Détermination de la vitesse de transport des xénobiotiques et des nanomatériaux à travers le placenta en utilisant l'
1Department of Obstetrics, Perinatal Pharmacology, University Hospital Zurich, 2Laboratory for Materials - Biology Interactions, EMPA Swiss Federal Laboratories for Materials Testing and Research, 3Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern

Bioengineering

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Grafmüller, S., Manser, P., Krug, H. F., Wick, P., von Mandach, U. Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model. J. Vis. Exp. (76), e50401, doi:10.3791/50401 (2013).

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Abstract

Il ya le placenta humain décennies a été pensé pour être une barrière infranchissable entre la mère et l'enfant à naître. Cependant, la découverte d'anomalies congénitales induite par la thalidomide et de nombreuses études ultérieures ensuite prouvé le contraire. Aujourd'hui, plusieurs xénobiotiques nocifs comme la nicotine, l'héroïne, la méthadone ou de la drogue ainsi que des polluants environnementaux ont été décrits à surmonter cet obstacle. Avec l'utilisation croissante de la nanotechnologie, le placenta est susceptible d'entrer en contact avec de nouvelles nanoparticules soit accidentellement ou intentionnellement par l'exposition dans le cas des applications en nanomédecine potentiels. Les données de l'expérimentation animale ne peuvent être extrapolés à l'homme parce que le placenta est l'organe de mammifère spécifique à l'espèce la plus 1. Par conséquent, l'ex vivo double recirculation de perfusion placentaire humaine, développé par Panigel et al. 2 en 1967 et continuellement modifiée par Schneider et al., En 1972 3, peut servir comme un excellent modèle to étudier le transfert des xénobiotiques ou de particules.

Ici, nous nous concentrons sur la double ex vivo recirculation protocole de perfusion placentaire humaine et son développement ultérieur d'acquérir des résultats reproductibles.

Le placenta a été obtenu après consentement éclairé des mères issus de grossesses simples terme subissant une césarienne. Les vaisseaux du fœtus et de la mère d'un cotylédon intact ont été canules et perfusés au moins pendant cinq heures. En tant que particule de modèle de particules de polystyrène marquées par fluorescence avec des tailles de 80 et 500 nm de diamètre, ont été ajoutés au circuit maternelle. Les particules de 80 nm ont été capables de traverser la barrière placentaire et fournir un exemple parfait d'une substance qui est transférée à travers le placenta vers le foetus tandis que les particules de 500 nm ont été retenus dans le tissu placentaire ou circuit maternelle. Le modèle de la perfusion placentaire humain ex vivo est l'un des rares modèles fournissent des informations fiables surle comportement de transport des xénobiotiques à une barrière tissulaire importante qui fournit des données pertinentes prédictifs et clinique.

Introduction

Le placenta est un organe complexe qui est responsable de l'échange de l'oxygène, du dioxyde de carbone, des nutriments et des déchets, et en même temps en mesure de garder les deux circuits sanguins de la mère et le foetus croissant séparées l'une de l'autre. En outre, il évite le rejet de l'enfant par le système immunitaire de la mère et sécrète des hormones pour maintenir la grossesse. La barrière cellulaire est formée par les cellules du cytotrophoblaste qui fusionnent et forment un véritable syncytium sans membranes cellulaires latérales 4,5. L'ensemble du placenta est organisé en plusieurs cotylédons, qui contiennent un arbre villosités fœtales et représentent une unité fonctionnelle du placenta.

L'étude de la fonction de barrière placentaire a été intensifiée avec la découverte des malformations induites thalidomide dans les années 1960. Pour des raisons évidentes études de translocation avec les femmes enceintes ne peuvent pas être exécutées. Par conséquent, différents modèles alternatifs ont été développés 6,7 ex vivo placenta humain de perfusion développé par Panigel et collègues 2,3.

Beaucoup de femmes sont exposées à des xénobiotiques tels que les médicaments ou les polluants de l'environnement au cours de leur grossesse 8. Pour certains médicaments qui ont déjà été administrées régulièrement pendant la grossesse, des études in vivo peut être réalisée par comparaison de la concentration sanguine maternelle avec celle de sang de cordon ombilical. Cependant, il n'y a généralement que des informations limitées sur la pharmacocinétique et-dynamique chez le fœtus et la tératogénicité de ces substances.

Par exemple opiacés comme l'héroïne facilement traverser la barrière placentaire et peut conduire à une restriction de croissance intra-utérine, accouchement prématuré ou un avortement spontané 9,10. Ainsi, en cas d'abstinence disparus pendant la grossesse un traitement de substitution à la méthadone est recommandée. L'exmodèle de perfusion placentaire humain in vivo a montré que le transfert de la méthadone dans la circulation foetale est négligeable 11, ce qui correspond bien au-à-maternelle rapport calculé sang de cordon de concentration de sang après l'accouchement 12.

