अपरा पार Xenobiotics और Nanomaterials की परिवहन दर के निर्धारण का उपयोग करते हुए
1Department of Obstetrics, Perinatal Pharmacology, University Hospital Zurich, 2Laboratory for Materials - Biology Interactions, EMPA Swiss Federal Laboratories for Materials Testing and Research, 3Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern

Bioengineering

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Summary

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Grafmüller, S., Manser, P., Krug, H. F., Wick, P., von Mandach, U. Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model. J. Vis. Exp. (76), e50401, doi:10.3791/50401 (2013).

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Abstract

मानव प्लेसेंटा दशक पहले मां और अजन्मे बच्चे के बीच एक अभेद्य अवरोध होने लगा था. हालांकि, thalidomide प्रेरित जन्म दोष और बाद में कई अध्ययनों की खोज के बाद सामने साबित कर दिया. आज निकोटीन जैसे कई हानिकारक xenobiotics, हेरोइन, मेथाडोन या दवाओं के साथ ही पर्यावरण प्रदूषण इस बाधा को दूर करने के लिए बताया गया. नैनो के बढ़ते उपयोग के साथ, नाल या तो गलती से संपर्क के माध्यम से या जानबूझकर संभावित नैनोमैडिकल अनुप्रयोगों के मामले में उपन्यास नैनोकणों के साथ संपर्क में आने की संभावना है. नाल सबसे प्रजाति विशेष स्तनधारी अंग 1 है क्योंकि पशु प्रयोगों से डेटा मनुष्य के लिए extrapolated नहीं किया जा सकता. इसलिए, Panigel एट अल द्वारा विकसित पूर्व vivo दोहरी recirculating मानव अपरा छिड़काव,. 1967 में 2 और लगातार श्नाइडर एट अल द्वारा संशोधित. 1972 3 में, एक शानदार मॉडल टी के रूप में काम कर सकते हैंxenobiotics या कणों के हस्तांतरण अध्ययन ओ.

यहाँ, हम प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए मानव अपरा छिड़काव प्रोटोकॉल और इसके आगे के विकास recirculating पूर्व vivo दोहरी पर ध्यान केंद्रित.

अपरा शल्यक्रिया से प्रसव के दौर से गुजर सीधी अवधि गर्भधारण से माताओं के सूचित सहमति के बाद प्राप्त किया गया. एक अक्षुण्ण गर्भदल की भ्रूण और मातृ जहाजों के कम से कम पांच घंटे के लिए cannulated और perfused थे. एक मॉडल कण के रूप में 80 के आकार और व्यास में 500 एनएम के साथ fluorescently लेबल polystyrene के कणों मातृ सर्किट से जोड़ा गया था. 80 एनएम कणों अपरा बाधा पार और 500 एनएम कणों अपरा ऊतक या मातृ सर्किट में बनाए रखा गया है, जबकि भ्रूण को अपरा भर में स्थानांतरित कर रहा है जो एक पदार्थ के लिए एक आदर्श उदाहरण प्रदान करने में सक्षम थे. पूर्व vivo मानव अपरा छिड़काव मॉडल के बारे में विश्वसनीय जानकारी उपलब्ध कराने के कुछ मॉडलों में से एक हैभविष्य कहनेवाला और नैदानिक ​​प्रासंगिक डेटा बचाता है, जो एक महत्वपूर्ण ऊतक बाधा पर xenobiotics के परिवहन के व्यवहार.

Introduction

नाल ऑक्सीजन, कार्बन डाइऑक्साइड, पोषक तत्वों और अपशिष्ट उत्पादों की और माँ और एक दूसरे से अलग बढ़ती भ्रूण के दो रक्त सर्किट रखने में सक्षम एक ही समय पर आदान प्रदान के लिए जिम्मेदार है जो एक जटिल अंग है. इसके अतिरिक्त, यह मातृ प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा बच्चे की अस्वीकृति को रोकता है और गर्भावस्था बनाए रखने के लिए हार्मोन स्रावित करता है. सेलुलर बाधा 4,5 पार्श्व कोशिका झिल्ली के बिना एक सच्चे संकोश फ्यूज और जो फार्म कोशिकापोषकप्रसू कोशिकाओं द्वारा बनाई है. पूरे नाल एक भ्रूण विलस पेड़ होते हैं और नाल में से एक कार्यात्मक इकाई का प्रतिनिधित्व करते हैं जो कई बीजपत्र, में आयोजित किया जाता है.

अपरा बाधा समारोह का अध्ययन 1960 में thalidomide प्रेरित विरूपताओं की खोज के साथ तेज था. स्पष्ट कारणों के लिए गर्भवती महिलाओं के साथ स्थानान्तरण पढ़ाई नहीं की जा सकती. नतीजतन, विभिन्न वैकल्पिक मॉडल 6,7 विकसित किया गया है 2,3 द्वारा विकसित पूर्व vivo मानव अपरा छिड़काव मॉडल है.

कई महिलाओं को इस तरह अपनी गर्भावस्था 8 के दौरान दवाओं या पर्यावरण प्रदूषण के रूप में विभिन्न xenobiotics के संपर्क में हैं. पहले से ही गर्भावस्था के दौरान नियमित रूप से प्रशासित थे जो कुछ दवाओं के लिए, vivo अध्ययन में गर्भनाल रक्त में उस के साथ मातृ रक्त एकाग्रता की तुलना द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है. हालांकि, आम तौर पर भ्रूण और इन पदार्थों के teratogenicity में फार्माकोकाइनेटिक्स और गतिशीलता के बारे में केवल सीमित जानकारी है.

