Bepaling van de Transport Rate van xenobiotica en nanomaterialen via de placenta met de
1Department of Obstetrics, Perinatal Pharmacology, University Hospital Zurich, 2Laboratory for Materials - Biology Interactions, EMPA Swiss Federal Laboratories for Materials Testing and Research, 3Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

De

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Grafmüller, S., Manser, P., Krug, H. F., Wick, P., von Mandach, U. Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model. J. Vis. Exp. (76), e50401, doi:10.3791/50401 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Decennia geleden de menselijke placenta werd gedacht aan een ondoordringbare barrière tussen moeder en ongeboren kind. De ontdekking van thalidomide geïnduceerde aangeboren afwijkingen en vele latere studies later bleek het tegenovergestelde. Vandaag verschillende schadelijke lichaamsvreemde stoffen, zoals nicotine, heroïne, methadon of drugs evenals milieuverontreinigende stoffen werden beschreven om deze barrière te overwinnen. Met het toenemende gebruik van nanotechnologie, de placenta waarschijnlijk met nieuwe nanodeeltjes in aanraking te komen, hetzij per ongeluk door blootstelling of opzettelijk in het geval van potentiële nanomedische toepassingen. Gegevens van dierproeven die niet kunnen worden geëxtrapoleerd naar de mens, omdat de placenta is de meest soortspecifieke zoogdieren orgel 1. Daarom is de ex vivo dual recirculerende menselijke placenta perfusie, ontwikkeld door Panigel et al.. In 1967 2 en voortdurend gemodificeerd door Schneider et al.. 1972 3, kan dienen als een uitstekend model to studie van de overdracht van xenobiotica of deeltjes.

Hier richten we ons op de ex vivo dual recirculatie menselijke placenta perfusie-protocol en de verdere ontwikkeling tot reproduceerbare resultaten te verkrijgen.

De placenta's werden verkregen na geïnformeerde toestemming van de moeders van ongecompliceerde zwangerschappen termijn ondergaat keizersnede. De foetale en maternale vaartuigen van een intact zaadlobben werden van een canule en geperfuseerd ten minste vijf uur. Als model fluorescent gelabeld polystyreen deeltjes met grootten van 80 en 500 nm in diameter werd toegevoegd aan de moeder circuit. De 80 nm deeltjes in staat waren om de placenta te passeren en zorgen voor een perfect voorbeeld van een stof die wordt overgedragen via de placenta naar de foetus tijdens de 500 nm deeltjes in de placenta weefsel of moeder circuit werden behouden. De ex vivo menselijke placenta perfusie model is een van de weinige modellen verstrekken van betrouwbare informatie overhet mobiliteitsgedrag van xenobiotica op een belangrijk weefsel barrière die voorspellende en klinisch relevante gegevens levert.

Introduction

De placenta is een complex orgaan dat verantwoordelijk is voor de uitwisseling van zuurstof, kooldioxide, nutriënten en afvalproducten en tegelijkertijd kunnen de twee circuits bloed van de moeder en de groeiende foetus van elkaar gescheiden te houden. Daarnaast zorgt het ervoor dat de afwijzing van het kind door de moeder immuunsysteem en scheidt hormonen af ​​om zwangerschap te behouden. De cellulaire barrière wordt gevormd door de cytotrofoblastcellen die een getrouw syncytia fuseren en vormen zonder zijdelingse celmembranen 4,5. De gehele placenta bestaat uit verschillende zaadlobben, welke foetale villous boom bevatten en vormen een functionele eenheid van de placenta.

De studie van de placenta functie werd versterkt met de ontdekking van de thalidomide geïnduceerde afwijkingen in de jaren 1960. Om duidelijke redenen translocatie studies met zwangere vrouwen niet kan worden uitgevoerd. Bijgevolg zijn verschillende alternatieve modellen ontwikkeld 6,7 ex vivo menselijke placenta perfusie model ontwikkeld door Panigel en medewerkers 2,3.

Veel vrouwen worden blootgesteld aan verschillende xenobiotica zoals drugs of milieuverontreinigende stoffen tijdens hun zwangerschap 8. Voor sommige drugs reeds regelmatig tijdens de zwangerschap kregen toegediend, in vivo kan worden uitgevoerd door vergelijking van de maternale bloedconcentratie met dat navelstrengbloed. Echter, over het algemeen is er slechts beperkte informatie over de farmacokinetiek en-dynamiek in de foetus en de teratogeniciteit van deze stoffen.

Bijvoorbeeld opiaten zoals heroïne gemakkelijk passeren de placenta en kan leiden tot intra-uteriene groeivertraging, vroeggeboorte of een spontane abortus 9,10. Dus, in het geval van ontbrekende onthouding tijdens de zwangerschap een vervangingstherapie met methadon wordt aanbevolen. De exvivo humane placenta perfusie model bleek dat de overdracht van methadon in de foetale bloedsomloop verwaarloosbaar 11, die goed correleert met de berekende navelstrengbloed naar moederbloed concentratieverhouding na levering 12.

Nanotechnologie is een groeiende veld vooral in de geneeskunde. Dus, onder de natuurlijk voorkomende fijne (<2,5 urn in diameter) en ultrafijne deeltjes (<0,1 urn in diameter) in dampen van bosbranden, vulkaanuitbarstingen en desert stof, blootstelling aan synthetische nanomaterialen (tenminste een afmeting <0,1 urn 13 ) toeneemt. Dit riep vragen op over de toxicologische potentieel van technisch vervaardigde nanomaterialen. Hoewel geen mens gevaar nog kon worden bewezen, er zijn belangrijkste experimentele studies waaruit blijkt dat nanodeeltjes schadelijke biologische reacties die leiden tot toxicologische resultaten 14 kunnen veroorzaken. Onlangs heeft een aantal studies gaven aan dat prenatale blootstelling aanluchtverontreiniging wordt gelinkt aan een hogere ademhalings behoefte en luchtwegontsteking bij pasgeborenen en kinderen 15,16. Bovendien kunnen kleine nanodeeltjes worden gebruikt als dragers voor geneesmiddelen specifiek behandelen of de foetus en de moeder. Derhalve wordt duidelijk dat uitgebreide studies van verschillende xenobiotica of nanomaterialen en hun vermogen om de placenta vereist. Een actueel overzicht van de huidige studies over placenta permeabiliteit voor technisch vervaardigde nanomaterialen wordt samengevat in Menezes et al.. 2011 17 en Buerki-Thurnherr et al.. 2012 7.

De ex vivo dual recirculatie menselijke placenta perfusie model geeft een gecontroleerd en betrouwbaar systeem voor het bestuderen van de placenta transport van verschillende endogene en exogene verbindingen 3,11,12,18,19 en een breed scala aan andere functies van de placenta, zoals mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling van pathologische toestanden zoals preëclampsie <sup> 20-22. In dit protocol richten we ons vooral op de set-up, handling en methode die de studie van de accumulatie, effecten en translocatie tarieven van een brede set van xenobiotica of nanodeeltjes toestaan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereiden van de perfusie-systeem

  1. Het opzetten van de perfusie-systeem, bestaande uit een waterbad, een perfusie kamer, twee kolommen voor zuurstoftoevoer, twee peristaltische pompen, twee bubble vallen, twee boilers en een druksensor (figuur 1). Verbind deze componenten met buissecties uit silicone en polyvinylchloride materialen volgens het schema in figuur 2. Tenslotte zijn er twee circuits die de foetus en de moeder circuit, respectievelijk.
  2. Schakel het waterbad, de stroming kachels en verwarming voor de perfusie kamer. Moet de temperatuur 37 ° C.
  3. Warm de perfusiemedium (NCTC-135 weefselcultuurmedium verdund 1:02 met Earle's buffer (6,8 g / l natriumchloride, 0,4 g / L kaliumchloride, 0,14 g / L mononatriumfosfaat, 0,2 g / L magnesiumsulfaat, 0,2 g / L calcium chloride, 2 g / L glucose) aangevuld met glucose (1 g / L), dextran 40 (10 g / L), bovine serum albumine (10 g/ L), natriumheparine (2500 IU / L), amoxicilline (250 mg / L) en natriumbicarbonaat (2,2 g / L), pH 7,4) in het waterbad.
  4. - 20 ml 15: achtereenvolgens de arteriële systemen van de foetus en de moeder circuit met a) 200 ml gedestilleerd water, b) 50 ml 1% natriumhydroxide, c) 1% fosforzuur en d) opnieuw 200 ml gedestilleerd water (debiet spoelen / min).
  5. Sluit de foetale canule (Ø 1,2 mm; stompe naald moet een gewijzigde gevleugelde naald infusieset worden gehecht) aan de foetale arteriële slang.
  6. Spoel het arteriële systeem van de foetale en maternale circuit met perfusiemedium totdat alle buizen bevatten medium (stroomsnelheid: 15-20 ml / min). Tijdens deze stap vullen de bubble vallen en verwijder alle bubbels stroomafwaarts van de val. Stop dan de pompen. Het is echt belangrijk dat de afferente arteriële buizen zijn altijd vrij van bellen, anders na cannulatie vooral de fijne foetale vaten kunnen scheuren.
  7. Zet de gasstroom. De moeder circuit wordt zuurstofrijk wiste 5% kooldioxide en 95% synthetische lucht en de foetale circuit met 5% kooldioxide en 95% stikstof.
  8. Start de registratie van de druksensor.