La nanotechnologie est un domaine en pleine croissance notamment en médecine. Ainsi, sous le naturel fines (<2,5 m de diamètre) et les particules ultrafines (<0,1 m de diamètre) dans les fumées des feux de forêt, les éruptions volcaniques et dans la poussière du désert, l'exposition aux nanomatériaux manufacturés (au moins une dimension <0,1 um 13 ) est en augmentation. Cela a soulevé des questions sur le potentiel toxicologique des nanomatériaux manufacturés. Bien qu'aucun risque humain pourrait être encore prouvé, il ya des principales études expérimentales indiquent que les nanoparticules manufacturées peuvent provoquer des réactions biologiques néfastes conduisant à des résultats toxicologiques 14. Récemment, certaines études ont montré que l'exposition prénatale à l'la pollution de l'air est liée à un besoin respiratoire supérieur et de l'inflammation des voies respiratoires chez les nouveau-nés et d'enfants 15,16. En outre, les petites nanoparticules pourraient être utilisées comme vecteurs de médicaments pour traiter spécifiquement, soit le fœtus ou la mère. Par conséquent, il devient évident que des études approfondies des xénobiotiques ou des nanomatériaux distinctes et leur capacité à traverser la barrière placentaire sont nécessaires. Un aperçu réel sur les études en cours sur la perméabilité placentaire aux nanomatériaux manufacturés, est résumée dans Menezes et al. 2011 17 et Buerki-Thurnherr et al. 2012 7.

Le double ex vivo recirculation modèle de perfusion placentaire humaine fournit un système contrôlé et fiable pour étudier le transport placentaire de divers endogènes et exogènes composés 3,11,12,18,19 et un large éventail d'autres fonctions du placenta comme mécanismes responsables de l' développement d'états pathologiques comme la pré-éclampsie <sup> 20-22. Dans ce protocole, nous nous concentrons principalement sur la mise en place, la manipulation et un procédé qui permet l'étude de l'accumulation, les effets et les taux de translocation d'un large éventail de xénobiotiques ou des nanoparticules.

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Protocol

1. Préparation du système de perfusion

  1. Mettre en place le système de perfusion constitué d'un bain d'eau, une chambre de perfusion, deux colonnes pour l'oxygénation, deux pompes péristaltiques, deux pièges à bulles, deux appareils de chauffage de flux et un capteur de pression (figure 1). Connecter ces composants avec des sections des tubes sont constitués de matières de chlorure de polyvinyle et de silicones selon le schéma de la figure 2. Enfin, il ya deux circuits représentant le circuit du fœtus et de la mère, respectivement.
  2. Allumer le bain d'eau, les chauffe-eau instantané et le chauffage de la chambre de perfusion. La température doit être 37 ° C.
  3. Chauffer le milieu de perfusion (milieu de culture tissulaire NCTC-135 dilué 1:2 avec du tampon de Earle (6,8 g / chlorure de sodium de L, 0,4 g / l de chlorure de potassium, 0,14 g / L de phosphate monosodique, 0,2 g / l de sulfate de magnésium, 0,2 g / chlorure de calcium de l, 2 g / l de glucose) complété avec du glucose (1 g / L), le dextran 40 (10 g / L), de sérum-albumine bovine (10 g/ L), de l'héparine de sodium (2,500 UI / L), amoxicilline (250 mg / L) et de bicarbonate de sodium (2,2 g / l), pH 7,4) dans le bain d'eau.
  4. Consécutivement rincer les systèmes artérielle du circuit foetal et maternel avec a) 200 ml d'eau distillée, b) de 50 ml d'hydroxyde de sodium à 1%, c) 1% d'acide phosphorique et d) à nouveau 200 ml d'eau distillée (débit: 15 - 20 ml / min).
  5. Raccorder la canule foetal (Ø 1,2 mm; aiguille émoussée doit être attachée à un dispositif de perfusion à aiguille à ailettes modifié) au tube artériel foetal.
  6. Rincer les systèmes artériels du circuit du fœtus et de la mère avec un milieu de perfusion jusqu'à ce que tous les tubes contiennent un milieu (débit: 15-20 ml / min). Au cours de cette étape de remplir les pièges à bulles et supprimer toutes les bulles en aval du piège. Puis arrêter les pompes. Il est vraiment important que les tubes artériels afférents sont toujours libres de bulles, sinon après cathétérisme surtout les vaisseaux fœtaux fines peuvent se rompre.
  7. Allumer le flux de gaz. Le circuit maternelle est oxygéné wie 5% de dioxyde de carbone et de 95% d'air et le circuit de synthèse foetal avec 5% de dioxyde de carbone et 95% d'azote.
  8. Démarrer l'enregistrement du capteur de pression.