हेरोइन आसानी से अपरा बाधा पार और अंतर्गर्भाशयी विकास प्रतिबंध, अपरिपक्व प्रसव या सहज गर्भपात 9,10 को जन्म दे सकता है जैसे उदाहरण के लिए opiates. तो, गर्भावस्था के दौरान लापता संयम के मामले में मेथाडोन के साथ एक रिप्लेसमेंट थेरेपी की सिफारिश की है. पूर्वविवो मानव अपरा छिड़काव मॉडल भ्रूण संचलन में मेथाडोन के हस्तांतरण वितरण 12 के बाद की गणना गर्भनाल रक्त से मातृ रक्त एकाग्रता अनुपात के साथ अच्छी तरह से संबद्ध है, जो नगण्य 11, पता चला है कि.

नैनो विशेष रूप से चिकित्सा में एक से बढ़ क्षेत्र है. तो, स्वाभाविक रूप से ठीक होने वाली (व्यास में <2.5 माइक्रोन) और जंगल की आग, ज्वालामुखी विस्फोट के धुएं में और रेगिस्तान धूल में ultrafine कणों (व्यास में <0.1 माइक्रोन), इंजीनियर nanomaterials के लिए जोखिम (कम से कम एक आयाम <0.1 माइक्रोन 13 के नीचे ) बढ़ती जा रही है. इस इंजीनियर nanomaterials की विषाक्तता क्षमता के बारे में सवाल उठाया था. कोई मानवीय संकट अभी तक साबित किया जा सकता है, इंजीनियर नैनोकणों विषाक्तता परिणामों के लिए 14 प्रमुख प्रतिकूल जैविक प्रतिक्रियाओं पैदा कर सकता है यह दर्शाता है कि प्रिंसिपल प्रयोगात्मक अध्ययन कर रहे हैं. हाल ही में, कुछ अध्ययनों से पता चला है कि जन्म के पूर्व का जोखिम संकेतवायु प्रदूषण नवजात शिशुओं और बच्चों 15,16 में एक उच्च सांस की जरूरत है और airway सूजन से जुड़ा हुआ है. इसके अलावा, छोटे नैनोकणों विशेष रूप से भ्रूण या माता या तो इलाज के लिए दवा वाहक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. इसलिए, यह अलग xenobiotics या nanomaterials और अपरा बाधा पार करने की क्षमता के व्यापक अध्ययन के लिए आवश्यक हैं कि स्पष्ट हो जाता है. इंजीनियर nanomaterials को अपरा पारगम्यता पर वर्तमान अध्ययन पर एक वास्तविक सिंहावलोकन मेनेजीस एट अल में संक्षेप. 2011 17 और Buerki-Thurnherr एट अल. 2012 7.

मानव अपरा छिड़काव मॉडल recirculating पूर्व vivo दोहरी के लिए जिम्मेदार तंत्र की तरह विभिन्न अंतर्जात और exogenous यौगिकों 3,11,12,18,19 की अपरा परिवहन और नाल के अन्य कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए एक नियंत्रित और विश्वसनीय प्रणाली प्रदान करता है प्राक्गर्भाक्षेपक जैसे रोग राज्यों की विकास <> 20-22 समर्थन. संचय, प्रभाव और xenobiotics या नैनोकणों के एक व्यापक सेट के स्थानान्तरण दरों के अध्ययन की अनुमति देते हैं कि इस प्रोटोकॉल में हम सेट पर मुख्य रूप से ऊपर ध्यान केंद्रित, हैंडलिंग और विधि.

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Protocol

1. छिड़काव प्रणाली की तैयारी

  1. एक पानी के स्नान, एक छिड़काव चैम्बर, oxygenation के लिए दो कॉलम, दो क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप, दो बुलबुला जाल, दो प्रवाह हीटर और एक प्रेशर सेंसर (चित्रा 1) से मिलकर छिड़काव प्रणाली की स्थापना की. चित्रा 2 में योजना के अनुसार सिलिकॉन और क्लोराइड सामग्री से बना ट्यूबिंग वर्गों के साथ इन घटकों से कनेक्ट करें. अंत में क्रमश: भ्रूण और मातृ सर्किट का प्रतिनिधित्व दो सर्किट हैं.
  2. पानी के स्नान, प्रवाह हीटर और छिड़काव चैम्बर के लिए हीटिंग पर मुड़ें. तापमान 37 डिग्री सेल्सियस होना चाहिए
  3. (NCTC-135 टिशू कल्चर मध्यम अर्ल के बफर (6.8 छ / एल सोडियम क्लोराइड, 0.4 ग्राम / एल पोटेशियम क्लोराइड, 0.14 ग्राम / एल मोनोसोडियम फॉस्फेट, 0.2 ग्राम / एल मैग्नीशियम सल्फेट, 0.2 ग्राम के साथ 01:02 पतला छिड़काव मध्यम वार्म अप / एल कैल्शियम क्लोराइड, 2 ग्राम / एल ग्लूकोज) शर्करा (1 ग्राम / एल), dextran के 40 (10 जी / एल), गोजातीय सीरम albumin (10 ग्राम के साथ पूरक/ एल), सोडियम हेपरिन (2,500 आइयू / एल), amoxicilline (250 मिलीग्राम / एल) और सोडियम बाइकार्बोनेट (2.2 छ / एल), नहाने के पानी में पीएच 7.4).
  4. - 20 मिली 15: लगातार फिर से 200 मिलीलीटर आसुत जल (प्रवाह की दर एक) 200 मिलीलीटर आसुत जल के साथ भ्रूण और मातृ सर्किट की धमनी प्रणालियों, ख) 50 मिलीलीटर 1% सोडियम हाइड्रोक्साइड, ग) 1% फॉस्फोरिक एसिड और घ) कुल्ला / मिनट).
  5. भ्रूण प्रवेशनी कनेक्ट (ँ 1.2 मिमी, कुंद सुई एक संशोधित पंख सुई संचार सेट करने के लिए संलग्न किया जाना चाहिए) भ्रूण धमनी ट्यूबिंग लिए.
  6. सभी ट्यूबों मध्यम (15-20 मिलीग्राम / मिनट प्रवाह दर) होते हैं जब तक छिड़काव के माध्यम से भ्रूण और मातृ सर्किट की धमनी प्रणालियों कुल्ला. इस चरण के दौरान बुलबुला जाल को भरने और जाल के सभी बुलबुले बहाव को हटा दें. इसके बाद पंप बंद करो. यह अभिवाही धमनी ट्यूबों हमेशा बुलबुले के लिए स्वतंत्र हैं कि वास्तव में महत्वपूर्ण है, अन्यथा केन्युलेशन के बाद विशेष रूप से ठीक भ्रूण वाहिकाओं टूटना कर सकते हैं.
  7. गैस प्रवाह चालू करें. मातृ सर्किट वाई oxygenated हैवें 5% कार्बन डाइऑक्साइड और 5% कार्बन डाइऑक्साइड और 95% नाइट्रोजन के साथ 95% कृत्रिम हवा और भ्रूण सर्किट.
  8. प्रेशर सेंसर की रिकॉर्डिंग शुरू करें.

2. अपरा Cannulating

  1. प्राथमिक सीजेरियन सेक्शन के बाद सीधी अवधि गर्भधारण से बरकरार अपरा प्राप्त करते हैं. लिखित सहमति डिलीवरी से पहले मां द्वारा (हमारे अध्ययन के मामले में प्राप्त हुई थी) दिया जाता है और अध्ययन (हमारे अध्ययन में मामला था) स्थानीय आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया जाना है. प्रथम दृश्य नियंत्रण एक स्वस्थ और बरकरार नाल आश्वस्त करने के लिए दाइयों द्वारा किया जाना चाहिए.
  2. नाल की केन्युलेशन एक महत्वपूर्ण कदम है! छिड़काव के दौरान ऊतकों में हर छोटे व्यवधान मातृ और भ्रूण संचलन के बीच एक दरार पैदा कर सकते हैं. नाल प्रसव के बाद 30 मिनट के भीतर प्राप्त हो गया है.
  3. मातृ पक्ष पर दिखाई अवरोधों के बिना नाल का सीमांत क्षेत्र में एक अक्षुण्ण अंकुर का चयन करें. कोरियोनिक थाली में,नाल की धमनी और शल्य सिवनी सामग्री का उपयोग करके बाद में केन्युलेशन पक्ष (गर्भनाल) की ओर करने के लिए नदी के ऊपर नस के दोनों जुड़े शाखाओं टाई. हमेशा दो समुद्री मील करें.
  4. पहले भ्रूण धमनी cannulate. भ्रूण अपरा धमनियों हमेशा नसों की तुलना में छोटे और पतले हैं.
  5. भ्रूण धमनी के चारों ओर एक सिवनी करें, लेकिन यह तुरंत टाई नहीं है. एक संदंश के साथ पोत पकड़ो, ध्यान से पोत कटौती और धमनी में छोटे प्रवेशनी (ँ 1.2 मिमी) डाल दिया. फिर सिवनी (दो समुद्री मील) टाई.
  6. एक ही तरीके से भ्रूण नस के साथ आगे बढ़ें, लेकिन एक बड़ा प्रवेशनी उपयोग (Ø 1.5-1.8 मिमी, कुंद सुई एक संशोधित पंख सुई संचार सेट करने के लिए संलग्न किया जाना चाहिए).
  7. भ्रूण पंप (2 मिलीग्राम / मिनट) पर मुड़ें. वहाँ कोई दिखाई रिसाव है और रक्त भ्रूण नस प्रवेशनी के बाहर निकलती हैं, तो धीरे से 4 मिलीग्राम / मिनट तक का प्रवाह बढ़ाने के लिए. भ्रूण धमनी में दबाव महसूस करते हैं, यह 70 mmHg से अधिक नहीं होनी चाहिए. भ्रूण या दोस्त से कम तरल पदार्थ लीक से बाहर हैंrnal प्रवेशनी एक और सिवनी के साथ उन्हें ठीक.
  8. भ्रूण पक्ष के साथ ऊतक धारक पर नाल ऊपर रखें और spikes से अधिक अपरा झिल्ली और ऊतकों को खींच. अंत में perfused गर्भदल ऊतक धारक में छेद के बीच में होना चाहिए.
  9. केवल झिल्ली एक सिलिकॉन झिल्ली (ँ 1 मिमी) या वैकल्पिक रूप से दो parafilm के टुकड़े के साथ नाल रखती है जहां हिस्से को स्थिर.
  10. पूरा ऊतक धारक इकट्ठा, शिकंजा कसने और ऊपर ऊतक में कटौती. शिराओं और धमनियों cannulae चुटकी नहीं कर रहे हैं कि ध्यान दें, लेकिन बजाय ऊतक धारक के छोटे चैनलों में रखना कृपया.
  11. उल्टा, ऊतक धारक बारी छिड़काव चैम्बर में डाल दिया और कवर जोड़ें. अब, मातृ पक्ष के शीर्ष पर होना चाहिए. भ्रूण सर्किट अभी भी बरकरार है और मध्यम भ्रूण नस ट्यूबिंग के बाहर बह रहा है तो हमेशा की जाँच करें.
  12. मातृ पंप (12 मिलीग्राम / मिनट) पर मुड़ें. वें से कम तीन कुंद cannulae (ँ 0.8 मिमी) का परिचयdecidual थाली मर्मज्ञ द्वारा intervillous अंतरिक्ष में मातृ धमनी ट्यूब की ई अंत. मातृ सर्किट को perfusate लौटने के लिए भी छिड़काव कक्ष के ऊपरी भाग में न्यूनतम स्थिति को मातृ पंप के साथ जुड़ा हुआ है जो शिरापरक नाली के रूप में एक ट्यूब डाल दिया.
  13. भ्रूण नस ट्यूब भ्रूण नस प्रवेशनी जुड़ें.