2. Cannulating de Placenta

  1. Verkrijgen intact placenta van ongecompliceerde termijn zwangerschappen na de primaire keizersnede. Schriftelijke toestemming moet worden gegeven (werd verkregen in het geval van onze studies) door de moeders vóór levering en het onderzoek heeft door de lokale ethische commissie worden goedgekeurd (was het geval in onze studies). Eerste visuele controle moet worden uitgevoerd door vroedvrouwen om een ​​gezonde en intacte placenta verzekeren.
  2. Canulatie van de placenta is een cruciale stap! Tijdens perfusie elke kleine verstoring in het weefsel kan leiden tot een lek tussen de maternale en foetale circulatie. De placenta moet worden verkregen binnen 30 minuten na levering.
  3. Selecteer een intacte cotyledon tegen de marginale zone van de placenta zonder zichtbare verstoringen op de moederlijke kant. Aan het chorion plaat,binden beide geassocieerd takken van de arteria umbilicalis en ader stroomopwaarts naar de latere cannulatie kant (richting de navelstreng) door het gebruik van chirurgisch hechtmateriaal. Maak altijd twee knopen.
  4. Eerste canule de foetale slagader. De foetale placenta slagaders zijn steeds kleiner en dunner dan de aderen.
  5. Maak een hechting rond de foetale slagader, maar niet onmiddellijk bind het op. Houd het vat met een pincet, snijd het schip voorzichtig en zet de kleine canule (Ø 1,2 mm) in de slagader. Bind dan de hechtdraad (twee knopen).
  6. Ga verder met de foetale ader op dezelfde manier, maar gebruik een grotere canule (Ø 1,5-1,8 mm; stompe naald moet een gewijzigde gevleugelde naald infusieset worden bevestigd).
  7. Zet de foetale pomp (2 ml / min). Indien er geen zichtbare lekken en bloed afkomstig uit de foetale ader canule langzaam de stroom tot 4 ml / min. Let op de druk in de foetale slagader, het moet niet hoger zijn dan 70 mmHg. Als er vloeistof lekt uit op de foetus of van materne canule zet ze vast met een ander hechtdraad.
  8. Plaats de placenta op het weefsel houder met de foetale kant naar boven en trek de placenta membraan en weefsel over de spikes. Uiteindelijk moet geperfundeerde zaadlob in het midden van het gat in het weefsel houder.
  9. Stabiliseren van het deel waar alleen het membraan houdt de placenta met een silicone membraan (Ø 1 mm) of twee parafilm stukken.
  10. Monteer de volledige weefsel houder, draai de schroeven en snijd de overhangende weefsel. Houd er rekening mee dat de veneuze en arteriële canules zijn niet bekneld, maar in plaats daarvan lag in de kleine kanalen van het weefsel houder.
  11. Draai het weefsel houder ondersteboven, zet het in de perfusie kamer en voeg het deksel. Nu moet moederszijde aan de top. Controleer altijd of de foetus circuit is nog steeds intact en het medium stroomt uit de foetale ader buis.
  12. Zet de maternale pomp (12 ml / min). Introduceren de drie stompe canules (Ø 0,8 mm) bij The einde van de maternale slagader buis in de intervilleuze ruimte door het penetreren van de deciduale plaat. Om het perfusaat terugkeren naar de maternale circuit zet een buis veneuze afvoer tevens aangesloten met de maternale pomp in de laagste positie in het bovenste deel van de perfusie kamer.
  13. Sluit de foetale ader canule om de foetale ader buis.

3. Het uitvoeren van de pre-en de experimentele fase van de perfusie

  1. Zodat het weefsel te herstellen van de ischemische periode na levering en voor het spoelen van het bloed in de intervilleuze ruimte, een open pre-fase van 20 minuten nodig. Dat betekent dat de maternale en foetale ader zijn niet terug te voeren op de arteriële reservoir met de perfusie medium. Verzamel de foetale en maternale veneuze uitstroom in een fles en gooi deze weg na de pre-fase.
  2. Om de integriteit van de perfusie beoordelen voeren een voorfase van 20 minuten, maar in een gesloten circuit. Gebruik twee aparte reservoirs met perfusiemediumvoor de foetus en de moeder circuit en sluit de circuits door toonaangevende het foetale veneuze uitstroom terug in de foetale reservoir en de maternale veneuze uitstroom terug in de moederlijke reservoir.
  3. Voor de belangrijkste perfusie experiment bereiden twee flesjes met 120 ml perfusiemedium (een voor de moeder en een voor de foetus reservoir). Voeg de radioactief gemerkte 14 C-antipyrine (4 nCi / ml; dient als positieve controle; LET OP: radioactieve stof) en de fluorescent gelabelde lichaamsvreemde of nanodeeltjes die men wil analyseren om de moederlijke reservoir. Meng de moederlijke perfusaat goed.
  4. Start het experiment door het uitwisselen van de zuivere perfusiemedium met de twee voorbereide kolven (foetale en maternale reservoirs). Sluit de circuits door toonaangevende het foetale veneuze uitstroom terug in de foetale reservoir en de maternale veneuze uitstroom terug in de moederlijke reservoir.
  5. Blijven de perfusie gedurende 6 uur en neemt regelmatig monsters. Resuspendeer altijd het medium in de foetale en maternalereservoir voor terugtrekking.
  6. Regelen de druk in de foetale slagader (niet meer dan 70 mmHg), pH in beide circuits (moet in een fysiologisch bereik 7,2-7,4) en het volume van de beide reservoirs (foetaal volumeverlies niet meer dan 4 ml / uur) tijdens perfusie . Indien nodig de pH met behulp van zoutzuur of natriumhydroxide.
  7. Als het volumeverlies in de foetale reservoir dan 4 ml / uur een lek in het weefsel en men de perfusie stoppen. De mate van succes van een perfusie gedurende 6 uur zonder lek is ongeveer 15-20%.
  8. Stop de perfusie na 6 uur. Blijken de pompen, waterbad, geisers en gas stromen.
  9. Verwijder de placenta uit het weefsel houder, snijd de geperfuseerde cotyledon (helderder dan de unperfused weefsel) en weeg het.
  10. Neem monsters van unperfused (deel van de placenta die is uitgesneden in het begin, kan reeds tijdens de pre-fase ingaan) en geperfundeerde weefsels (elk ongeveer 1 g) en opgeslagen bij -20 ° Ctot homogenisatie of in vloeibare stikstof voor latere analyse. Fix andere weefselmonster in 4% formaline voor histopathologische evaluatie. De monsters moeten in alle lagen van de placenta.
  11. Reinig de buizen na perfusie door achtereenvolgens spoelen slagadersystemen van de foetale en maternale circuit met a) 200 ml gedestilleerd water, b) 50 ml 1% natriumhydroxide, c) 50 ml 1% fosforzuur en d) opnieuw 200 ml gedestilleerd water (debiet: 15-20 ml / min).

De gehele werkwijze van de placenta perfusie experiment is weergegeven in figuur 3.

4. Analyse van de monsters

  1. Centrifugeer het perfusaat monsters gedurende 10 min bij 800 xg voor analyse resterende erythrocyten te verwijderen. Neem de supernatant voor verdere analyse. De monsters kunnen in een handomdraai bij 4 ° C. Voor de analyse van leptine en hCG productie de monsters bij -20 ° C worden opgeslagen
  2. Om de permeabiliteit van de evaluatieplacenta analyseren de 14 C-antipyrine met vloeistofscintillatietelling. Meng 300 ul van de foetale en maternale monsters met 3 ml scintillatie cocktail en maat voor 5 min in een betateller.
  3. Om de overdracht van de fluorescente nanodeeltjes of xenobiotische plaats Lees de fluorescentie bij 485 nm excitatie en 528 nm emissie in een microplaat reader (aangegeven golflengten zijn voor de analyse van de geelgroene label die we voor nanodeeltjes) beoordelen.
  4. Om de levensvatbaarheid van de placenta weefsel tijdens perfusie maatregel de glucose consumptie en lactaat productie in de foetus en de moeder circuit met een geautomatiseerd bloedgas systeem te bepalen. Verder beoordeelt de productie van de menselijke placenta hormonen choriongonadotropin (hCG) en leptine in gehomogeniseerde weefselmonsters en perfusates by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 4A toont de perfusie profielen van kleine polystyreen deeltjes (80 nm) die door de placenta getransporteerd vergeleken grotere polystyreen deeltjes (500 nm) die niet naar de foetale compartiment. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt het gemiddelde deeltjesconcentratie op de gegeven tijdstip ten minste 3 onafhankelijke experimenten. Voor polystyreen nanodeeltjes de overdracht placenta is grootte-afhankelijke 19. Na 3 uur van placenta perfusie al 20-30% van de oorspronkelijk toegevoegde 80 nm polystyreen deeltjes werden van de moeder naar de foetus circuit, terwijl de 500 nm polystyreen deeltjes die niet in de foetale circuit ook na 6 uur van perfusie. Niettemin is de maternale concentratie van 500 nm deeltjes afneemt. Fluorescentie afbeeldingen op histologische sectie van het weefsel na perfusie bleek dat deze deeltjes zich ophopen in de villi van de placenta (data niet getoond). Figuur 4B 14 C-antipyrine. Antipyrine een klein lipofiel molecuul is verdeeld over de placenta via passieve diffusie en dient als controle voor de integriteit van de circuits. Na 4-6 uur perfusie van een evenwicht tussen de foetus en de moeder antipyrine concentratie moet worden gebouwd 23. Om te beoordelen en vergelijken van de placenta transportsnelheid van xenobiotica de foetale naar maternale geneesmiddelconcentratie (F / M) verhouding wordt gewoonlijk weergegeven (Figuur 5).

Door de analyse van lactaat en placenta hormoon (menselijke choriongonadotropin en leptine) productie als glucose consumptie de levensvatbaarheid en functionaliteit van de placenta weefsel tijdens de perfusie worden (figuur 6). De waarden voor de perfusie met lichaamsvreemde moeten altijd in hetzelfde bereik als de waarden van controle perfusie zonder xenobioticum. Bovendien histop athological evaluatie van geperfundeerde placenta weefsel kan worden uitgevoerd. Een vergelijking met niet-doorbloed placentaweefsel zou dan openbaren pathologische veranderingen als gevolg van perfusie (bv. bacteriële besmetting) en dus als een andere kwaliteit parameter controle zou kunnen dienen.

Verdere representatieve resultaten verkregen met de ex vivo dual recirculatie menselijke placenta perfusie model werden onlangs 11,19 gepubliceerd.

Figuur 1
Figuur 1. Ex vivo menselijke placenta perfusie set-up. 1) Water bad met moeder en foetus reservoirs, 2) perfusie kamer, 3) opvanginrichting, 4) oxygenator kolommen, en 5) wordt verwarmd.

load/50401/50401fig2.jpg "/>
Figuur 2. Schematische illustratie van de ex vivo menselijke placenta perfusie model FA: foetale slagader; FV:. Foetale ader; MA: moeders slagader; MV: moeders vein; BT: Waterventiel; PS: druksensor

Figuur 3
Figuur 3. Werkwijze van een ex vivo menselijke placenta perfusie experiment. Na levering van de placenta moet worden gecannuleerd binnen 30 minuten. Voor de 6 hr experimentele fase recirculatie open voorfase en gesloten voorfase worden uitgevoerd voor elk tenminste 20 minuten.

Figuur 4
Figuur 4. Perfusie profielen van polystyreen deeltjes en 14 </ Sup> C-antipyrine 19. Perfusion profiel van polystyreen deeltjes in de maten 80 nm (n = 4) en 500 nm (n = 3). Aanvankelijk 25 ug / ml en 4,2 deeltjes nCi / ml 14C-antipyrine toegevoegd aan de moeder circuit. De hoeveelheid deeltjes (A) en 14 C-antipyrine (B) werden gemeten in de moeder (M, vaste symbolen) en foetale (F, open symbolen) circuits na de aangegeven tijdstippen. Getoond wordt de gemiddelde concentratie ± SE. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 5
Figuur 5. Grootte-afhankelijke overdracht van polystyreen deeltjes over de menselijke placenta 19. De verhoudingen tussen foetale en maternale concentraties van 14 C-antipyrine en polystyreen deeltjes waren calculeerde na 180 min van placenta perfusie. Gegevens stellen het gemiddelde ± SE van tenminste 3 onafhankelijke experimenten. De controle kolom toont perfusies zonder deeltjes maar met 14 C-antipyrine. (* P <0,05 ten opzichte van 80 nm RATIO).

Figuur 6
Figuur 6. Levensvatbaarheid van de placenta weefsel tijdens perfusie 19. (A) Glucose consumptie en lactaat productie in de geperfuseerde placenta. Weergegeven is de som van de veranderingen in totale gehalte in de circuits (foetus en de moeder) de tijd gedeeld door het gewicht van de geperfuseerde cotyledon. (B) De genormaliseerde netto productie (NP gedeeld door de initiële weefsel inhoud T0) van de placenta hormonen menselijk choriongonadotropin en leptine. Gegevens stellen het gemiddelde ± SE van ten loost 3 onafhankelijke experimenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Onder de dubbele recirculerende perfusie hier blijkt, zijn er verschillende andere experimentele configuraties mogelijk, afhankelijk van de vraag die moet worden beantwoord. Vooral geopend placenta perfusie worden vaak gebruikt om de klaring te beoordelen bij steady-state concentratie 3. De recirculerende perfusie opstelling kan ook worden toegepast op actief transport van endogene of exogene stoffen bevestigen. Voor deze benadering dezelfde concentratie van de lichaamsvreemde moet worden toegevoegd aan de maternale en foetale bloedsomloop. Aangenomen dat er actief transport tegen de concentratiegradiënt kan accumulatie van de teststof in een van de beide circuits worden aangehouden 24. Opmerkelijk, de toevoeging van de teststof alleen de foetale circuit is ook mogelijk en kan het mechanisme van transport over de placentabarrière van dit stof 25 te onthullen.