2. Cannulating le placenta

  1. Obtenir placenta intact de grossesses sans complication terme après césarienne primaire. Le consentement écrit doit être donné (a été obtenue dans le cas de nos études) par les mères avant l'accouchement et l'étude doit être approuvé par le comité Éthique local (ce fut le cas dans nos études). Premier contrôle visuel doit être effectué par des sages-femmes pour assurer un placenta sain et intact.
  2. Cannulation du placenta est une étape cruciale! Au cours de la perfusion toutes les petites perturbations dans les tissus peut conduire à une fuite entre la circulation maternelle et fœtale. Le placenta doit être obtenue dans les 30 minutes après l'accouchement.
  3. Sélectionner un cotylédons intact dans la zone marginale du placenta sans perturbations visibles du côté maternel. Lors de la plaque chorionique,attacher les deux branches associées de l'artère et de la veine ombilicale en amont sur le côté de canulation tard (vers le cordon ombilical) à l'aide de matériel de suture chirurgicale. Assurez-vous toujours deux noeuds.
  4. Cathétériser l'artère fœtale premier. Les artères placentaires fœtales sont toujours plus petits et plus minces que les veines.
  5. Faire une suture autour de l'artère du foetus, mais ne pas l'attacher immédiatement. Tenir le récipient avec une pince, couper le navire soigneusement et mettre la petite canule (Ø 1,2 mm) dans l'artère. Puis attacher le fil de suture (deux nœuds).
  6. Procéder à la veine du fœtus de la même manière mais utiliser une plus grande canule (Ø 1,5-1,8 mm; aiguille émoussée doit être attaché à un ensemble de perfusion à aiguille à ailettes modifié).
  7. Mettez la pompe fœtale (2 ml / min). S'il n'y a pas de fuite visible et le sang émane de la canule dans la veine du fœtus, augmenter lentement le débit jusqu'à 4 ml / min. Observez la pression dans l'artère du fœtus, il ne devrait pas dépasser 70 mmHg. Si du liquide s'échappe au fœtus ou de matérne canule fixer avec un autre suture.
  8. Placer le placenta sur le support de tissu avec la partie foetale et tirer la membrane placentaire et le tissu sur les pointes. A la fin du cotylédon perfusé doit être au milieu du trou dans le support de tissu.
  9. Stabiliser la partie où seule la membrane détient le placenta avec une membrane de silicone (Ø 1 mm) ou bien deux morceaux de parafilm.
  10. Assemblez le support de tissu complet, serrer les vis et couper le tissu en surplomb. Veuillez noter que le veineux et artériel canules ne sont pas coincés mais pondent dans les petits canaux du support de tissu.
  11. Tourner le support de tissu à l'envers, la mettre dans la chambre d'irrigation et d'ajouter le couvercle. Maintenant, du côté maternel devrait être au top. Vérifiez toujours si le circuit du fœtus est encore intact et le milieu coule sur le tuyau de la veine du fœtus.
  12. Mettez la pompe maternelle (12 ml / min). Présentez les trois émoussé canules (Ø 0,8 mm) à ee extrémité du tube de l'artère maternel dans l'espace intervilleuse en pénétrant dans la plaque déciduale. Pour ramener le liquide de perfusion dans le circuit de la mère mis un tube comme vidange veineuse qui est également connecté à la pompe de la mère à la position la plus basse dans la partie supérieure de la chambre de perfusion.
  13. Branchez la canule dans la veine du fœtus au tube de veine fœtale.

3. L'exécution de la phase de pré-et expérimentale de perfusion

  1. Pour permettre au tissu de se remettre de la période ischémique après l'accouchement et à débusquer le sang dans l'espace intervillous, une pré-phase ouverte de 20 min est nécessaire. Cela signifie que la veine maternelle et fœtale ne sont pas menant vers le réservoir artériel contenant le milieu de perfusion. Recueillir le drainage veineux du fœtus et de la mère dans une bouteille et la jeter après la pré-phase.
  2. Pour évaluer l'intégrité de la perfusion effectuer un autre pré-phase de 20 min, mais dans un circuit fermé. Utilisez deux réservoirs séparés avec le milieu de perfusionpour le circuit du fœtus et de la mère et de fermer les circuits en menant le drainage veineux du fœtus retour dans le réservoir du fœtus et l'arrière de drainage veineux de la mère dans le réservoir maternelle.
  3. Pour l'expérience de perfusion principale préparer deux flacons de 120 ml de milieu de perfusion (une pour la mère et l'autre pour le réservoir foetal). Ajouter le radiolabeled 14 C-antipyrine (4 nCi / ml; sert de contrôle positif; ATTENTION: substance radioactive) et le xénobiotiques ou nanoparticules marqué par fluorescence que l'on veut analyser le réservoir maternelle. Mélanger la perfusion maternelle bien.
  4. Commencez l'expérience en échangeant le milieu de perfusion pur avec les deux flacons préparés (réservoirs du fœtus et de la mère). Fermez les circuits en menant le fœtus dos de drainage veineux dans le réservoir du fœtus et l'arrière de drainage veineux de la mère dans le réservoir maternelle.
  5. Poursuivre la perfusion de 6 heures et de prendre régulièrement des échantillons. Remettre en suspension toujours le moyen de la maternelle et fœtaleréservoir avant le retrait.
  6. Contrôler la pression dans l'artère fœtale (ne doit pas dépasser 70 mm Hg), le pH dans les deux circuits (qui devrait être dans une fourchette physiologique 7,2-7,4) et le volume de deux réservoirs (perte de volume du fœtus ne doit pas dépasser 4 ml / h) pendant la perfusion . Si nécessaire, ajuster le pH à l'aide soit de l'acide chlorhydrique ou de l'hydroxyde de sodium.
  7. Si la perte de volume dans le réservoir du foetus est supérieure à 4 ml / h il ya une fuite dans le tissu et on doit arrêter la perfusion. Le taux de succès d'une perfusion pendant 6 heures sans fuite est d'environ 15-20%.
  8. Arrêter la perfusion après 6 heures. Démouler les pompes, bain d'eau, chauffe-débit et des flux de gaz.
  9. Retirer le placenta de son support de tissu, coupez le cotylédon perfusé (plus lumineux que le tissu unperfused) et peser.
  10. Prélever des échantillons de unperfused (partie du placenta qui a été coupé au début, pourrait être déjà pris au cours de la phase de pré-) tissus et perfusé (chacun d'environ 1 g) et de les stocker à -20 ° Cjusqu'à ce que l'homogénéisation ou dans l'azote liquide pour analyse ultérieure. Fixer un autre échantillon de tissu à 4% de formol pour l'évaluation histopathologique. Les échantillons doivent inclure toutes les couches du placenta.
  11. Nettoyer les tubes après la perfusion d'un rinçage successif des systèmes artérielle du circuit foetal et maternel avec a) 200 ml d'eau distillée, b) de 50 ml d'hydroxyde de sodium à 1%, c) ml 1% d'acide 50 phosphorique et d) à nouveau 200 ml d'eau distillée (débit: 15-20 ml / min).

L'ensemble de la procédure de travail de l'expérience de perfusion placenta est représenté sur la figure 3.

4. L'analyse des échantillons

  1. Centrifuger les échantillons perfusât pendant 10 min à 800 xg avant analyse pour éliminer des érythrocytes résiduels. Prenez le surnageant pour l'analyse plus loin. Les échantillons peuvent être laissés toute la nuit à 4 ° C. Pour l'analyse de la production de leptine et l'hCG des échantillons peuvent être conservés à -20 ° C.
  2. Pour évaluer la perméabilité de laplacenta analyser le C-14 antipyrine par scintillation liquide. Mélanger 300 pi des échantillons fœtaux et maternels avec 3 ml cocktail de scintillation et mesure pendant 5 minutes dans un compteur bêta.
  3. Pour évaluer le transfert des nanoparticules fluorescentes ou des xénobiotiques d'intérêt lecture de la fluorescence à 485 nm d'excitation et 528 nm en émission d'un lecteur de microplaques (longueurs d'onde indiquées sont pour l'analyse de l'étiquette jaune vert que nous avons utilisé pour les nanoparticules).
  4. Pour déterminer la viabilité du tissu placentaire pendant la mesure de la perfusion de la consommation du glucose et de la production de lactate dans le circuit foetal et maternel avec un système de gaz de sang automatisé. En outre, évaluer la production des hormones placentaires choriongonadotropin humaine (hCG) et la leptine dans les échantillons de tissus homogénéisés et les perfusats par dosage immuno-enzymatique (ELISA).

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Representative Results

La figure 4A montre les profils de perfusion de petites particules de polystyrène (80 nm) qui ont été transportés à travers le placenta par rapport aux particules de polystyrène plus grand (500 nm) qui n'ont pas été transférés au compartiment fœtal. Chaque point de données représente la concentration moyenne des particules à l'instant donné d'au moins trois expériences indépendantes. Pour polystyrène nanoparticules le transfert placentaire est dépendant de la taille 19. Après 3 h de placenta perfusion déjà 20-30% des 80 particules de polystyrène nm initialement ajoutés ont été transférés de la maternelle au circuit du fœtus, tandis que les particules de polystyrène de 500 nm n'apparaissaient pas dans le circuit du fœtus, même après 6 heures de perfusion. Néanmoins, la concentration maternelle des particules de 500 nm est en baisse. Images de fluorescence sur coupe histologique du tissu après la perfusion ont montré que ces particules s'accumulent dans les villosités du placenta (données non présentées). Figure 4B 14 C-antipyrine. Antipyrine comme une petite molécule lipophile est répartie sur le placenta par diffusion passive et sert de contrôle pour l'intégrité des circuits. Après 4-6 h de perfusion un équilibre entre la concentration de antipyrine fœtale et maternelle devrait être construit 23. Pour évaluer et comparer le taux de transport placentaire des xénobiotiques le taux de concentration médicament fœtus à la mère (F / M) est généralement affiché (Figure 5).

Grâce à l'analyse de l'hormone lactate et placentaire (choriongonadotropin humaine et de la leptine), la production ainsi que la consommation de glucose sur la viabilité et la fonctionnalité du tissu placentaire au cours de la perfusion pourraient être surveillés (Figure 6). Les valeurs pour les perfusions avec des xénobiotiques doivent toujours être dans la même gamme que les valeurs de perfusion de contrôle sans xénobiotiques. En outre, histop évaluation athological du tissu placentaire perfusé peut être réalisée. Une comparaison avec le tissu placentaire non perfusée pourrait alors révéler des changements pathologiques dus à la perfusion (par exemple la contamination bactérienne) et donc pourrait servir un autre paramètre de contrôle de la qualité.

Des résultats représentatifs obtenus avec le modèle dual de perfusion ex vivo recirculation placenta humain ont été publiés récemment 11,19.

Figure 1
Figure 1. Ex vivo perfusion placentaire humaine set-up. 1) Bain d'eau avec des réservoirs maternels et fœtaux, 2) la chambre de perfusion, 3) piège à bulles, 4) colonnes de oxygénateur, et 5) chauffe-eau.

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Figure 2. Illustration schématique du modèle de la perfusion placentaire humain ex vivo FA: de l'artère du fœtus; FV:. Veine du fœtus; MA: artère maternelle; MV: veine maternelle; BT: piège à bulles; PS: capteur de pression

Figure 3
Figure 3. Procédure de travail d'une expérience de la perfusion placentaire humain ex vivo. Après l'accouchement, le placenta doit être une canule dans les 30 minutes. Avant l'heure la phase 6 expérimentale avec recirculation une pré-phase de pré-phase et ouvert fermé doit être effectué pendant au moins 20 minutes chacune.

Figure 4
Figure 4. profils de perfusion de particules de polystyrène et 14 </ Sup> C-antipyrine 19. Profil de perfusion de particules de polystyrène dans les dimensions 80 nm (n = 4) et 500 nm (n = 3). Initialement 25 pg / ml particules et 4.2 nCi / ml 14 C-antipyrine ont été ajoutés au circuit maternelle. La quantité de particules (A) et 14 C-antipyrine (B) ont été mesurées dans les circuits maternelle (M, les symboles pleins) et fœtale (F, symboles ouverts) après les moments indiqués. Affiché est la concentration moyenne ± SE. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 5
Figure 5. Dépendant de la taille de transfert de particules de polystyrène à travers le placenta humain 19. Les rapports entre les concentrations foetales et maternelles de 14 C-antipyrine et particules de polystyrène ont été calcmenté après 180 min de placenta perfusion. Les données représentent la moyenne ± SE d'au moins 3 expériences indépendantes. La colonne de commande représente perfusions sans particules, mais avec 14 C-antipyrine. (* P <0,05 par rapport à la valeur du rapport 80 nm).

Figure 6
Figure 6. La viabilité du tissu placentaire pendant la perfusion 19. (A) de la consommation de glucose et la production de lactate dans le placenta perfusé. Affichée est la somme des variations de la teneur totale dans les circuits (maternelle et fœtale) dans le temps divisé par le poids du cotylédon perfusé. (B) Production net normalisé (NP divisée par la teneur en tissu initial T0) des hormones placentaires choriongonadotropin humaine et la leptine. Les données représentent la moyenne ± SE au lest 3 expériences indépendantes.

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Discussion

Sous la perfusion double recirculation montré ici, il ya plusieurs autres configurations expérimentales possibles en fonction de la question à laquelle il faut répondre. Perfusions placentaires particulièrement ouverts sont couramment utilisés pour évaluer la clairance du médicament à concentration stationnaire 3. La perfusion de recirculation set-up peut être également appliqué à confirmer transport actif de substances endogènes ou exogènes. Par cette approche, la même concentration de xénobiotiques doit être ajouté à la maternelle et la circulation fœtale. En supposant qu'il n'y a transport actif contre le gradient de concentration, l'accumulation de la substance d'essai dans l'une des deux circuits peut être observée 24. Fait à noter, l'ajout de la substance d'essai uniquement au circuit du fœtus est également possible et peut révéler le mécanisme de transport à travers la barrière placentaire de cette substance particulière 25.

Le protocole a évolué au fil time et peut varier entre les différents groupes de recherche en particulier concernant le débit, la composition du milieu de perfusion, la forme de l'oxygénation et le chauffage à 26,27. En particulier, le débit peut influer sur l'heure à laquelle le transfert transplacentaire se produit. Pour contrôler cela, l'ajout d'un composé de référence transportés passivement comme antipyrine est important. La vitesse de transfert du xénobiotique peut être toujours par rapport à la vitesse de transfert de l'antipyrine (rapport F / M doit être supérieure à 0,75) 26. Etant donné que le transfert antipyrine est principalement limitée par le débit et la surface d'échange, ce comparateur prend les différences dans l'écoulement et de la taille du cotylédon perfusé en compte qui peut varier entre les expériences. En outre, FITC-dextran pourrait être ajoutée au circuit du fœtus pour servir de contrôle de l'intégrité de la barrière 26. Une perte de volume foetal est également utilisée comme marqueur pour l'intégrité de la barrière. Habituellement, une perte fœtale de fluide jusqu'à 4 ml / h est autorisée 28, mais l're a pas de limite généralement acceptée.

Évidemment, il ya quelques inconvénients de la méthode ex vivo de la perfusion placentaire humaine comme les variations inter-individuelles et un faible taux de réussite (15-20%). En outre, une période de perfusion de 6 heures ne peut pas simuler un traitement de la toxicomanie chronique et ne peut donc pas exclure complètement le transfert d'un xénobiotique après une exposition à long terme. Une autre limitation de ce modèle est que principalement le transfert transplacentaire à terme est évaluée tandis que le taux de transport à des âges gestationnels précoces lorsque la barrière est plus épaisse reste encore inconnue. En effet, la perfusion du premier trimestre de placenta est possible, mais la disponibilité de ces placentas est plutôt limitée. Néanmoins, jusqu'à présent, la méthode de perfusion placentaire ex vivo est le seul modèle pour étudier le transport de divers xénobiotiques ou des nanoparticules dans le tissu placentaire humaine organisée. Alors que toxicodynamique dans le modèle de perfusion humain ex vivo peuvent être analysés seulement dans le pltissus acental, l'expérimentation animale peuvent en effet fournir également des informations sur l'embryotoxicité. Bien que, en raison des différences anatomiques de la barrière placentaire entre les humains et les rongeurs ces résultats ne peuvent être extrapolés à l'homme 4,5. Une autre possibilité pour enquêter sur le transfert transplacentaire peut être des modèles de culture cellulaire comme cytotrophoblastes primaires, des lignées cellulaires de choriocarcinome, isolés des vésicules de la membrane plasmique ou explants de tissus placentaires 29. Le modèle le plus utilisé est la lignée cellulaire BeWo; ces cellules sont dérivées d'un choriocarcinome gestationnel maligne et peuvent former une monocouche confluente sur une membrane perméable, de sorte que les études de transport peut être effectué. Les résultats des études de transport utilisant le modèle cellulaire BeWo sont bien corrélés avec les résultats obtenus dans l'ex vivo perfusion placentaire humaine 30. Cependant, pour étudier les détails de transport de la drogue (par exemple, la contribution d'une protéine de transport spécifique) et le métabolisme, le modèle de cellule BeWo peut être mminerai possible principalement parce qu'il est plus facile à manipuler et susceptibles d'être manipulés comme expression des transporteurs ou des enzymes génétiquement modifiées, mais en ce qui concerne les études générales de transfert de la drogue de la fiabilité de ce modèle est limité. Il manque le flux sanguin et l'intégrité de la monocouche doit être évaluée avec soin, car il dépend de plusieurs facteurs tels que les conditions de culture de cellules, la densité d'ensemencement, la durée d'exposition et la membrane insert 6,29.

Différents xénobiotiques et des nanoparticules également se lier à diverses protéines plasmatiques qui peuvent influencer de manière significative le transfert transplacentaire 31; compte tenu de la liaison aux protéines plasmatiques est donc important. Le milieu de perfusion contient du sérum-albumine bovine, la protéine de plasma les plus fréquents. Récemment, une étude a montré que les taux de transfert de diverses substances obtenues avec le modèle de la perfusion placentaire humain ex vivo sont bien corrélés avec le sang de cordon dans vivo à la santé maternelleles ratios de concentration dans le sang lorsque les ratios de transfert ont été ajustés en fonction de l'ampleur de la protéine 12 de liaison plasma.

Globalement, le modèle de la perfusion placentaire ex vivo est une méthode valide et fiable pour étudier le transport à travers le placenta humain et de prédire l'in vivo passage transplacentaire des xénobiotiques et des nanoparticules.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgements

Ce travail est soutenu financièrement par la Fondation nationale suisse (PNR 64 programme, accorder aucune 4064-131232).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NCTC-135 medium ICN Biomedicals, Inc. 10-911-22C could be replaced by Medium 199 from Sigma (M3769)
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich, Fluka 71381
Potassium chloride (KCl) Hospital pharmacy also possible: Sigma (P9541)
Monosodium phosphate (NaH2PO4 · H2O) Merck 106346
Magnesium sulfate (MgSO4 · H2O) Sigma-Aldrich, Fluka 63139
Calcium chloride (CaCl, anhydrous) Merck 102388
D(+) Glucose (anhydrous) Sigma-Aldrich, Fluka 49138
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Merck 106329
Dextran from Leuconostoc spp. Sigma-Aldrich 31389
Bovine serum albumin (BSA) Applichem A1391
Amoxicilline (Clamoxyl) GlaxoSmithKline AG 2021101A
Sodium heparin B. Braun Medical AG 3511014
Sodium hydoxide (NaOH) pellets Merck 106498 CAUTION: corrosive
Ortho-phosphoric acid 85% (H3PO4) Merck 100573 CAUTION: corrosive
Maternal gas mixture: 95% synthetic air, 5% CO2 PanGas AG
Fetal gas mixture: 95% N2, 5% CO2 PanGas AG
Antipyrine (N-methyl-14C) American Radiolabeled Chemicals, Inc. ARC 0108-50 μCi CAUTION: radioactive material (specific activity: 55mCi/mmol)
Scintillation cocktail (IrgaSafe Plus) Zinsser Analytic GmbH 1003100
Polystyrene particles 80 nm Polyscience, Inc. 17150
Polystyrene particles 500 nm Polyscience, Inc. 17152
EQUIPMENT
Water bath VWR 462-7001
Thermostat IKA-Werke GmbH Co. KG 3164000
Peristaltic pumps Ismatec ISM 833
Bubble traps (glass) UNI-GLAS Laborbedarf
Flow heater UNI-GLAS Laborbedarf
Pressure sensor + Software for analyses MSR Electronics GmbH 145B5
Notebook Hewlett Packard
Miniature gas exchange oxygenator Living Systems Instrumentation LSI-OXR
Tygon Tube (ID: 1.6 mm; OD: 4.8 mm) Ismatec MF0028
Tubes for pumps (PharMed BPT; ID: 1.52 mm) Ismatec SC0744
Blunt cannulae ( 0.8 mm) Polymed Medical Center 03.592.81
Blunt cannulae ( 1.2 mm) Polymed Medical Center 03.592.90
Blunt cannulae ( 1.5 mm) Polymed Medical Center 03.592.94
Blunt cannulae ( 1.8 mm) Polymed Medical Center 03.952.82
Parafilm VWR 291-1212
Perfusion chamber with tissue holder (plexiglass) Internal technical department Similar equipment is available from Hemotek Limited, UK
Surgical suture material (PremiCron) B. Braun Medical AG C0026005
Winged Needle Infusion Set (21G Butterfly) Hospira, Inc. ASN 2102
Multidirectional stopcock (Discofix C-3) B. Braun Medical AG 16494C
Surgical scissors B. Braun Medical AG BC304R
Dissecting scissors B. Braun Medical AG BC162R
Needle holder B. Braun Medical AG BM200R
Dissecting forceps B. Braun Medical AG BD215R
Automated blood gas system Radiometer Medical ApS ABL800 FLEX
Multi-mode microplate reader BioTek Synergy HT
Liquid scintillation analyzer GMI, Inc. Packard Tri-Carb 2200
Scintillation tubes 5.5 ml Zinsser Analytic GmbH 3020001
Tissue Homogenizer OMNI, Inc. TH-220
pH meter + electrode VWR 662-2779

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References

  1. Ala-Kokko, T. I., Myllynen, P., Vahakangas, K. Ex vivo perfusion of the human placental cotyledon: implications for anesthetic pharmacology. Int. J. Obstet. Anesth. 9, 26-38 (2000).
  2. Panigel, M., Pascaud, M., Brun, J. L. Radioangiographic study of circulation in the villi and intervillous space of isolated human placental cotyledon kept viable by perfusion. J. Physiol. (Paris). 59, 277 (1967).
  3. Schneider, H., Panigel, M., Dancis, J. Transfer across the perfused human placenta of antipyrine, sodium and leucine. Am. J. Obstet. Gynecol. 114, 822-828 (1972).
  4. Enders, A. C., Blankenship, T. N. Comparative placental structure. Adv. Drug Deliv. Rev. 38, 3-15 (1999).
  5. Takata, K., Hirano, H. Mechanism of glucose transport across the human and rat placental barrier: a review. Microsc. Res. Tech. 38, 145-152 (1997).
  6. Saunders, M. Transplacental transport of nanomaterials. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 1, 671-684 (2009).
  7. Buerki-Thurnherr, T., von Mandach, U., Wick, P. Knocking at the door of the unborn child: engineered nanoparticles at the human placental barrier. Swiss Med. Wkly. 142, w13559 (2012).
  8. Gendron, M. P., Martin, B., Oraichi, D., Berard, A. Health care providers' requests to Teratogen Information Services on medication use during pregnancy and lactation. Eur. J. Clin. Pharmacol. 65, 523-531 (2009).
  9. Burns, L., Mattick, R. P., Lim, K., Wallace, C. Methadone in pregnancy: treatment retention and neonatal outcomes. Addiction. 102, 264-270 (2007).
  10. von Mandach, U. Drug use in pregnancy. Ther. Umsch. 62, 29-35 (2005).
  11. Malek, A., Obrist, C., Wenzinger, S., von Mandach, U. The impact of cocaine and heroin on the placental transfer of methadone. Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 61 (2009).
  12. Hutson, J. R., Garcia-Bournissen, F., Davis, A., Koren, G. The human placental perfusion model: a systematic review and development of a model to predict in vivo transfer of therapeutic drugs. Clin. Pharmacol. Ther. 90, 67-76 (2011).
  13. International Organization for Standardization (ISO). Technical Specification (ISO/TS) 27687. Nanotechnologies – Terminology and definitions for nano-objects – Nanoparticles, nanofibre and nanoplate. (2008).
  14. Pietroiusti, A. Health implications of engineered nanomaterials. Nanoscale. 4, 1231-1247 (2012).
  15. Latzin, P., Roosli, M., Huss, A., Kuehni, C. E., Frey, U. Air pollution during pregnancy and lung function in newborns: a birth cohort study. Eur. Respir. J. 33, 594-603 (2009).
  16. Lacasana, M., Esplugues, A., Ballester, F. Exposure to ambient air pollution and prenatal and early childhood health effects. Eur. J. Epidemiol. 20, 183-199 (2005).
  17. Menezes, V., Malek, A., Keelan, J. A. Nanoparticulate drug delivery in pregnancy: placental passage and fetal exposure. Curr. Pharm. Biotechnol. 12, 731-742 (2011).
  18. Muhlemann, K., Menegus, M. A., Miller, R. K. Cytomegalovirus in the perfused human term placenta in vitro. Placenta. 16, 367-373 (1995).
  19. Wick, P., et al. Barrier capacity of human placenta for nanosized materials. Environ. Health Perspect. 118, 432-436 (2010).
  20. Dancis, J. Why perfuse the human placenta. Contrib Gynecol. Obstet. 13, 1-4 (1985).
  21. May, K., et al. Perfusion of human placenta with hemoglobin introduces preeclampsia-like injuries that are prevented by alpha1-microglobulin. Placenta. 32, 323-332 (2011).
  22. Guller, S., et al. Protein composition of microparticles shed from human placenta during placental perfusion: Potential role in angiogenesis and fibrinolysis in preeclampsia. Placenta. 32, 63-69 (2011).
  23. Challier, J. C. Criteria for evaluating perfusion experiments and presentation of results. Contrib. Gynecol. Obstet. 13, 32-39 (1985).
  24. Kraemer, J., Klein, J., Lubetsky, A., Koren, G. Perfusion studies of glyburide transfer across the human placenta: implications for fetal safety. Am. J. Obstet. Gynecol. 195, 270-274 (2006).
  25. leal, J. K., et al. Modification of fetal plasma amino acid composition by placental amino acid exchangers in vitro. J. Physiol. 582, 871-882 (2007).
  26. athiesen, L., et al. Quality assessment of a placental perfusion protocol. Reprod. Toxicol. 30, 138-146 (2010).
  27. Myllynen, P., et al. Preliminary interlaboratory comparison of the ex vivo dual human placental perfusion system. Reprod Toxicol. 30, 94-102 (2010).
  28. Malek, A., Sager, R., Schneider, H. Maternal-fetal transport of immunoglobulin G and its subclasses during the third trimester of human pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 32, 8-14 (1994).
  29. Prouillac, C., Lecoeur, S. The role of the placenta in fetal exposure to xenobiotics: importance of membrane transporters and human models for transfer studies. Drug Metab. Dispos. 38, 1623-1635 (2010).
  30. Poulsen, M. S., Rytting, E., Mose, T., Knudsen, L. E. Modeling placental transport: correlation of in vitro BeWo cell permeability and ex vivo human placental perfusion. Toxicol. In Vitro. 23, 1380-1386 (2009).
  31. Mathiesen, L., Rytting, E., Mose, T., Knudsen, L. E. Transport of benzo[alpha]pyrene in the dually perfused human placenta perfusion model: effect of albumin in the perfusion medium. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 105, 181-187 (2009).

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