3. छिड़काव के पूर्व और प्रायोगिक चरण निष्पादित

  1. ऊतक प्रसव के बाद इस्कीमिक अवधि से उबरने के लिए और intervillous अंतरिक्ष में रक्त बाहर निकलवाने के लिए अनुमति देने के लिए, 20 मिनट के पूर्व के चरण एक खुला आवश्यक है. मातृ और भ्रूण नस इसका मतलब है कि छिड़काव मध्यम युक्त धमनी जलाशय को वापस प्रमुख नहीं हैं. एक बोतल में भ्रूण और मातृ शिरापरक बहिर्वाह लीजिए और पूर्व चरण के बाद यह त्यागें.
  2. छिड़काव की अखंडता का आकलन करने के लिए 20 मिनट के एक और पूर्व चरण के प्रदर्शन पर एक क्लोज सर्किट में. छिड़काव माध्यम के साथ दो अलग जलाशयों का प्रयोग करेंभ्रूण और मातृ सर्किट के लिए और भ्रूण जलाशय और मातृ जलाशय में मातृ शिरापरक बहिर्वाह पीठ में वापस भ्रूण शिरापरक बहिर्वाह प्रमुख द्वारा सर्किट बंद.
  3. मुख्य छिड़काव प्रयोग के लिए 120 मिलीलीटर छिड़काव मध्यम (मातृ के लिए एक और भ्रूण जलाशय के लिए एक) के साथ दो बोतल तैयार करते हैं. और एक मातृ जलाशय का विश्लेषण करना चाहता है जो fluorescently लेबल जीनोबायोटिक या नैनोकणों: (रेडियोधर्मी पदार्थ, सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है सावधानी 4 NCI / एमएल) radiolabeled 14 सी antipyrine जोड़ें. अच्छी तरह से मातृ perfusate मिलाएं.
  4. दोनों तैयार बोतल (भ्रूण और मातृ जलाशयों) के साथ शुद्ध छिड़काव मध्यम आदान प्रदान द्वारा प्रयोग शुरू करें. भ्रूण जलाशय में भ्रूण शिरापरक बहिर्वाह पीठ और मातृ जलाशय में मातृ शिरापरक बहिर्वाह वापस प्रमुख द्वारा सर्किट बंद करें.
  5. 6 घंटे के लिए छिड़काव जारी है और नियमित रूप से नमूने लेने. हमेशा भ्रूण और मातृ में मध्यम resuspendवापसी से पहले जलाशय.
  6. छिड़काव के दौरान भ्रूण धमनी (70 mmHg से अधिक नहीं होना चाहिए), दोनों सर्किट में पीएच (एक शारीरिक सीमा 7.2-7.4 में होना चाहिए) और जलाशयों दोनों की मात्रा (भ्रूण की मात्रा घटाने 4 मिलीग्राम / घंटा से अधिक नहीं होना चाहिए) में दबाव को नियंत्रित . यदि आवश्यक हो हाइड्रोक्लोरिक एसिड या सोडियम हाइड्रोक्साइड का उपयोग पीएच मान को समायोजित.
  7. भ्रूण जलाशय में मात्रा घटाने 4 से अधिक है मिलीग्राम / घंटा वहाँ ऊतक में एक दरार है और एक छिड़काव रोक दिया है. रिसाव के बिना 6 घंटे के लिए एक छिड़काव की सफलता दर के बारे में 15-20% है.
  8. 6 घंटे के बाद छिड़काव बंद करो. पंप, जल स्नान, प्रवाह हीटर और गैस के प्रवाह की बारी है.
  9. ऊतक धारक से नाल निकालें, perfused गर्भदल कटौती (unperfused ऊतकों की तुलना में उज्जवल) और यह वजन.
  10. Unperfused (शुरुआत में काट दिया गया है, जो प्लेसेंटा का हिस्सा है, जो पहले से ही पूर्व के चरण के दौरान लिया जा सकता है) से नमूने लेने और perfused ऊतक (प्रत्येक 1 के बारे में छ) और -20 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें स्टोरhomogenization में जब तक या बाद में विश्लेषण के लिए तरल नाइट्रोजन में. Histopathological मूल्यांकन के लिए नि: संक्रामक 4% में एक और ऊतक नमूना ठीक करें. नमूने नाल की सभी परतों को शामिल करना चाहिए.
  11. ) क्रमिक, एक) 200 मिलीलीटर आसुत जल के साथ ख भ्रूण और मातृ सर्किट की धमनी प्रणालियों rinsing द्वारा 50 मिलीलीटर 1% सोडियम हाइड्रोक्साइड, ग) फिर 50 मिलीलीटर 1% फॉस्फोरिक एसिड और घ) 200 मिलीलीटर आसुत जल छिड़काव के बाद ट्यूबों साफ (प्रवाह: 15-20 मिलीग्राम / मिनट).

नाल छिड़काव प्रयोग के पूरे काम करने की प्रक्रिया में 3 चित्र में दिखाया गया है.

4. नमूने का विश्लेषण

  1. अवशिष्ट एरिथ्रोसाइट्स को दूर करने के विश्लेषण से पहले 800 XG पर 10 मिनट के लिए perfusate नमूने अपकेंद्रित्र. आगे के विश्लेषण के लिए सतह पर तैरनेवाला लो. नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर छोड़ा जा सकता है लेप्टिन और एचसीजी उत्पादन के विश्लेषण के लिए नमूने -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है
  2. की पारगम्यता का मूल्यांकन करने के लिएनाल तरल जगमगाहट से सी antipyrine 14 का विश्लेषण. एक बीटा काउंटर में 5 मिनट के लिए 3 मिलीग्राम जगमगाहट कॉकटेल और उपाय के साथ भ्रूण और मातृ नमूने के 300 μl मिलाएं.
  3. फ्लोरोसेंट नैनोकणों के हस्तांतरण या ब्याज की जीनोबायोटिक एक microplate रीडर (संकेत तरंग दैर्ध्य हम नैनोकणों के लिए प्रयोग किया जाता है, जो पीले हरे लेबल के विश्लेषण के लिए कर रहे हैं) में 485 एनएम उत्तेजना और 528 एनएम उत्सर्जन में प्रतिदीप्ति पढ़ने का आकलन करने के लिए.
  4. छिड़काव उपाय के दौरान अपरा ऊतक ग्लूकोज की खपत और एक स्वचालित रक्त गैस सिस्टम के साथ भ्रूण और मातृ सर्किट में लैक्टेट उत्पादन की व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए. इसके अतिरिक्त, अपरा हार्मोन मानव choriongonadotropin (एचसीजी) और एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) द्वारा homogenized ऊतक के नमूने और perfusates में लेप्टिन का उत्पादन का मूल्यांकन.

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Representative Results

चित्रा -4 ए भ्रूण डिब्बे को हस्तांतरित नहीं किया गया है, जो बड़ा polystyrene के कणों (500 एनएम) की तुलना में नाल के पार पहुंचा दिया गया है, जो छोटे polystyrene के कणों (80 एनएम) का छिड़काव प्रोफाइल का पता चलता है. प्रत्येक डेटा बिंदु कम से कम 3 स्वतंत्र प्रयोगों का भी समय बात करने के लिए मतलब कण एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है. Polystyrene के लिए अपरा हस्तांतरण के आकार पर निर्भर 19 है नैनोकणों. 500 एनएम polystyrene के कणों को भी छिड़काव के 6 घंटे के बाद भ्रूण सर्किट में दिखाई नहीं दे रहे थे, जबकि नाल छिड़काव के 3 घंटे के बाद पहले से ही शुरू में जोड़ा 80 एनएम polystyrene के कणों के 20-30%, भ्रूण सर्किट को मातृ से स्थानांतरित कर दिया गया. फिर भी, 500 एनएम कणों की मातृ एकाग्रता कम हो रही है. छिड़काव के बाद ऊतक के histological खंड पर प्रतिदीप्ति छवियों इन कणों नाल (नहीं दिखाया डेटा) की विल्ली में जमा दिखाया. 4B चित्रा 14 सी antipyrine की एक विशेषता छिड़काव प्रोफाइल को दर्शाया गया है. एक छोटे lipophilic अणु के रूप में Antipyrine निष्क्रिय प्रसार के माध्यम से अपरा बाधा पर वितरित और सर्किट की अखंडता के लिए नियंत्रण के रूप में कार्य करता है. छिड़काव के 4-6 घंटे के बाद भ्रूण और मातृ antipyrine एकाग्रता के बीच एक संतुलन 23 का निर्माण किया जाना चाहिए. भ्रूण को मातृ दवा एकाग्रता (एफ / एम) के अनुपात आमतौर पर (चित्रा 5) प्रदर्शित होता है xenobiotics की अपरा परिवहन दर का आकलन और तुलना करने के लिए.

लैक्टेट और अपरा हार्मोन (मानव choriongonadotropin और लेप्टिन) उत्पादन के साथ ही ग्लूकोज की खपत के विश्लेषण के माध्यम से छिड़काव के दौरान अपरा ऊतक की व्यवहार्यता और कार्यक्षमता (चित्रा 6) पर नजर रखी जा सकता है. जीनोबायोटिक साथ perfusions के लिए मूल्यों को हमेशा नियंत्रण छिड़काव से जीनोबायोटिक बिना मान के रूप में एक ही श्रेणी में होना चाहिए. इसके अलावा, histop perfused अपरा ऊतक के athological मूल्यांकन किया जा सकता है. गैर perfused अपरा ऊतक के साथ एक तुलना तो छिड़काव (जैसे जीवाणु संक्रमण) के कारण रोग परिवर्तन बता सकता है और इसलिए एक और गुणवत्ता नियंत्रण पैरामीटर के रूप में काम आ सकते हैं.

पूर्व vivo दोहरी recirculating मानव अपरा छिड़काव मॉडल के साथ प्राप्त आगे प्रतिनिधि परिणाम हाल ही में 11,19 प्रकाशित किए गए थे.

चित्रा 1
चित्रा 1. पूर्व vivo मानव अपरा छिड़काव सेट अप. 1) पानी मातृ और भ्रूण जलाशयों के साथ स्नान, 2) छिड़काव चैम्बर, 3) बुलबुला जाल, 4) oxygenator कॉलम, और 5) प्रवाह हीटर.

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चित्रा 2. पूर्व vivo मानव अपरा छिड़काव मॉडल की योजनाबद्ध चित्रण एफए: भ्रूण धमनी, फंड वैल्यू:. भ्रूण नस, एमए: मातृ धमनी, एमवी: मातृ नस, बीटी: बुलबुला जाल, पुनश्च: दबाव सेंसर

चित्रा 3
चित्रा 3. एक पूर्व vivo मानव अपरा छिड़काव प्रयोग की प्रक्रिया कार्य करना. प्रसव के बाद नाल 30 मिनट के भीतर cannulated हो गया है. पुनःपरिसंचरण के साथ 6 घंटा प्रायोगिक चरण से पहले एक खुली पूर्व चरण और बंद पूर्व चरण में कम से कम 20 मिनट प्रत्येक के लिए किया जाना चाहिए.

चित्रा 4
4 चित्रा. Polystyrene के कणों और 14 का छिड़काव प्रोफाइलों </> सी antipyrine 19 समर्थन. छिड़काव आकारों में polystyrene कणों का प्रोफाइल 80 एनएम (एन = 4) और 500 एनएम (एन = 3). प्रारंभ में 25 माइक्रोग्राम / एमएल कणों और 4.2 NCI / एमएल 14 सी antipyrine मातृ सर्किट से जोड़ा गया था. कणों की मात्रा (ए) और 14 सी antipyrine (बी) के संकेत समय अंक के बाद (एफ, खुले प्रतीक) मातृ (एम, ठोस प्रतीक) और भ्रूण सर्किट में मापा गया. मतलब एकाग्रता है प्रदर्शित ± एसई. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 5
चित्रा 5. मानव प्लेसेंटा 19 के पार polystyrene के कणों के आकार पर निर्भर हस्तांतरण. 14 सी antipyrine और polystyrene कणों की भ्रूण और मातृ सांद्रता के बीच अनुपात चूना थेनाल छिड़काव के 180 मिनट के बाद ulated. डेटा मतलब ± एसई कम से कम 3 स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधित्व करते हैं. नियंत्रण स्तंभ कणों के बिना लेकिन 14 सी antipyrine साथ perfusions दर्शाया गया है. (* पी 80 एनएम अनुपात मूल्य की तुलना में 0.05 <).

चित्रा 6
6 चित्रा. छिड़काव 19 के दौरान अपरा ऊतक की व्यवहार्यता. (ए) ग्लूकोज की खपत और perfused नाल में लैक्टेट उत्पादन. प्रदर्शित perfused गर्भदल के वजन से विभाजित समय के साथ सर्किट में कुल सामग्री में परिवर्तन (भ्रूण और मातृ) का योग है. (बी) अपरा हार्मोन की सामान्यीकृत शुद्ध उत्पादन (एनपी प्रारंभिक ऊतक सामग्री T0 से विभाजित) मानव choriongonadotropin और लेप्टिन. डेटा मतलब ± एसई के एल में प्रतिनिधित्वपूर्व 3 स्वतंत्र प्रयोगों.

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Discussion

दोहरी recirculating छिड़काव यहाँ से पता चला के नीचे, उत्तर दिया जाना है जो प्रश्न के आधार पर संभव कई अन्य प्रयोगात्मक विन्यास कर रहे हैं. विशेष रूप से खुले अपरा perfusions आमतौर पर स्थिर राज्य एकाग्रता 3 में दवा की मंजूरी का आकलन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. recirculating छिड़काव सेट अप भी अंतर्जात या exogenous पदार्थों के सक्रिय परिवहन पुष्टि करने के लिए लागू किया जा सकता है. इस दृष्टिकोण के लिए जीनोबायोटिक का एक ही एकाग्रता मातृ और भ्रूण संचलन में जोड़ दिया गया है. एकाग्रता ढाल के खिलाफ सक्रिय परिवहन वहाँ है कि ग्रहण, सर्किट दोनों में से किसी एक में या तो परीक्षण पदार्थ का संचय 24 देखा जा सकता है. ध्यान से, केवल भ्रूण सर्किट के लिए परीक्षण पदार्थ के अलावा भी संभव है और इस विशेष पदार्थ की 25 अपरा बाधा पार परिवहन की व्यवस्था प्रकट कर सकते हैं.

प्रोटोकॉल टिम में विकसित किया गयाई और विशेष रूप से प्रवाह की दर, छिड़काव माध्यम की रचना, oxygenation के फार्म और हीटिंग 26,27 के विषय में विभिन्न अनुसंधान समूहों के बीच भिन्न हो सकती हैं. विशेष रूप से प्रवाह दर transplacental हस्तांतरण होता है, जिस पर समय को प्रभावित कर सकते हैं. इस पर नियंत्रण करने के लिए, antipyrine तरह एक निष्क्रिय जाया संदर्भ परिसर के अलावा महत्वपूर्ण है. जीनोबायोटिक का अंतरण दर हमेशा antipyrine (एफ / एम अनुपात 0.75 से ऊपर होना चाहिए) 26 के स्थानांतरण की दर की तुलना में किया जा सकता है. Antipyrine हस्तांतरण मुख्य रूप से प्रवाह और विनिमय सतह द्वारा सीमित है, इस तुलना प्रवाह में मतभेद और प्रयोगों के बीच भिन्न हो सकता है जो खाते में perfused गर्भदल का आकार ले लेता है. इसके अलावा, FITC-dextran बाधा 26 की अखंडता के लिए नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए भ्रूण सर्किट से जोड़ा जा सकता है. भ्रूण मात्रा घटाने में भी बाधा अखंडता के लिए मार्कर के रूप में प्रयोग किया जाता है. आम तौर पर एक भ्रूण द्रव मिलीग्राम / घंटा 28 की अनुमति दी है ऊपर 4 से नुकसान, लेकिनफिर कोई आम तौर पर स्वीकार की सीमा है.

जाहिर है, अंतर - व्यक्तिगत विविधताओं और एक कम सफलता दर (15-20%) की तरह पूर्व vivo मानव अपरा छिड़काव विधि से कुछ नुकसान कर रहे हैं. इसके अलावा, 6 घंटा की एक छिड़काव अवधि एक पुरानी दवा उपचार अनुकरण नहीं कर सकते हैं और इसलिए पूरी तरह से लंबी अवधि के प्रदर्शन के बाद एक जीनोबायोटिक के हस्तांतरण को अलग नहीं कर सकते हैं. मॉडल की एक और सीमा बाधा गहरा हो जाता है जब जल्दी गर्भावधि उम्र में परिवहन दर अभी भी अनजान बनी हुई है, जबकि अवधि में मुख्य रूप से transplacental हस्तांतरण का आकलन किया जाता है. दरअसल, पहली तिमाही अपरा का छिड़काव संभव है लेकिन इन अपरा की उपलब्धता सीमित है. फिर भी, अब तक पूर्व vivo अपरा छिड़काव विधि संगठित मानव अपरा ऊतक में विभिन्न xenobiotics या नैनोकणों के परिवहन के अध्ययन के लिए एक ही मॉडल है. पूर्व vivo मानव छिड़काव मॉडल में toxicodynamics केवल pl में विश्लेषण किया जा सकता हैacental ऊतक, पशु प्रयोगों वास्तव में भी embryotoxicity के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं. हालांकि, क्योंकि मानव और rodents के बीच अपरा बाधा के शारीरिक मतभेद के इन परिणामों 4,5 मनुष्य के लिए extrapolated नहीं किया जा सकता. Transplacental हस्तांतरण की जांच के लिए एक और संभावना प्राथमिक cytotrophoblasts, गर्भाशयकर्कट सेल लाइनों, पृथक प्लाज्मा झिल्ली पुटिका या अपरा ऊतक explants 29 की तरह सेल संस्कृति मॉडल हो सकता है. इन कोशिकाओं को एक घातक गर्भावधि गर्भाशयकर्कट से प्राप्त कर रहे हैं और एक पारगम्य झिल्ली पर मिला हुआ monolayer फार्म कर सकते हैं, ताकि परिवहन अध्ययन किया जा सकता है, सबसे अधिक इस्तेमाल मॉडल BEWO सेल लाइन है. BEWO सेल मॉडल का उपयोग परिवहन के अध्ययन के परिणाम पूर्व vivo मानव अपरा छिड़काव 30 में प्राप्त परिणामों के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधी. हालांकि, दवा परिवहन (एक विशिष्ट परिवहन प्रोटीन का उदाहरण योगदान) और चयापचय के विवरण का अध्ययन करने के लिए, BEWO सेल मॉडल मीटर हो सकता हैसंभव अयस्क मुख्य रूप से इसे संभाल करने के लिए आसान और आनुवंशिक रूप से परिवर्तित ट्रांसपोर्टरों या एंजाइमों की अभिव्यक्ति की तरह जोड़ - तोड़ की संभावना है, लेकिन सामान्य दवा हस्तांतरण पढ़ाई के बारे में इस मॉडल की विश्वसनीयता सीमित है क्योंकि. यह रक्त प्रवाह की कमी है और monolayer की अखंडता 6,29 डालने घनत्व, जोखिम अवधि और झिल्ली बोने, यह सेल संस्कृति की स्थिति जैसे कई कारकों पर निर्भर करता है के बाद से सावधानी से मूल्यांकन किया जाना है.

विभिन्न xenobiotics और भी काफी transplacental हस्तांतरण के 31 प्रभावित कर सकते हैं जो विभिन्न प्लाज्मा प्रोटीन के लिए बाध्य नैनोकणों, प्लाज्मा प्रोटीन के लिए बाध्य पर विचार महत्वपूर्ण है. छिड़काव मध्यम एल्बुमिन गोजातीय सीरम, सबसे लगातार प्लाज्मा प्रोटीन होता है. हाल ही में, एक अध्ययन पूर्व vivo मानव अपरा छिड़काव मॉडल के साथ प्राप्त विभिन्न पदार्थों के हस्तांतरण अनुपात मातृ को विवो गर्भनाल रक्त में साथ सहसंबंधी अच्छी तरह से पता चला किहस्तांतरण अनुपात प्लाज्मा प्रोटीन बंधन 12 की हद के अनुसार समायोजित किया गया जब रक्त एकाग्रता अनुपात.

कुल मिलाकर, पूर्व vivo अपरा छिड़काव मॉडल मानव प्लेसेंटा पार परिवहन अध्ययन करने के लिए और xenobiotics और नैनोकणों के vivo transplacental मार्ग में भविष्यवाणी करने के लिए एक वैध और विश्वसनीय तरीका है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgements

इस काम के आर्थिक रूप से स्विस नेशनल फाउंडेशन (NRP 64 कार्यक्रम, कोई 4064-131232 अनुदान) द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NCTC-135 medium ICN Biomedicals, Inc. 10-911-22C could be replaced by Medium 199 from Sigma (M3769)
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich, Fluka 71381
Potassium chloride (KCl) Hospital pharmacy also possible: Sigma (P9541)
Monosodium phosphate (NaH2PO4 · H2O) Merck 106346
Magnesium sulfate (MgSO4 · H2O) Sigma-Aldrich, Fluka 63139
Calcium chloride (CaCl, anhydrous) Merck 102388
D(+) Glucose (anhydrous) Sigma-Aldrich, Fluka 49138
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Merck 106329
Dextran from Leuconostoc spp. Sigma-Aldrich 31389
Bovine serum albumin (BSA) Applichem A1391
Amoxicilline (Clamoxyl) GlaxoSmithKline AG 2021101A
Sodium heparin B. Braun Medical AG 3511014
Sodium hydoxide (NaOH) pellets Merck 106498 CAUTION: corrosive
Ortho-phosphoric acid 85% (H3PO4) Merck 100573 CAUTION: corrosive
Maternal gas mixture: 95% synthetic air, 5% CO2 PanGas AG
Fetal gas mixture: 95% N2, 5% CO2 PanGas AG
Antipyrine (N-methyl-14C) American Radiolabeled Chemicals, Inc. ARC 0108-50 μCi CAUTION: radioactive material (specific activity: 55mCi/mmol)
Scintillation cocktail (IrgaSafe Plus) Zinsser Analytic GmbH 1003100
Polystyrene particles 80 nm Polyscience, Inc. 17150
Polystyrene particles 500 nm Polyscience, Inc. 17152
EQUIPMENT
Water bath VWR 462-7001
Thermostat IKA-Werke GmbH Co. KG 3164000
Peristaltic pumps Ismatec ISM 833
Bubble traps (glass) UNI-GLAS Laborbedarf
Flow heater UNI-GLAS Laborbedarf
Pressure sensor + Software for analyses MSR Electronics GmbH 145B5
Notebook Hewlett Packard
Miniature gas exchange oxygenator Living Systems Instrumentation LSI-OXR
Tygon Tube (ID: 1.6 mm; OD: 4.8 mm) Ismatec MF0028
Tubes for pumps (PharMed BPT; ID: 1.52 mm) Ismatec SC0744
Blunt cannulae ( 0.8 mm) Polymed Medical Center 03.592.81
Blunt cannulae ( 1.2 mm) Polymed Medical Center 03.592.90
Blunt cannulae ( 1.5 mm) Polymed Medical Center 03.592.94
Blunt cannulae ( 1.8 mm) Polymed Medical Center 03.952.82
Parafilm VWR 291-1212
Perfusion chamber with tissue holder (plexiglass) Internal technical department Similar equipment is available from Hemotek Limited, UK
Surgical suture material (PremiCron) B. Braun Medical AG C0026005
Winged Needle Infusion Set (21G Butterfly) Hospira, Inc. ASN 2102
Multidirectional stopcock (Discofix C-3) B. Braun Medical AG 16494C
Surgical scissors B. Braun Medical AG BC304R
Dissecting scissors B. Braun Medical AG BC162R
Needle holder B. Braun Medical AG BM200R
Dissecting forceps B. Braun Medical AG BD215R
Automated blood gas system Radiometer Medical ApS ABL800 FLEX
Multi-mode microplate reader BioTek Synergy HT
Liquid scintillation analyzer GMI, Inc. Packard Tri-Carb 2200
Scintillation tubes 5.5 ml Zinsser Analytic GmbH 3020001
Tissue Homogenizer OMNI, Inc. TH-220
pH meter + electrode VWR 662-2779

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References

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