Het protocol heeft dan tim geëvolueerde en kan variëren tussen de verschillende onderzoeksgroepen in het bijzonder met betrekking tot het debiet, de samenstelling van perfusiemedium, vorm van zuurstof en verwarming 26,27. Vooral het debiet het tijdstip waarop transplacental overdracht plaatsvindt beïnvloeden. Om dit te controleren, zal de toevoeging van een passief meeneemt referentieverbinding zoals antipyrine belangrijk. De overdrachtsnelheid van de lichaamsvreemde kan altijd worden vergeleken met de overdrachtssnelheid van antipyrine (F / M-ratio moet boven 0.75) 26. Aangezien de antipyrine overdracht hoofdzakelijk beperkt door de stroming en uitwisselingsoppervlak, deze vergelijking is verschillen in de stroming en de omvang van de geperfundeerde zaadlob rekening die kan verschillen tussen de experimenten. Bovendien kan FITC-dextran toegevoegd aan de foetale circuit te dienen als controle voor de integriteit van de barrière 26. Foetale volumeverlies wordt ook gebruikt als marker voor de barrière integriteit. Meestal een foetale vloeistofverlies tot 4 ml / uur mag 28, maar dere is geen algemeen aanvaarde limiet.

Uiteraard zijn er een aantal nadelen van de ex vivo menselijke placenta perfusie methode zoals inter-individuele variaties en een lage slagingspercentage (15-20%). Bovendien kan een perfusie gedurende 6 uur een chronisch behandeling simuleren en daardoor niet volledig de overdracht van een xenobiotische sluiten na langdurige blootstelling. Een andere beperking van het model is dat vooral de transplacentaire overdracht op termijn wordt beoordeeld tijdens het transport snelheid op vroege zwangerschapsduur bij de slagboom dikker is nog steeds onbekend. Inderdaad, perfusie van eerste trimester placenta is mogelijk, maar de beschikbaarheid van deze placenta's is vrij beperkt. Niettemin, tot nu toe de ex vivo doorbloeding van de placenta-methode is het enige model voor het vervoer van verschillende xenobiotica of nanodeeltjes in georganiseerde menselijke placenta weefsel te bestuderen. Terwijl toxicodynamiek in de ex vivo humane perfusie model kan worden geanalyseerd alleen in de placental weefsel, kunnen dierproeven inderdaad geven ook informatie over de embryotoxiciteit. Hoewel, vanwege de anatomische verschillen van de placenta tussen mensen en knaagdieren deze resultaten kunnen niet worden geëxtrapoleerd naar mensen 4,5. Een andere mogelijkheid om transplacentaire overdracht onderzoeken kunnen zijn celcultuur modellen zoals primaire cytotrofoblasten, choriocarcinoom cellijnen, geïsoleerde plasmamembraan blaasjes of placenta weefselexplantaten 29. De meest gebruikte model is de BeWo-cellijn, deze cellen zijn afgeleid van een kwaadaardige gestational choriocarcinoom en een confluente monolaag te vormen op een permeabele membraan, zodat transport studies kunnen worden uitgevoerd. Resultaten van het transport studies met behulp van de BeWo celmodel goed correleren met de resultaten verkregen in de ex vivo menselijke placenta perfusie 30. Echter, om de details van het vervoer drugs (bijvoorbeeld de bijdrage van een specifiek transporteiwit) en metabolisme te bestuderen, kan de BeWo celmodel zijn merts haalbaar vooral omdat het gemakkelijker te hanteren en gemanipuleerd, zoals expressie van genetisch veranderde transporters of enzymen, maar over het algemeen geneesmiddeloverdracht studies de betrouwbaarheid van het model beperkt. Het ontbreekt bloedstroom en de integriteit van de monolaag moet zorgvuldig worden beoordeeld omdat het afhankelijk is van verschillende factoren, zoals celkweekomstandigheden, zaaien dichtheid, de blootstellingsduur en de membraan insert 6,29.

Verschillende xenobiotica en nanodeeltjes ook binden aan verschillende plasma-eiwitten die aanzienlijk kunnen invloed hebben op de transplacentaire overdracht 31, gezien de binding aan plasma-eiwitten is daarom belangrijk. De perfusiemedium bevat runder serumalbumine, de meest voorkomende plasma-eiwit. Onlangs, een studie toonde aan dat de overbrengingsverhoudingen van verschillende stoffen verkregen met de ex vivo menselijke placenta perfusie model correleren goed met de in vivo navelstrengbloed aan maternalebloedconcentratie's wanneer de overbrengingsverhoudingen werden aangepast aan de omvang plasmaeiwitbinding 12.

Algemeen, de ex vivo doorbloeding van de placenta-model is een valide en betrouwbare methode om het transport te bestuderen over de menselijke placenta en de in vivo transplacentale passage van xenobiotica en nanodeeltjes te voorspellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgements

Dit werk wordt financieel ondersteund door de Zwitserse Nationale Stichting, (NRP 64 programma, verlenen geen 4064-131232).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NCTC-135 medium ICN Biomedicals, Inc. 10-911-22C could be replaced by Medium 199 from Sigma (M3769)
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich, Fluka 71381
Potassium chloride (KCl) Hospital pharmacy also possible: Sigma (P9541)
Monosodium phosphate (NaH2PO4 · H2O) Merck 106346
Magnesium sulfate (MgSO4 · H2O) Sigma-Aldrich, Fluka 63139
Calcium chloride (CaCl, anhydrous) Merck 102388
D(+) Glucose (anhydrous) Sigma-Aldrich, Fluka 49138
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Merck 106329
Dextran from Leuconostoc spp. Sigma-Aldrich 31389
Bovine serum albumin (BSA) Applichem A1391
Amoxicilline (Clamoxyl) GlaxoSmithKline AG 2021101A
Sodium heparin B. Braun Medical AG 3511014
Sodium hydoxide (NaOH) pellets Merck 106498 CAUTION: corrosive
Ortho-phosphoric acid 85% (H3PO4) Merck 100573 CAUTION: corrosive
Maternal gas mixture: 95% synthetic air, 5% CO2 PanGas AG
Fetal gas mixture: 95% N2, 5% CO2 PanGas AG
Antipyrine (N-methyl-14C) American Radiolabeled Chemicals, Inc. ARC 0108-50 μCi CAUTION: radioactive material (specific activity: 55mCi/mmol)
Scintillation cocktail (IrgaSafe Plus) Zinsser Analytic GmbH 1003100
Polystyrene particles 80 nm Polyscience, Inc. 17150
Polystyrene particles 500 nm Polyscience, Inc. 17152
EQUIPMENT
Water bath VWR 462-7001
Thermostat IKA-Werke GmbH Co. KG 3164000
Peristaltic pumps Ismatec ISM 833
Bubble traps (glass) UNI-GLAS Laborbedarf
Flow heater UNI-GLAS Laborbedarf
Pressure sensor + Software for analyses MSR Electronics GmbH 145B5
Notebook Hewlett Packard
Miniature gas exchange oxygenator Living Systems Instrumentation LSI-OXR
Tygon Tube (ID: 1.6 mm; OD: 4.8 mm) Ismatec MF0028
Tubes for pumps (PharMed BPT; ID: 1.52 mm) Ismatec SC0744
Blunt cannulae ( 0.8 mm) Polymed Medical Center 03.592.81
Blunt cannulae ( 1.2 mm) Polymed Medical Center 03.592.90
Blunt cannulae ( 1.5 mm) Polymed Medical Center 03.592.94
Blunt cannulae ( 1.8 mm) Polymed Medical Center 03.952.82
Parafilm VWR 291-1212
Perfusion chamber with tissue holder (plexiglass) Internal technical department Similar equipment is available from Hemotek Limited, UK
Surgical suture material (PremiCron) B. Braun Medical AG C0026005
Winged Needle Infusion Set (21G Butterfly) Hospira, Inc. ASN 2102
Multidirectional stopcock (Discofix C-3) B. Braun Medical AG 16494C
Surgical scissors B. Braun Medical AG BC304R
Dissecting scissors B. Braun Medical AG BC162R
Needle holder B. Braun Medical AG BM200R
Dissecting forceps B. Braun Medical AG BD215R
Automated blood gas system Radiometer Medical ApS ABL800 FLEX
Multi-mode microplate reader BioTek Synergy HT
Liquid scintillation analyzer GMI, Inc. Packard Tri-Carb 2200
Scintillation tubes 5.5 ml Zinsser Analytic GmbH 3020001
Tissue Homogenizer OMNI, Inc. TH-220
pH meter + electrode VWR 662-2779

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ala-Kokko, T. I., Myllynen, P., Vahakangas, K. Ex vivo perfusion of the human placental cotyledon: implications for anesthetic pharmacology. Int. J. Obstet. Anesth. 9, 26-38 (2000).
  2. Panigel, M., Pascaud, M., Brun, J. L. Radioangiographic study of circulation in the villi and intervillous space of isolated human placental cotyledon kept viable by perfusion. J. Physiol. (Paris). 59, 277 (1967).
  3. Schneider, H., Panigel, M., Dancis, J. Transfer across the perfused human placenta of antipyrine, sodium and leucine. Am. J. Obstet. Gynecol. 114, 822-828 (1972).
  4. Enders, A. C., Blankenship, T. N. Comparative placental structure. Adv. Drug Deliv. Rev. 38, 3-15 (1999).
  5. Takata, K., Hirano, H. Mechanism of glucose transport across the human and rat placental barrier: a review. Microsc. Res. Tech. 38, 145-152 (1997).
  6. Saunders, M. Transplacental transport of nanomaterials. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 1, 671-684 (2009).
  7. Buerki-Thurnherr, T., von Mandach, U., Wick, P. Knocking at the door of the unborn child: engineered nanoparticles at the human placental barrier. Swiss Med. Wkly. 142, w13559 (2012).
  8. Gendron, M. P., Martin, B., Oraichi, D., Berard, A. Health care providers' requests to Teratogen Information Services on medication use during pregnancy and lactation. Eur. J. Clin. Pharmacol. 65, 523-531 (2009).
  9. Burns, L., Mattick, R. P., Lim, K., Wallace, C. Methadone in pregnancy: treatment retention and neonatal outcomes. Addiction. 102, 264-270 (2007).
  10. von Mandach, U. Drug use in pregnancy. Ther. Umsch. 62, 29-35 (2005).
  11. Malek, A., Obrist, C., Wenzinger, S., von Mandach, U. The impact of cocaine and heroin on the placental transfer of methadone. Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 61 (2009).
  12. Hutson, J. R., Garcia-Bournissen, F., Davis, A., Koren, G. The human placental perfusion model: a systematic review and development of a model to predict in vivo transfer of therapeutic drugs. Clin. Pharmacol. Ther. 90, 67-76 (2011).
  13. International Organization for Standardization (ISO). Technical Specification (ISO/TS) 27687. Nanotechnologies – Terminology and definitions for nano-objects – Nanoparticles, nanofibre and nanoplate. (2008).
  14. Pietroiusti, A. Health implications of engineered nanomaterials. Nanoscale. 4, 1231-1247 (2012).
  15. Latzin, P., Roosli, M., Huss, A., Kuehni, C. E., Frey, U. Air pollution during pregnancy and lung function in newborns: a birth cohort study. Eur. Respir. J. 33, 594-603 (2009).
  16. Lacasana, M., Esplugues, A., Ballester, F. Exposure to ambient air pollution and prenatal and early childhood health effects. Eur. J. Epidemiol. 20, 183-199 (2005).
  17. Menezes, V., Malek, A., Keelan, J. A. Nanoparticulate drug delivery in pregnancy: placental passage and fetal exposure. Curr. Pharm. Biotechnol. 12, 731-742 (2011).
  18. Muhlemann, K., Menegus, M. A., Miller, R. K. Cytomegalovirus in the perfused human term placenta in vitro. Placenta. 16, 367-373 (1995).
  19. Wick, P., et al. Barrier capacity of human placenta for nanosized materials. Environ. Health Perspect. 118, 432-436 (2010).
  20. Dancis, J. Why perfuse the human placenta. Contrib Gynecol. Obstet. 13, 1-4 (1985).
  21. May, K., et al. Perfusion of human placenta with hemoglobin introduces preeclampsia-like injuries that are prevented by alpha1-microglobulin. Placenta. 32, 323-332 (2011).
  22. Guller, S., et al. Protein composition of microparticles shed from human placenta during placental perfusion: Potential role in angiogenesis and fibrinolysis in preeclampsia. Placenta. 32, 63-69 (2011).
  23. Challier, J. C. Criteria for evaluating perfusion experiments and presentation of results. Contrib. Gynecol. Obstet. 13, 32-39 (1985).
  24. Kraemer, J., Klein, J., Lubetsky, A., Koren, G. Perfusion studies of glyburide transfer across the human placenta: implications for fetal safety. Am. J. Obstet. Gynecol. 195, 270-274 (2006).
  25. leal, J. K., et al. Modification of fetal plasma amino acid composition by placental amino acid exchangers in vitro. J. Physiol. 582, 871-882 (2007).
  26. athiesen, L., et al. Quality assessment of a placental perfusion protocol. Reprod. Toxicol. 30, 138-146 (2010).
  27. Myllynen, P., et al. Preliminary interlaboratory comparison of the ex vivo dual human placental perfusion system. Reprod Toxicol. 30, 94-102 (2010).
  28. Malek, A., Sager, R., Schneider, H. Maternal-fetal transport of immunoglobulin G and its subclasses during the third trimester of human pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 32, 8-14 (1994).
  29. Prouillac, C., Lecoeur, S. The role of the placenta in fetal exposure to xenobiotics: importance of membrane transporters and human models for transfer studies. Drug Metab. Dispos. 38, 1623-1635 (2010).
  30. Poulsen, M. S., Rytting, E., Mose, T., Knudsen, L. E. Modeling placental transport: correlation of in vitro BeWo cell permeability and ex vivo human placental perfusion. Toxicol. In Vitro. 23, 1380-1386 (2009).
  31. Mathiesen, L., Rytting, E., Mose, T., Knudsen, L. E. Transport of benzo[alpha]pyrene in the dually perfused human placenta perfusion model: effect of albumin in the perfusion medium. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 105, 181-187 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics