Bestemmelse af transport Rate af Xenobiotics og nanomaterialer over placenta ved hjælp af
1Department of Obstetrics, Perinatal Pharmacology, University Hospital Zurich, 2Laboratory for Materials - Biology Interactions, EMPA Swiss Federal Laboratories for Materials Testing and Research, 3Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Den

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Grafmüller, S., Manser, P., Krug, H. F., Wick, P., von Mandach, U. Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model. J. Vis. Exp. (76), e50401, doi:10.3791/50401 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Årtier siden den humane placenta blev anset for at være en uigennemtrængelig barriere mellem mor og ufødte barn. Men opdagelsen af ​​thalidomid-inducerede fosterskader og mange senere studier bagefter viste det modsatte. I dag flere skadelige fremmedstoffer som nikotin, blev heroin, metadon eller narkotika samt miljøforurening beskrevet at overvinde denne barriere. Med den stigende brug af nanoteknologi, er moderkagen forventes at komme i kontakt med nye nanopartikler enten ved et uheld ved eksponering eller forsætligt i tilfælde af potentielle nanomedical applikationer. Data fra dyreforsøg ikke kan ekstrapoleres til mennesker, fordi moderkagen er den mest artsspecifikke pattedyr organ 1.. Derfor ex vivo dual recirkulerende human placentaperfusion, udviklet af Panigel et al. I 1967 2 og løbende modificeret af Schneider et al. I 1972 3, tjener kan som en fremragende model to studere overførsel af xenobiotika eller partikler.

Her fokuserer vi på ex vivo dual recirkulerende human placentaperfusion protokol og dens videre udvikling at erhverve reproducerbare resultater.

Den efterbyrd blev opnået efter informeret samtykke af mødrene fra ukomplicerede sigt graviditeter gennemgår kejsersnit. De fosteret og moderen fartøjer med en intakt kimbladene blev kanyleret og perfunderet i mindst fem timer. Som model partikel fluorescensmærkede polystyrenpartikler med størrelser på 80 og 500 nm i diameter sattes til moderens kredsløb. De 80 nm partikler var i stand til at passere placentabarrieren og giver et perfekt eksempel for et stof, der overføres over placenta til fostret, mens de 500 nm partikler blev bibeholdt i placenta væv eller moderens kredsløb. Den ex vivo humane placentaperfusion model er en af de få modeller, der giver pålidelige oplysninger omtransport adfærd miljøfremmede stoffer på et vigtigt væv barriere, som leverer forudsigende og kliniske relevante data.

Introduction

Moderkagen er et komplekst organ, der er ansvarlig for udveksling af oxygen, kuldioxid, næringsstoffer og affaldsprodukter og på samme tid i stand til at holde de to blodkredsløb hos moderen og den voksende fosteret adskilt fra hinanden. Derudover forhindrer afvisning af barnet den maternelle immunsystemet og udskiller hormoner til at opretholde graviditet. Den cellulære barriere er dannet af cytotrophoblastceller som fusionerer og danner en sand syncytium uden laterale cellemembraner 4,5. Hele placenta er opdelt i flere kimblade, som indeholder en føtal villøs træet og repræsenterer en funktionel enhed af moderkagen.

Studiet af placentabarrieren funktion blev intensiveret med opdagelsen af ​​de thalidomid inducerede misdannelser i 1960'erne. Af indlysende grunde translokation studier med gravide kvinder kan ikke udføres. Derfor har forskellige alternative modeller blevet udviklet 6,7 ex vivo humane placentaperfusion udviklet af Panigel og medarbejdere 2,3.

Mange kvinder udsættes for forskellige miljøfremmede stoffer såsom narkotika eller miljøforurening under deres graviditet 8.. For nogle lægemidler, som allerede blev administreret regelmæssigt under graviditeten, kan in vivo-undersøgelser udføres ved sammenligning af den maternale blodkoncentration med det i navlestrengsblod. Men generelt er der kun begrænsede oplysninger om farmakokinetik og-dynamik i fosteret og teratogenicitet af disse stoffer.

For eksempel opiater som heroin let krydser placentabarrieren og kan føre til intrauterin vækst begrænsning for tidlig fødsel eller spontan abort 9,10. Så i tilfælde af manglende afholdenhed under graviditeten en substitutionsterapi med metadon anbefales. Exvivo human placentaperfusion model viste, at overførslen af metadon i den føtale cirkulation er ubetydelig 11, som korrelerer godt med den beregnede navlestrengsblod-til-maternale blodkoncentration forholdet efter levering 12..

Nanoteknologi er et voksende område især i medicin. Så under naturligt forekommende fine (<2,5 um i diameter) og ultrafine partikler (<0,1 um i diameter) i dampe af skovbrande, vulkanudbrud og ørken støv, udsættelse for manipuleret nanomaterialer (mindst én dimension <0,1 um 13 ) er stigende. Dette rejste spørgsmål om toksikologiske potentiale af industrielt fremstillede nanomaterialer. Selvom ingen menneskelig risiko kunne bevises endnu, er der væsentlige eksperimentelle studier tyder på, at nanopartikler kan forårsage uønskede biologiske reaktioner, der fører til toksikologiske resultater 14. For nylig nogle undersøgelser, at prænatal udsættelse forluftforureningen er knyttet til en højere respiratorisk behov og betændelse i luftvejene hos nyfødte og børn 15,16. Derudover kan små nanopartikler kan anvendes som bærere af lægemidler til specifikt behandle fosteret eller moderen. Derfor bliver det tydeligt, at omfattende undersøgelser af forskellige miljøfremmede stoffer eller nanomaterialer og deres evne til at krydse placentabarrieren er påkrævet. En egentlig overblik over de igangværende undersøgelser om placenta gennemtrængelighed til industrielt fremstillede nanomaterialer er sammenfattet i Menezes et al. 2011 17 og Buerki-Thurnherr et al. 2012 7..

Den ex vivo dual recirkulerende human placentaperfusion model giver en kontrolleret og pålideligt system til at studere den placentale transport af forskellige endogene og eksogene forbindelser 3,11,12,18,19 og en lang række andre funktioner i moderkagen som mekanismer, der er ansvarlige for udvikling af patologiske tilstande som præeklampsi <sup> 20-22. I denne protokol fokuserer vi primært på opsætning, håndtering og metode, der tillader studiet af ophobning, effekter og translokation satser for en bred vifte af miljøfremmede stoffer eller nanopartikler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Forberedelse perfusionssystemet

  1. Opsæt perfusion system bestående af et vandbad, en perfusionskammer, to kolonner for iltning, to peristaltiske pumper, to boble fælder, to flow varmeapparater og en tryksensor (Figur 1). Forbinde disse komponenter med rørsektioner sammensat af silikone og polyvinylklorid materialer ifølge skemaet i figur 2. Endelig er der to kredsløb, der repræsenterer den føtale og maternelle kredsløb, hhv.
  2. Tænd vandbad, strømmen varmeapparater og opvarmning til perfusionskammeret. Temperaturen bør være 37 ° C.
  3. Opvarm perfusionsmediet (NCTC-135 vævskulturmedium fortyndet 1:2 med Earles puffer (6,8 g / l natriumchlorid, 0,4 g / l kaliumchlorid, 0,14 g / L mononatriumphosphat, 0,2 g / L magnesiumsulfat, 0,2 g / l calciumchlorid, 2 g / l glucose) suppleret med glucose (1 g / L), dextran 40 (10 g / L), bovint serumalbumin (10 g/ L), natriumheparin (2.500 IU / L), amoxicillin (250 mg / l) og natriumbicarbonat (2,2 g / L), pH 7,4) i vandbad.
  4. Fortløbende skylle arterielle systemer fosterets og moderens kredsløb med a) 200 ml destilleret vand, b) 50 ml 1% natriumhydroxid, c) 1% phosphorsyre og d) igen 200 ml destilleret vand (strømningshastighed: 15 - 20 ml / min).
  5. Tilslut den føtale kanyle (Ø 1,2 mm, stump nål skal knyttes til en modificeret bevinget nål infusionssæt) til føtale arterielle slange.
  6. Skyl de arterielle systemer fosterets og moderens kredsløb med perfusionsmediet indtil alle glas indeholder medium (flow rate: 15-20 ml / min). Under dette trin fylde bobbelfælder og fjerne alle bobler nedstrøms fælden. Derefter stoppe pumperne. Det er virkelig vigtigt, at de afferente arteriel rør er altid gratis bobler, ellers efter kanylering især de fine føtale skibe kan briste.
  7. Tænd gasstrømmen. Moderens kredsløb iltes with 5% carbondioxid og 95% syntetisk luft og fosterets kredsløb med 5% carbondioxid og 95% nitrogen.
  8. Starte optagelsen af ​​trykføleren.

2.. Kanylering moderkagen

  1. Opnå intakt efterbyrd fra ukomplicerede sigt graviditeter efter primær kejsersnit. Skriftlige samtykke skal gives (blev opnået i tilfælde af vore studier) af mødre før levering, og undersøgelsen skal godkendes af den lokale etiske komité (det var tilfældet i vores forsøg). Første visuel kontrol bør udføres af jordemødre til at sikre en sund og intakt placenta.
  2. Kanylering af moderkagen er et afgørende skridt! Under perfusion hver eneste lille afbrydelse i vævet kan føre til en lækage mellem mødres og føtale cirkulation. Moderkagen skal indhentes inden for 30 min efter levering.
  3. Vælg en intakt cotyledon ved den marginale zone af moderkagen uden synlige forstyrrelser på moderens side. På chorion plade,binde begge associerede grene af navlestrengen arterie og vene opstrøms til den senere kanylering side (mod navlestrengen) ved hjælp af kirurgisk suturmateriale. Foretag altid to knob.
  4. Cannulate fosterets arterie først. De føtale placenta arterier er altid mindre og tyndere end venerne.
  5. Lav en sutur omkring fosterets arterie, men ikke binde det op med det samme. Hold beholderen med en pincet, klippe beholderen omhyggeligt og sætte den lille kanyle (Ø 1,2 mm) i arterien. Derefter binde op sutur (to knob).
  6. Fortsæt med den føtale vene på samme måde, men bruger en større kanyle (Ø 1,5-1,8 mm, stump nål skal knyttes til en modificeret bevinget nål infusionssæt).
  7. Tænd føtale pumpe (2 ml / min). Hvis der ikke er synlig lækage og blod udstråler ud af fostrets vene kanylen langsomt øge strømmen op til 4 ml / min. Overhold trykket i føtale arterie, bør det ikke overstige 70 mmHg. Hvis væske siver ud på føtal eller maternal kanyle løse dem med en anden sutur.
  8. Placer moderkagen på vævet holderen med fosterets side op og træk placenta membranen og væv over spikes. I sidste ende perfunderede kotyledonen bør være i midten af ​​hullet i vævet holderen.
  9. Stabilisere den del, hvor kun membranen holder placenta med en silikone membran (Ø 1 mm) eller alternativt to parafilm stykker.
  10. Saml hele væv indehaveren, stram skruerne og skær den overhængende væv. Bemærk venligst, at venøs og arteriel kanyler ikke kommer i klemme, men i stedet lå i de små kanaler i væv indehaveren.
  11. Vend vævet indehaveren hovedet, sætte det ind i perfusionskammeret og tilsæt dækslet. Nu skal moderens side være øverst. Kontrollér altid hvis den føtale kredsløb er stadig intakt og mediet strømmer ud af fostrets vene slangen.
  12. Tænd moderens pumpe (12 ml / min). Indføre de tre stumpe kanyler (Ø 0,8 mm) ved the ende af moderens arterie slange i intervillous rum ved at trænge ind decidua plade. At returnere perfusatet til moderens kredsløb sætte et rør som venøs afløb som også er forbundet med den maternelle pumpe til den laveste position i den øvre del af perfusionskammeret.
  13. Forbind den føtale vene kanyle til fosterets vene røret.

3.. Eksekvering Pre-og forsøgsfase Perfusion

  1. At tillade væv at komme fra den iskæmiske periode efter fødslen og til at skylle ud blodet i intervillous rum, en åben præ-fase på 20 minutter er nødvendig. Det betyder, at moder og foster vene er ikke førende tilbage til den arterielle reservoir indeholdende perfusionsmediet. Saml fosterets og moderens venøs udstrømning i en flaske og kassér den efter pre-fasen.
  2. At vurdere integriteten af ​​perfusionen udføre en anden præ-fase på 20 minutter, men i et lukket kredsløb. Brug to separate reservoirer med perfusionsmedietfor fosterets og moderens kredsløb og lukke kredsløbene ved at føre den føtale venøse udstrømning tilbage i fosterets reservoiret og moderens venøse udstrømning tilbage i moderens reservoiret.
  3. For de vigtigste perfusion eksperimentet udarbejde to kolber med 120 ml perfusionsmediet (en for moderens og en for føtal reservoir). Tilsæt radioaktivt 14C-antipyrin (4 nCi / ml tjener som positiv kontrol, ADVARSEL: radioaktivt stof) og fluorescens-mærkede miljøfremmede eller nanopartikler, som man ønsker at analysere den maternelle reservoiret. Bland den maternelle perfusatet godt.
  4. Start eksperimentet ved at udveksle den rene perfusionsmediet med de to forberedte kolber (fosteret og moderen reservoirer). Luk kredsløb ved at føre den føtale venøse udstrømning tilbage i fosterets reservoiret og moderens venøse udstrømning tilbage i moderens reservoiret.
  5. Fortsæt perfusion for 6 timer og tage prøver regelmæssigt. Altid opblande mediet i fosteret og moderenreservoir før tilbagetrækningen.
  6. Regulering af trykket i den føtale arterie (må ikke overstige 70 mmHg), pH i både kredsløb (bør være i en fysiologisk interval 7,2-7,4) og mængden af ​​både reservoirer (føtalt volumen tab bør ikke overstige 4 ml / time) under perfusion . Hvis det er nødvendigt justere pH-værdier ved hjælp af enten saltsyre eller natriumhydroxid.
  7. Hvis volumen underskud i føtale reservoir overstiger 4 ml / time der er en lækage i vævet og man skal stoppe perfusion. Succesraten af ​​perfusion for 6 timer uden lækage er omkring 15-20%.
  8. Stop perfusion efter 6 timer. Vend ud pumper, vandbad, flow varmeapparater og gas flow.
  9. Fjern moderkagen fra vævet holderen, klippe perfunderede cotyledon (lysere end unperfused væv) og vejes.
  10. Tage prøver fra unperfused (en del af moderkagen, som blev skåret i begyndelsen, kunne allerede taget i før-fase) og perfunderede væv (hver omkring 1 g) og gemme dem på -20 ° Cindtil homogenisering eller i flydende nitrogen til senere analyse. Fastsætte et andet vævsprøve i 4% formalin til histopatologisk evaluering. Prøverne skal omfatte alle lag af moderkagen.
  11. Rengør rørene efter perfusion ved successivt at skylle de arterielle systemer føtale og maternelle kredsløb med a) 200 ml destilleret vand, b) 50 ml 1% natriumhydroxid, c) 50 ml 1% phosphorsyre og d) igen 200 ml destilleret vand (flow: 15-20 ml / min).

Hele arbejdsgang af moderkagen perfusion eksperiment er afbildet i figur 3.

4.. Analysere Samples

  1. Centrifuger perfusatet prøver i 10 minutter ved 800 xg før analyse for at fjerne resterende erythrocytter. Tag supernatanten for yderligere analyse. Prøverne kan efterlades natten over ved 4 ° C. Til analyse af leptin og hCG produktion kan prøverne opbevares ved -20 ° C.
  2. At evaluere permeabiliteten afplacenta analysere 14C-antipyrin ved væskescintillation. Bland 300 pi af fosteret og moderen prøver med 3 ml scintillationsblanding og måle i 5 min i en beta-tæller.
  3. For at vurdere overførslen af ​​de fluorescerende nanopartikler eller miljøfremmede af interesse læse fluorescens ved 485 nm excitation og 528 nm emission i en mikropladelæser (angivet bølgelængder er til analyse af den gule grønne etiket, som vi har brugt til nanopartikler).
  4. At bestemme levedygtigheden af ​​placentavævet under perfusion måle glukose forbrug og produktion af lactat i foster og moderens kredsløb med et automatiseret blod gassystemet. Derudover vurdere produktionen af ​​placenta hormoner human choriongonadotropin (hCG) og leptin i den homogeniserede vævsprøver og perfusates ved enzymkoblet immunosorbent assay (ELISA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 4A viser perfusion profiler af små polystyrenpartikler (80 nm), som blev transporteret over placenta sammenlignet med større polystyrenpartikler (500 nm), som ikke blev overført til fosterets rum. Hvert datapunkt repræsenterer middelværdien partikelkoncentrationen til det givne tidspunkt på mindst 3 uafhængige forsøg. For polystyren nanopartikler placentaoverførsel er størrelse-afhængig 19. Efter 3 timer moderkage perfusion allerede 20-30% af de oprindeligt tilsatte 80 nm polystyrenpartikler blev overført fra moderens til fosterets kredsløb, mens de 500 nm polystyrenpartikler ikke blev vist i den føtale kredsløb, selv efter 6 timer perfusion. Ikke desto mindre er den maternale koncentration af 500 nm-partikler faldende. Fluorescens billeder på histologisk snit af vævet efter perfusion viste, at disse partikler ophobes i villi placenta (data ikke vist). Figur 4B 14C-antipyrin. Antipyrin som en lille lipofilt molekyle er fordelt over placentabarrieren via passiv diffusion og tjener som kontrol for integriteten af ​​kredsløb. Efter 4-6 hr perfusion en ligevægt mellem fosterets og moderens antipyrin koncentration bør bygges 23. At vurdere og sammenligne placenta transport satsen for miljøfremmede stoffer den føtale-til-maternel medikamentkoncentration (F / M) forholdet er normalt vises (figur 5).

Gennem analyse af laktat og placenta hormon (human choriongonadotropin og leptin) produktion samt glukose forbrug levedygtighed og funktionalitet placentavæv under perfusion kan overvåges (figur 6). Værdierne for perfusioner med miljøfremmede bør altid være i samme størrelsesorden som værdierne fra kontrol perfusion uden miljøfremmede. Desuden histop athological evaluering af den gennemstrømmede placentavæv kunne udføres. En sammenligning med ikke-perfunderede placentavæv kunne så afsløre patologiske forandringer som følge af perfusion (f.eks bakteriel kontaminering), og derfor kunne tjene som en anden kvalitetskontrol parameter.

Yderligere repræsentative resultater opnået med ex vivo dual recirkulerende human placentaperfusion model blev offentliggjort for nylig 11,19.

Figur 1
Figur 1.. Ex vivo human placentaperfusion set-up. 1) Vandbad med moderen og fosteret reservoirer, 2) perfusionskammer, 3) boblefælde, 4) oxygenator kolonner og 5) flow radiator.

load/50401/50401fig2.jpg "/>
Figur 2. Skematisk illustration af ex vivo humane placentaperfusion model FA: føtal arterie, FV:. Føtal vene, MA: maternal arterie; MV: maternal vene, BT: boblefælde, PS: tryksensor

Figur 3
Figur 3. Arbejde procedure af et ex vivo human placentaperfusion eksperiment. Efter levering placenta skal kanyle inden for 30 min. Før 6 timer eksperimentelle fase med recirkulation en åben præ-fase og lukkede pre-fasen bør udføres i mindst 20 minutter hver.

Figur 4
Figur 4.. Perfusion profiler af polystyren partikler og 14 </ Sup> C-antipyrin 19.. Perfusion profil polystyrenpartikler i størrelserne 80 nm (n = 4) og 500 nm (n = 3). Oprindeligt 25 ug / ml partikler og 4,2 nCi / ml 14C-antipyrin sattes til moderens kredsløb. Mængden af partikler (A) og 14 C-antipyrin (B) blev målt hos moderen (M, faste symboler) og føtal (F, åbne symboler) kredsløb efter de angivne tidspunkter. Vist er den gennemsnitlige koncentration ± SE. Klik her for at se større figur .

Figur 5
Figur 5. Størrelse-afhængig overførsel af polystyren partikler over den humane placenta 19.. Forholdene mellem fosteret og moderen koncentrationer af 14 C-antipyrin og polystyren partikler var calculated efter 180 min moderkage perfusion. Dataene repræsenterer middelværdien ± SE for mindst 3 uafhængige forsøg. Kontrol kolonne afbilder perfusioner uden partikler, men med 14 C-antipyrin. (* P <0,05 sammenlignet med 80 nm forholdet værdi).

Figur 6
Figur 6.. Levedygtighed placentavæv under perfusion 19. (A) Glucose forbrug og produktion af lactat i perfusion placenta. Vist er summen af ændringer i det samlede indhold i kredsløb (føtal og maternel) over tid divideret med vægten af den perfunderede cotyledon. (B) Normalized nettoproduktion (NP divideret med initial væv indhold T0) af de placentale hormoner human choriongonadotropin og leptin. Dataene repræsenterer middelværdien ± SE på lØst 3 uafhængige forsøg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Under den dobbelte recirkulerende perfusion viste her, er der flere andre eksperimentelle konfigurationer muligt, afhængigt af det spørgsmål, der skal besvares. Særligt åbne placenta perfusioner er almindeligt anvendt til at vurdere stoffet clearance ved steady state koncentration 3.. Den recirkulerende perfusion set-up kan også anvendes til at bekræfte aktiv transport af endogene eller eksogene stoffer. For denne fremgangsmåde den samme koncentration af miljøfremmede skal tilføjes til den maternelle og føtale cirkulation. Antaget, at der er aktiv transport mod koncentrationsgradient kan ophobning af teststoffet i det ene af de to kredse skal overholdes 24. Bemærkes, er tilsætningen af teststoffet kun til fosterets kredsløb også mulig og kan afsløre mekanismen for transport over placentabarrieren af denne specifikke substans 25.

Protokollen har udviklet sig over time og kan variere mellem forskellige forskergrupper især vedrørende flow, sammensætning perfusion medium, form for iltning og opvarmning 26,27. Især strømningshastighed kan påvirke det tidspunkt, hvor transplacental overførsel finder sted. At styre dette, tilsætning af et passivt transporteret referenceforbindelse som antipyrin er vigtig. Overførselshastigheden af miljøfremmede kan altid sammenlignes med overførselshastighed på phenazon (F / M-forhold bør være over 0,75) 26. Siden antipyrin overførslen primært er begrænset af strømmen og udvekslingen overflade, denne sammenligning tager forskelle i flowet og størrelsen af ​​den perfunderede cotyledon hensyn, der kunne variere mellem forsøgene. Desuden kunne FITC-dextran tilsættes til fosterets kredsløb til at tjene som kontrol for integriteten af barrieren 26.. Føtal volumen tab også anvendes som markør for barriere integritet. Normalt en føtal væsketab op til 4 ml / time er tilladt 28, menre er ingen generelt accepteret grænse.

Naturligvis er der nogle ulemper ved ex vivo humane placentaperfusion metode som inter-individuelle variationer og en lav succesrate (15-20%). Desuden kan en perfusion periode på 6 timer ikke simulere en kronisk medicinsk behandling og kan derfor ikke helt udelukke overdragelse af en xenobiotisk efter langvarig eksponering. En anden begrænsning i modellen er, at især transplacental overførsel på sigt vurderes, mens transport sats på tidlige svangerskabsuge aldre, når barrieren er tykkere bliver stadig ukendt. Faktisk perfusion af første trimester efterbyrd er muligt, men tilgængeligheden af ​​disse efterbyrd er ret begrænset. Alligevel, indtil nu ex vivo placentaperfusion metode er den eneste model til at studere transport af forskellige xenobiotika eller nanopartikler i organiserede humant placentavæv. Mens toksikodynamik i ex vivo menneskelige perfusion model kan analyseres kun i den placental væv kan dyreforsøg faktisk give også oplysninger om embryotoksicitet. Skønt, på grund af de anatomiske forskelle placentabarrieren mellem mennesker og gnavere disse resultater ikke kan ekstrapoleres til mennesker 4,5. En anden mulighed for at efterforske transplacentalt overførsel kan være cellekultur modeller som primære cytotrophoblaster, choriocarcinom cellelinier, isolerede plasmamembran blærer eller placentavæv eksplanteret 29. Den mest anvendte model er BeWo cellelinien, disse celler stammer fra en malign gestationel choriocarcinom og kan danne en sammenflydende monolag på en gennemtrængelig membran, så transport undersøgelser kan udføres. Resultater af transport undersøgelser ved hjælp af BeWo celle model korrelerer godt med resultater opnået i ex vivo humane placentaperfusion 30. Men for at studere detaljerne i drug transport (f.eks bidrag af en specifik transport protein) og metabolisme, kan BeWo celle model være mmalm gennemførlig primært fordi det er lettere at håndtere og modtagelige for manipulation lignende udtryk af genetisk ændrede transportører eller enzymer, men i generelle drug transfer undersøgelser pålideligheden af ​​denne model er begrænset. Det mangler blodgennemstrømningen og integriteten af monolaget skal vurderes omhyggeligt, da det afhænger af flere faktorer såsom celledyrkningsbetingelser, såning tæthed, eksponeringstid og membranen indsatsen 6,29.

Forskellige fremmedstoffer og også nanopartikler binder til forskellige plasma proteiner som kan influere betydeligt på transplacental overførsel 31, overvejer binding til plasmaproteiner er derfor vigtig. Perfusionsmediet indeholder bovint serumalbumin, den hyppigste plasmaprotein. For nylig viste en undersøgelse, at transferreglerne nøgletal for forskellige stoffer opnået med ex vivo humane placentaperfusion model korrelerer godt med in vivo navlestrengsblod til moderensblodkoncentration nøgletal når overførslen nøgletal er justeret i forhold til omfanget af plasmaproteinbinding 12..

Samlet ex vivo placentaperfusion model er en gyldig og pålidelig metode til at studere transport over den humane placenta og til at forudsige in vivo transplacental passage af xenobiotika og nanopartikler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgements

Dette arbejde er støttet af den schweiziske nationalbank Foundation, (NRP 64 programmet ikke give 4064 til 131.232).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NCTC-135 medium ICN Biomedicals, Inc. 10-911-22C could be replaced by Medium 199 from Sigma (M3769)
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich, Fluka 71381
Potassium chloride (KCl) Hospital pharmacy also possible: Sigma (P9541)
Monosodium phosphate (NaH2PO4 · H2O) Merck 106346
Magnesium sulfate (MgSO4 · H2O) Sigma-Aldrich, Fluka 63139
Calcium chloride (CaCl, anhydrous) Merck 102388
D(+) Glucose (anhydrous) Sigma-Aldrich, Fluka 49138
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Merck 106329
Dextran from Leuconostoc spp. Sigma-Aldrich 31389
Bovine serum albumin (BSA) Applichem A1391
Amoxicilline (Clamoxyl) GlaxoSmithKline AG 2021101A
Sodium heparin B. Braun Medical AG 3511014
Sodium hydoxide (NaOH) pellets Merck 106498 CAUTION: corrosive
Ortho-phosphoric acid 85% (H3PO4) Merck 100573 CAUTION: corrosive
Maternal gas mixture: 95% synthetic air, 5% CO2 PanGas AG
Fetal gas mixture: 95% N2, 5% CO2 PanGas AG
Antipyrine (N-methyl-14C) American Radiolabeled Chemicals, Inc. ARC 0108-50 μCi CAUTION: radioactive material (specific activity: 55mCi/mmol)
Scintillation cocktail (IrgaSafe Plus) Zinsser Analytic GmbH 1003100
Polystyrene particles 80 nm Polyscience, Inc. 17150
Polystyrene particles 500 nm Polyscience, Inc. 17152
EQUIPMENT
Water bath VWR 462-7001
Thermostat IKA-Werke GmbH Co. KG 3164000
Peristaltic pumps Ismatec ISM 833
Bubble traps (glass) UNI-GLAS Laborbedarf
Flow heater UNI-GLAS Laborbedarf
Pressure sensor + Software for analyses MSR Electronics GmbH 145B5
Notebook Hewlett Packard
Miniature gas exchange oxygenator Living Systems Instrumentation LSI-OXR
Tygon Tube (ID: 1.6 mm; OD: 4.8 mm) Ismatec MF0028
Tubes for pumps (PharMed BPT; ID: 1.52 mm) Ismatec SC0744
Blunt cannulae ( 0.8 mm) Polymed Medical Center 03.592.81
Blunt cannulae ( 1.2 mm) Polymed Medical Center 03.592.90
Blunt cannulae ( 1.5 mm) Polymed Medical Center 03.592.94
Blunt cannulae ( 1.8 mm) Polymed Medical Center 03.952.82
Parafilm VWR 291-1212
Perfusion chamber with tissue holder (plexiglass) Internal technical department Similar equipment is available from Hemotek Limited, UK
Surgical suture material (PremiCron) B. Braun Medical AG C0026005
Winged Needle Infusion Set (21G Butterfly) Hospira, Inc. ASN 2102
Multidirectional stopcock (Discofix C-3) B. Braun Medical AG 16494C
Surgical scissors B. Braun Medical AG BC304R
Dissecting scissors B. Braun Medical AG BC162R
Needle holder B. Braun Medical AG BM200R
Dissecting forceps B. Braun Medical AG BD215R
Automated blood gas system Radiometer Medical ApS ABL800 FLEX
Multi-mode microplate reader BioTek Synergy HT
Liquid scintillation analyzer GMI, Inc. Packard Tri-Carb 2200
Scintillation tubes 5.5 ml Zinsser Analytic GmbH 3020001
Tissue Homogenizer OMNI, Inc. TH-220
pH meter + electrode VWR 662-2779

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ala-Kokko, T. I., Myllynen, P., Vahakangas, K. Ex vivo perfusion of the human placental cotyledon: implications for anesthetic pharmacology. Int. J. Obstet. Anesth. 9, 26-38 (2000).
  2. Panigel, M., Pascaud, M., Brun, J. L. Radioangiographic study of circulation in the villi and intervillous space of isolated human placental cotyledon kept viable by perfusion. J. Physiol. (Paris). 59, 277 (1967).
  3. Schneider, H., Panigel, M., Dancis, J. Transfer across the perfused human placenta of antipyrine, sodium and leucine. Am. J. Obstet. Gynecol. 114, 822-828 (1972).
  4. Enders, A. C., Blankenship, T. N. Comparative placental structure. Adv. Drug Deliv. Rev. 38, 3-15 (1999).
  5. Takata, K., Hirano, H. Mechanism of glucose transport across the human and rat placental barrier: a review. Microsc. Res. Tech. 38, 145-152 (1997).
  6. Saunders, M. Transplacental transport of nanomaterials. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 1, 671-684 (2009).
  7. Buerki-Thurnherr, T., von Mandach, U., Wick, P. Knocking at the door of the unborn child: engineered nanoparticles at the human placental barrier. Swiss Med. Wkly. 142, w13559 (2012).
  8. Gendron, M. P., Martin, B., Oraichi, D., Berard, A. Health care providers' requests to Teratogen Information Services on medication use during pregnancy and lactation. Eur. J. Clin. Pharmacol. 65, 523-531 (2009).
  9. Burns, L., Mattick, R. P., Lim, K., Wallace, C. Methadone in pregnancy: treatment retention and neonatal outcomes. Addiction. 102, 264-270 (2007).
  10. von Mandach, U. Drug use in pregnancy. Ther. Umsch. 62, 29-35 (2005).
  11. Malek, A., Obrist, C., Wenzinger, S., von Mandach, U. The impact of cocaine and heroin on the placental transfer of methadone. Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 61 (2009).
  12. Hutson, J. R., Garcia-Bournissen, F., Davis, A., Koren, G. The human placental perfusion model: a systematic review and development of a model to predict in vivo transfer of therapeutic drugs. Clin. Pharmacol. Ther. 90, 67-76 (2011).
  13. International Organization for Standardization (ISO). Technical Specification (ISO/TS) 27687. Nanotechnologies – Terminology and definitions for nano-objects – Nanoparticles, nanofibre and nanoplate. (2008).
  14. Pietroiusti, A. Health implications of engineered nanomaterials. Nanoscale. 4, 1231-1247 (2012).
  15. Latzin, P., Roosli, M., Huss, A., Kuehni, C. E., Frey, U. Air pollution during pregnancy and lung function in newborns: a birth cohort study. Eur. Respir. J. 33, 594-603 (2009).
  16. Lacasana, M., Esplugues, A., Ballester, F. Exposure to ambient air pollution and prenatal and early childhood health effects. Eur. J. Epidemiol. 20, 183-199 (2005).
  17. Menezes, V., Malek, A., Keelan, J. A. Nanoparticulate drug delivery in pregnancy: placental passage and fetal exposure. Curr. Pharm. Biotechnol. 12, 731-742 (2011).
  18. Muhlemann, K., Menegus, M. A., Miller, R. K. Cytomegalovirus in the perfused human term placenta in vitro. Placenta. 16, 367-373 (1995).
  19. Wick, P., et al. Barrier capacity of human placenta for nanosized materials. Environ. Health Perspect. 118, 432-436 (2010).
  20. Dancis, J. Why perfuse the human placenta. Contrib Gynecol. Obstet. 13, 1-4 (1985).
  21. May, K., et al. Perfusion of human placenta with hemoglobin introduces preeclampsia-like injuries that are prevented by alpha1-microglobulin. Placenta. 32, 323-332 (2011).
  22. Guller, S., et al. Protein composition of microparticles shed from human placenta during placental perfusion: Potential role in angiogenesis and fibrinolysis in preeclampsia. Placenta. 32, 63-69 (2011).
  23. Challier, J. C. Criteria for evaluating perfusion experiments and presentation of results. Contrib. Gynecol. Obstet. 13, 32-39 (1985).
  24. Kraemer, J., Klein, J., Lubetsky, A., Koren, G. Perfusion studies of glyburide transfer across the human placenta: implications for fetal safety. Am. J. Obstet. Gynecol. 195, 270-274 (2006).
  25. leal, J. K., et al. Modification of fetal plasma amino acid composition by placental amino acid exchangers in vitro. J. Physiol. 582, 871-882 (2007).
  26. athiesen, L., et al. Quality assessment of a placental perfusion protocol. Reprod. Toxicol. 30, 138-146 (2010).
  27. Myllynen, P., et al. Preliminary interlaboratory comparison of the ex vivo dual human placental perfusion system. Reprod Toxicol. 30, 94-102 (2010).
  28. Malek, A., Sager, R., Schneider, H. Maternal-fetal transport of immunoglobulin G and its subclasses during the third trimester of human pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 32, 8-14 (1994).
  29. Prouillac, C., Lecoeur, S. The role of the placenta in fetal exposure to xenobiotics: importance of membrane transporters and human models for transfer studies. Drug Metab. Dispos. 38, 1623-1635 (2010).
  30. Poulsen, M. S., Rytting, E., Mose, T., Knudsen, L. E. Modeling placental transport: correlation of in vitro BeWo cell permeability and ex vivo human placental perfusion. Toxicol. In Vitro. 23, 1380-1386 (2009).
  31. Mathiesen, L., Rytting, E., Mose, T., Knudsen, L. E. Transport of benzo[alpha]pyrene in the dually perfused human placenta perfusion model: effect of albumin in the perfusion medium. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 105, 181-187 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics