIIV. Surveillance in vivo est l'objectif principal de ce protocole. Par conséquent, les souris ne sont pas respectées sur le dégagement tumeur. Notre précédent rapport (en utilisant 200.000 cellules K562) démontre que la clairance de la tumeur survient à trois semaines 7. A) l'imagerie bioluminescente de Fluc + CSEh dérivées de cellules NK au jour 0, 7 et 14 après l'injection des cellules NK est indiqué dans la rangée du haut. Imagerie de fluorescence de TurboFP650 + K562 au jour 0, 7 et 14 après l'injection des cellules NK est indiqué dans la rangée du bas. Images fluorescentes ont été acquises immédiatement après l'acquisition d'images de bioluminescence. B) Séquence montrant autofluorescence des tissus et signal fluorescent de turboFP650 + cellules, générée à l'aide de la fonction de déconvolution spectrale dans les logiciels d'image Living. La souris à l'extrême gauche de chaque image est un contrôle non-injection et ne montre que le signal de fond. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Discussion

CSEh sont une plateforme idéale pour étudier divers types de cellules et maintenir un potentiel considérable de traduction clinique. Nous utilisons une approche EB rotation définies pour différencier les CSEh / iPSCs de cellules souches hématopoïétiques. L'approche de l'EB de spin a donné dérivation cohérente de cellules souches hématopoïétiques et la différenciation de cellules NK, et pourtant, variation existe encore dans l'efficacité de différenciation dans les lignées cellulaires et peut-être besoin d'être modifié pour la production d'autres lignées de cellules hématopoïétiques. Bien que des résultats comparables peuvent être obtenus auprès de dérivation dans d'autres EB ou des méthodes de culture du stroma, ce système est sans sérum et représente une approche plus défini pour la production de progéniteurs hématopoïétiques rapport aux autres méthodes. Nous avons également standardisé une méthode efficace pour obtenir des cellules NK de ces progéniteurs hématopoïétiques d'une manière similaire chargeur-libre, qui surmonte une préoccupation majeure pour la traduction clinique. Il fournit également un système défini pour étudier developmen des cellules NKT in vitro. Vaste pré-clinique, la caractérisation in vivo de cellules hématopoïétiques, telles que les cellules NK, est également nécessaire de définir précisément ces types de cellules obtenues expérimentalement et leur application à des essais cliniques.

Les progrès de l'imagerie et des techniques de microscopie ont permis à long terme et non-invasive dans le suivi in vivo de cellules exprimant journalistes bioluminescentes et fluorescent 15-17,19,21. Le plus notable est l'utilisation de la luciférase de luciole construction, qui a été utilisé pour visualiser les différents types de cellules depuis sa caractérisation initiale. Il s'agit d'un journaliste idéal pour l'imagerie in vivo, mais se limite à la surveillance d'une population de cellules. Le plus grand avantage d'un système dual-journaliste est la capacité de suivre les interactions entre les deux populations cellulaires distinctes. Cependant, peu de journalistes ont été développés qui sont à la fois facile à l'image in vivo et avoir suffisamment de signal et quantifiable dessusarrière-plan.

TurboFP650, la protéine fluorescente utilisée dans notre système dual-imagerie, est décalée rouge lointain, qui donne le signal distinct de autofluorescence de fond. Cependant, l'utilisation de méthodes de déconvolution spectrale dans les logiciels d'image Living (Caliper Life Sciences) était nécessaire pour maximiser le rapport signal à fond dans notre système. Il ya beaucoup de fonctionnalités dans le logiciel Image Living capables d'aider les défis intrinsèques de l'imagerie de la protéine fluorescente. Pourtant, le signal pénétrance reste un défi. Le système a besoin d'une optimisation pour l'imagerie de petites populations de cellules ou d'imagerie des cellules dispersées, comme ce serait le cas si les cellules tumorales ont été injectées IP. Cependant, la cohérence et la facilité d'imagerie de fluorescence rend son utilisation d'une plate-forme idéale à utiliser dans un modèle dual d'imagerie. Les animaux sont sous anesthésie pour moins de temps et il n'est pas nécessaire de fournir un second substrat comme avec la plupart des systèmes à double luciférase.

Cette méthodede dérivation, l'expansion et double-imagerie in vivo fournit une approche cohérente pour produire des cellules NK CSEh dérivées ou iPSC-dérivées, ainsi que leur évaluation qui est nécessaire pour améliorer les thérapies actuelles adoptifs de cellules NK. Le modèle d'imagerie double fluorescent et bioluminescence est largement applicable pour l'étude à long terme des deux populations cellulaires distinctes autres que le modèle anti-tumorale, nous avons montré.

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Disclosures

Ce travail a été soutenu par le NIH / NHLBI R01-HL77923 (DSK) et par le NIH MSTP subvention T32 GM008244 (DAK), Stem Cell Biology Training Grant T32 (DAK) (T32HD060536), Programme des possibilités de recherche de premier cycle (PIRPC) Grant, de l'Université du Minnesota (AMB), le Fonds de recherche sur la leucémie de l'Université du Minnesota Cancer Center, et le William L et Fondation Blanche Hughes.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier Melinda Hexum pour l'initiation du protocole d'EB de rotation au sein de notre laboratoire. Nous tenons à remercier les autres membres du laboratoire, y compris Laura E. Bendzick, Michael Lepley, et Zhenya Ni pour leur assistance technique à ce travail. Les auteurs tiennent également à remercier Brad Taylor à Caliper Life Sciences pour son expertise technique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Media
BPEL media for Spin EB generation
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Fisher Scientific SH3022801
F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I Invitrogen 31765035
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3311 Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity.
Poly(vinyl alcohol) Sigma-Aldrich P8136
Linoleic Acid Sigma-Aldrich L1012
Linolenic Acid Sigma-Aldrich L2376
Synthechol 500X solution Sigma-Aldrich S5442
a-monothioglycerol (a-MTG) Sigma-Aldrich S5442
Protein-free hybridoma mix II Invitrogen 12040077
Ascorbic Acid 2-phosphate Sigma-Aldrich A8960
Glutamax I Invitrogen 35050061
Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS) Invitrogen 41400-045
Pen-Strep Invitrogen 15140122
NK Differentiation Media
Dubecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Invitrogen 11965-118
F-12 Media Invitrogen CX30315
15% Human AB serum Valley Biomed HP1022HI
5 ng/ml Sodium Selenite Sigma-Aldrich S5261
50 uM ethanolamine Sigma-Aldrich E9508
20 ng/ml ascorbic acid Sigma-Aldrich A8960
25 uM 2-mercapt–thanol (BME) Gibco 21985
2 mM L-glutamine Gibco CX30310
1% Pen-Strep Invitrogen 15140122
Cytokines
(all cytokines used fresh from frozen aliquots)
SCF PeproTech, Inc. 300-07 40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot.
rhBMP-4 R & D Systems 314-BP 20 ng/ml in BPEL media
rhVEGF R&D Systems 293-VE 20 ng/ml in BPEL media
IL-2 PeproTech, Inc. 200-02 1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol
IL-15 PeproTech, Inc. 200-15 10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only)
IL-3 PeproTech, Inc. 200-03 5 ng/ml in NK media
IL-7 PeproTech, Inc. 200-07 20 ng/ml in NK media
Flt-3-Ligand PeproTech, Inc. 300-19 10 ng/ml in NK media
In vivo Imaging
D-Luciferin Sodium Salt Gold BioTechnology Lucna-500
TurboFP650 plasmid Evrogen, Moscow, Russia FP731 Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab.
Equipment
IVIS Spectrum Imaging System Caliper Life Sciences
Cells
Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells MD Anderson, Houston, TX contact: Dean A. Lee. http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood
Firefly luciferase expressing hESCs University of Minnesota, Minneapolis, MN contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5' end of a GFP:zeocin fusion construct.
TurboFP650 expressing K562 cells University of Minnesota, Minneapolis, MN contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section

Materials Table.

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References

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