Fastställande av transport Andel Xenobiotika och nanomaterial igenom moderkakan med
1Department of Obstetrics, Perinatal Pharmacology, University Hospital Zurich, 2Laboratory for Materials - Biology Interactions, EMPA Swiss Federal Laboratories for Materials Testing and Research, 3Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Den

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Grafmüller, S., Manser, P., Krug, H. F., Wick, P., von Mandach, U. Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model. J. Vis. Exp. (76), e50401, doi:10.3791/50401 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Decennier sedan den mänskliga moderkakan var tänkt att vara en ogenomtränglig barriär mellan mor och ofödda barn. Visade sig dock upptäckten av talidomid-inducerad fosterskador och många senare studier efteråt motsatsen. Idag flera skadliga xenobiotika som nikotin, var heroin, metadon eller narkotika samt miljöföroreningar beskrivs att övervinna detta hinder. Med den ökande användningen av nanoteknik, är moderkakan kan komma i kontakt med nya nanopartiklar antingen av misstag genom exponering eller avsiktligt i händelse av tänkbara nanomedical applikationer. Data från djurförsök inte kan extrapoleras till människor eftersom moderkakan är den mest artspecifik däggdjursorgan 1. Därför ex vivo dubbla återcirkulerande mänsklig placentaperfusionen, utvecklad av Panigel et al. 1967 2 och kontinuerligt uppdaterad av Schneider et al. 1972 3, kan fungera som en utmärkt modell to studera överföringen av xenobiotika eller partiklar.

Här fokuserar vi på ex vivo dubbla recirkulerande human placentaperfusionen protokoll och dess fortsatta utveckling att skaffa reproducerbara resultat.

Den placentae erhölls efter informerat samtycke av mödrarna från okomplicerade sikt graviditeter genomgår kejsarsnitt. De foster eller moder fartyg med en intakt kotyledon kanylerades och perfuserades minst fem timmar. Som modell partikel fluorescensmärkta polystyrenpartiklar med storlekar av 80 och 500 nm i diameter sattes till maternal kretsen. De 80 nm partiklar kunde passera placentabarriären och ger ett perfekt exempel på ett ämne som överförs via placenta till fostret medan 500 nm partiklar behölls i moderkakan vävnad eller moderns krets. Den ex vivo human placentaperfusionen modell är en av få modeller som ger tillförlitlig information omtransport beteende xenobiotika vid en viktig vävnadsbarriär som levererar prediktiva och klinisk relevanta uppgifter.

Introduction

Moderkakan är ett komplext organ som ansvarar för utbyte av syre, koldioxid, näringsämnen och avfallsprodukter och samtidigt kunna hålla de två blodkretsar av mamman och det växande fostret separerade från varandra. Dessutom förhindrar det avvisande av barnet från moderns immunsystem och utsöndrar hormoner för att bibehålla graviditeten. Det cellulära barriären bildas av cytotrofoblastceller som smälter och bildar en sann syncytium utan laterala cellmembran 4,5. Hela moderkakan är organiserad i flera hjärtblad, som innehåller ett foster villös träd och utgör en funktionell enhet av moderkakan.

Studiet av placentabarriären funktionen intensifierades med upptäckten av de inducerade talidomid missbildningar på 1960-talet. Av uppenbara skäl translokation studier med gravida kvinnor inte kan utföras. Följaktligen har olika alternativa modeller utvecklats 6,7 ex vivo human placentaperfusionen modell som utvecklats av Panigel och medarbetare 2,3.

Många kvinnor utsätts för olika xenobiotika såsom läkemedel eller miljögifter under graviditeten 8. För vissa läkemedel som redan administreras regelbundet under graviditeten, kan in vivo-studier utförs genom jämförelse med moderns blod koncentration med att i navelsträngsblod. Men generellt finns endast begränsad information om farmakokinetik och-dynamik hos foster och teratogenicitet av dessa ämnen.

Till exempel opiater som heroin lätt passerar placentabarriären och kan leda till intrauterin tillväxthämning, prematur förlossning eller missfall 9,10. Så, om utebliven avhållsamhet under graviditeten en substitutionsbehandling med metadon rekommenderas. The exvivo human placentaperfusionen modell visade att överföringen av metadon i fostrets cirkulation är försumbar 11, som korrelerar väl med den beräknade navelsträngsblod till moderns blodkoncentration tal efter leverans 12.

Nanoteknik är ett växande område särskilt inom medicinen. Så, under den naturligt förekommande fina (<2,5 mikrometer i diameter) och ultrafina partiklar (<0,1 mikrometer i diameter) i rökgaser från skogsbränder, vulkanutbrott och i öknen damm, exponering för konstruerade nanomaterial (minst en dimension <0.1 um 13 ) ökar. Detta väckte frågor om den toxikologiska konstruerade nanomaterial. Även om ingen mänsklig fara kan bevisas ännu, det finns huvudsakliga experimentella studier som indikerar att nanopartiklar kan orsaka negativa biologiska reaktioner som leder till toxikologiska resultat 14. Nyligen visade några studier som prenatal exponering förluftföroreningar är kopplat till en högre respiratorisk nöd och luftvägsinflammation hos nyfödda och barn 15,16. Dessutom kan små nanopartiklar kan användas som läkemedelsbärare för att specifikt behandla antingen fostret eller mamman. Därför blir det uppenbart att omfattande studier av olika xenobiotika eller nanomaterial och deras förmåga att passera placentabarriären krävs. En verklig översikt på aktuella studier om moderkakan permeabilitet för konstruerade nanomaterial sammanfattas i Menezes et al.. 2011 17 och Buerki-Thurnherr et al 2012 7.

Den ex vivo dubbla recirkulerande human placentaperfusionen modellen ger ett kontrollerat och tillförlitligt system för att studera placenta transport av olika endogena och exogena föreningar 3,11,12,18,19 och ett brett utbud av andra funktioner hos moderkakan som mekanismer som ansvarar för utveckling av patologiska tillstånd som havandeskapsförgiftning <sup> 20-22. I detta protokoll fokuserar vi främst på upplägg, hantering och metod som tillåter studier av ackumulation, effekter och priser translokation av en bred uppsättning av xenobiotika eller nanopartiklar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ett. Förberedelse perfusionssystemet

  1. Konfigurera perfusionssystemet består av ett vattenbad, en perfusionskammare, två kolumner för syresättning, två peristaltiska pumpar, två bubbelfällor, två flöden värmare och en trycksensor (Figur 1). Anslut dessa komponenter med slangar sektioner som består av silikon och polyvinylklorid material enligt schemat i figur 2. Slutligen finns det två kretsar representerar foster och moderns krets, respektive.
  2. Slå på vattenbadet, värmarna flöde och upphettningen för perfusionskammaren. Temperaturen bör vara 37 ° C.
  3. Värm upp perfusionsmediet (NCTC-135 vävnadsodlingsmedium utspädd 1:2 med Earles buffert (6,8 g / L natriumklorid, 0,4 g / L kaliumklorid, 0,14 g / L mononatriumfosfat, 0,2 g / L magnesiumsulfat, 0,2 g / L kalciumklorid, 2 g / L glukos) kompletterad med glukos (1 g / L), dextran 40 (10 g / L), bovint serumalbumin (10 g/ L), natrium heparin (2500 IE / L), amoxicillin (250 mg / L) och natriumbikarbonat (2,2 g / L), pH 7,4) i vattenbadet.
  4. Följd skölj arteriella system fostrets och moderns krets med a) 200 ml destillerat vatten, b) 50 ml 1% natriumhydroxid, c) 1% fosforsyra och d) igen 200 ml destillerat vatten (flöde: 15 - 20 ml / min).
  5. Anslut fetal kanylen (Ø 1,2 mm, trubbig nål bör knytas till en modifierad bevingad nål infusionsset) till fostrets arteriella slangen.
  6. Skölj de arteriella system fostrets och moderns krets med perfusionsmediet tills alla rör innehåller medium (flödeshastighet: 15-20 ml / min). Under detta steg fylla upp de bubbelfällor och ta bort alla bubblor nedströms fällan. Sedan stoppa pumpar. Det är verkligen viktigt att de afferenta arteriella rören är alltid gratis bubblor, annars efter kanyleringen speciellt de fina fetala kärl kan spricka.
  7. Slå på gasflödet. Den maternal kretsen är syresatt with 5% koldioxid och 95% syntetisk luft och fostrets krets med 5% koldioxid och 95% kväve.
  8. Starta inspelningen av tryckgivare.

2. Kanylering av Placenta

  1. Skaffa intakt placentae från okomplicerad sikt graviditeter efter primär kejsarsnitt. Skriftligt samtycke måste ges (erhölls i fallet med våra studier) av mödrarna före leverans och studien måste godkännas av den lokala etiska kommittén (var fallet i våra studier). Första visuell kontroll bör göras av barnmorskor för att säkerställa en frisk och intakt moderkakan.
  2. Kanylering av moderkakan är ett kritiskt steg! Under perfusion varje liten störning i vävnaden kan leda till en läcka mellan moder och foster cirkulation. Moderkakan måste erhållas inom 30 min efter leverans.
  3. Välj en intakt kotyledon vid marginella zon av moderkakan utan synliga störningar på mödernet. Vid chorionic plattan,binda upp båda tillhörande grenar av navelsträngen artär och ven uppströms till den senare kanyleringen sida (mot navelsträngen) genom att använda kirurgiska suturmaterial. Gör alltid två knop.
  4. Kanylera fostrets artären först. De fetala placental artärer är alltid mindre och tunnare än venerna.
  5. Gör en sutur runt fostrets artären, men bind inte upp omedelbart. Håll kärlet med en pincett, skära kärlet försiktigt och lägg den lilla kanylen (Ø 1,2 mm) i artären. Sedan knyta upp suturen (två knop).
  6. Fortsätt med fostrets ven på samma sätt men använder en större kanyl (Ø 1,5-1,8 mm, trubbig nål bör knytas till en modifierad bevingad nål infusionsset).
  7. Slå på fostrets pumpen (2 ml / min). Om det inte finns någon synlig läcka och blod utgår ur fostrets ven kanylen, långsamt öka flödet upp till 4 ml / min. Observera att trycket i fostrets artären, bör den inte överstiga 70 mmHg. Om vätska läcker ut på foster eller matternal kanyl fäst dem med en annan sutur.
  8. Placera moderkakan på vävnad innehavaren med fostrets uppåt och dra moderkakan membranet och vävnaden över spikarna. Till slut den perfunderade cotyledon bör vara i mitten av hålet i vävnaden hållaren.
  9. Stabilisera den del där endast membranet håller moderkakan med en silikon membran (Ø 1 mm) eller alternativt två stycken Parafilm.
  10. Montera den kompletta vävnad innehavaren, dra åt skruvarna och skär den överhängande vävnaden. Observera att det venösa och arteriella kanyler inte är klämda men i stället låg i de små kanalerna i den vävnad innehavaren.
  11. Vänd vävnad innehavaren upp och ner, lägg den i perfusionskammaren och lägg locket. Nu ska mödernet vara på topp. Kontrollera alltid om fostrets kretsen är fortfarande intakt och mediet flödar ut ur fostrets ven slangen.
  12. Slå på maternal pumpen (12 ml / min). Presentera tre trubbiga kanyler (Ø 0,8 mm) på the slutet av moderns artär röret i intervillous utrymmet genom att tränga in i decidual plattan. För att återgå perfusatet till moderns kretsen sätta ett rör såsom venös avloppet, och som också är förbunden med maternal pumpen till den lägsta positionen i den övre delen av perfusionskammaren.
  13. Anslut fostrets ven kanyl till fostrets ven röret.

Tre. Exekvera Pre-och experimentell fas av perfusion

  1. För att göra det möjligt för vävnad att återhämta sig från den ischemiska perioden efter leverans och för att spola ut blodet i intervillous utrymmet, är en öppen för-fas av 20 minuter nödvändig. Det innebär att moder och foster ven inte leder tillbaka till den arteriella reservoaren innehåller perfusionsmediet. Samla fostrets och moderns venösa utflödet i en flaska och kasta det efter pre-fasen.
  2. För att bedöma integriteten av perfusionen utföra en annan pre-fas av 20 min men i en sluten krets. Använd två separata reservoarer med perfusionsmedietför fostrets och moderns krets och stänga kretsarna genom att leda fostrets venösa utflödet tillbaka i fosterställning reservoaren och moderns venösa utflödet tillbaka i moderns reservoaren.
  3. För den viktigaste perfusion experimentet förbereda två flaskor med 120 ml perfusionsmediet (en för mödra-och en för fostrets reservoaren). Lägg den radiomärkta 14 C-antipyrin (4 nCi / ml, tjänar som positiv kontroll, FÖRSIKTIGHET: radioaktivt ämne) och fluorescerande xenobiotikum eller nanopartiklar som man vill analysera till moderns reservoaren. Blanda moderns perfusat väl.
  4. Starta experimentet genom att utbyta den rena perfusionsmediet med de två förberedda kolvar (foster eller moder reservoarer). Stäng kretsarna genom att leda fostrets rygg venösa utflödet i fostrets reservoaren och moderns venösa utflödet tillbaka i moderns reservoaren.
  5. Fortsätt perfusion under 6 timmar och ta prover regelbundet. Alltid resuspendera mediet i fosterställning och modernsreservoar innan uttag.
  6. Kontrollera trycket i fostrets artären (bör inte överstiga 70 mmHg), pH i båda kretsarna (bör vara i ett fysiologiskt intervall 7,2-7,4) och volymen av både reservoarer (fetal volym förlust bör inte överstiga 4 ml / timme) under perfusion . Om det behövs justera pH-värden med antingen saltsyra eller natriumhydroxid.
  7. Om volymen förlusten i fostrets reservoaren överstiger 4 ml / h det finns en läcka i vävnaden och man måste stoppa perfusion. Framgången för en perfusion under 6 timmar utan läckage är ca 15-20%.
  8. Stoppa perfusion efter 6 tim. Vänd ut pumpar, vattenbad, värmare flöde och gasflöde.
  9. Avlägsna moderkakan från vävnad innehavaren, klippa perfunderade hjärtbladsnod (ljusare än unperfused vävnaden) och väg den.
  10. Ta prov från unperfused (del av moderkakan som skars i början, kunde redan under den pre-fas) och perfusion vävnad (vardera ca 1 g) och förvara dem vid -20 ° Ctills homogenisering eller i flytande kväve för senare analys. Fixa ett annat vävnadsprov i 4% formalin för histopatologisk utvärdering. Proverna ska omfatta alla skikt i moderkakan.
  11. Rengör rör efter perfusion genom att successivt skölja arteriella system av den fetala och maternal krets med a) 200 ml destillerat vatten, b) 50 ml 1% natriumhydroxid, c) 50 ml 1% fosforsyra och d) igen 200 ml destillerat vatten (flöde: 15-20 ml / min).

Hela arbetsgången av moderkakan perfusion experimentet visas i figur 3.

4. Analysera prover

  1. Centrifugera perfusatet prover för 10 min vid 800 xg före analys för att avlägsna kvarvarande erytrocyter. Ta supernatanten för ytterligare analys. Proverna kan lämnas över natten vid 4 ° C. För analys av leptin och hCG produktionen proverna kan förvaras vid -20 ° C.
  2. För att utvärdera permeabiliteten hosmoderkakan analysera 14 C-antipyrin genom vätskescintillation. Blanda 300 mikroliter av foster eller moder prov med 3 ml scintillationscocktail och åtgärd i 5 minuter i en beta-räknare.
  3. För att bedöma överföringen av de fluorescerande nanopartiklar eller xenobiotiskt av intresse läsa fluorescens vid 485 nm excitation och 528 nm emission i en mikroplattläsare (angivna våglängderna för analys av den gula grön etikett som vi använde för nanopartiklar).
  4. För att bestämma livskraft placentavävnaden under perfusionen mäta glukos konsumtion och laktat produktionen i fostrets och moderns krets med ett automatiserat blod gassystemet. Dessutom utvärdera produktionen av den placental hormoner humant choriongonadotropin (hCG) och leptin i homogeniserade vävnadsproverna och perfusates genom enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 4A visar perfusion profiler av små polystyrenpartiklar (80 nm) som transporterades via placenta jämfört med större polystyrenpartiklar (500 nm), som inte överfördes till fostrets facket. Varje datapunkt representerar den genomsnittliga partikelkoncentrationen till den givna tidpunkt av minst tre oberoende experiment. För polystyren nanopartiklar placentapassage är storleksberoende 19. Efter 3 tim i moderkakan perfusion redan 20-30% av de ursprungligen sattes 80 partiklar nm polystyren överfördes från moderns till fostrets kretsen, medan 500 nm polystyrenpartiklarna inte förekommer i fostrets kretsen även efter 6 h av perfusion. Icke desto mindre är maternal koncentrationen av de 500 nm partiklar minskar. Fluorescence bilder på histologisk sektion av vävnaden efter perfusionen visade att dessa partiklar ackumuleras i villi i placenta (data ej visade). Figur 4B 14 C-antipyrin. Antipyrin som en liten lipofil molekyl fördelas över placentabarriären via passiv diffusion och fungerar som kontroll för integriteten i kretsarna. Efter 4-6 h av perfusion en jämvikt mellan fostrets och moderns antipyrin koncentration bör byggas 23. För att bedöma och jämföra placenta transport hastighet av xenobiotika fostrets till moderns läkemedelskoncentration (F / M) Förhållandet brukar visas (Figur 5).

Genom analys av laktat och placenta hormon (human choriongonadotropin och leptin) produktion samt glukos förbrukning livskraft och funktionalitet placentavävnaden under perfusionen kunde övervakas (Figur 6). Värdena för de perfusioner med xenobiotic bör alltid vara i samma intervall som värdena från kontroll perfusion utan xenobiotic. Dessutom histop athological utvärdering av perfuserade placentavävnad kunde utföras. En jämförelse med icke-perfuserad placentavävnad kunde då avslöja patologiska förändringar på grund av perfusion (t.ex. bakteriell kontamination), och därför kunde tjäna som en annan kvalitetskontroll parameter.

Ytterligare representativa resultat som erhållits med ex vivo dubbla återcirkulerande human placentaperfusionen modell publicerades nyligen 11,19.

Figur 1
Figur 1. Ex vivo human placentaperfusionen set-up. 1) Vattenbad med modern och fostret reservoarer, 2) perfusionskammare, 3) bubbelfångaren, 4) kolonner oxygenatorn, och 5) flöde värmare.

load/50401/50401fig2.jpg "/>
Figur 2. Schematisk illustration av ex vivo human placentaperfusionen modell FA: fetal artär, FV:. Fetal vein, MA: moderns artär, MV: moderns vein, BT: bubbelfälla, PS: tryckgivare

Figur 3
Figur 3. Arbetssätt i en ex vivo human placentaperfusionen experiment. Efter leverans moderkakan måste kanyl inom 30 minuter. Före 6 hr experimentella fas med recirkulation en öppen för-fas och slutna före fas bör utföras i minst 20 minuter vardera.

Figur 4
Figur 4. Perfusion profiler av polystyren partiklar och 14 </ Sup> C-antipyrin 19. Perfusion profil av polystyrenpartiklar i storlekarna 80 nm (n = 4) och 500 nm (n = 3). Initialt 25 | ig / ml partiklar och 4,2 nCi / ml 14 C-antipyrin sattes till maternal kretsen. Mängden av partiklar (A) och 14 C-antipyrin (B) mättes i moderns (M, fyllda symboler) och fetalt (F, ofyllda symboler) kretsar efter de indikerade tidpunkterna. Visas är medelkoncentrationen ± SE. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 5
Figur 5. Storlek-beroende överföring av polystyrenpartiklar över placenta hos människa 19. Förhållandena mellan foster och moder koncentrationer av 14 C-antipyrin och polystyren partiklar var calculated efter 180 min av placenta perfusion. Data representerar medelvärdet ± SE av åtminstone tre oberoende experiment. Styrkolumnen skildrar perfusioner utan partiklar men med 14 C-antipyrin. (* P <0,05 jämfört med 80 nm kvotvärde).

Figur 6
Figur 6. Livskraft placentavävnaden under perfusionen 19. (A) Glukos konsumtion och laktat produktionen i perfunderade moderkakan. Visas är summan av förändringar i den totala innehållet i de kretsarna (fetal och maternell) över tiden dividerat med vikten av den genomströmmade hjärtbladsnod. (B) Normaliserad nettoproduktion (NP dividerat med initial vävnadshalt T0) i moderkakan hormoner mänsklig choriongonadotropin och leptin. Data representerar medelvärdet ± SE för vid löster tre oberoende experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Under den dubbla recirkulerande perfusion visade här, det finns flera andra experimentella konfigurationer möjliga beroende på den fråga som måste besvaras. Särskilt öppen moderkakan perfusioner används ofta för att bedöma läkemedlets clearance vid steady-state koncentration 3. Den recirkulerande perfusion set-up kan också användas för att bekräfta aktiv transport av endogena eller exogena ämnen. För denna metod samma koncentration av xenobiotikum måste läggas till moderns och fostrets cirkulation. Antas att det finns aktiv transport mot koncentrationsgradienten, kan ackumulering av testämnet i endera av de båda kretsarna observeras 24. Av notera, är tillsatsen av testämnet endast till fostrets kretsen också möjlig och kan avslöja mekanismen för transport över placentabarriären av detta ämne 25.

Protokollet har utvecklats under time och kan variera mellan olika forskargrupper, särskilt angående flödet, sammansättning perfusionsmediet, form av syresättning och värme 26,27. Speciellt flödeshastigheten kan påverka den tid vid vilken transplacental överföring sker. För att kontrollera detta, är tillägget av ett passivt transporteras referens förening som antipyrin viktigt. Överföringshastigheten de xenobiotiska kan alltid jämfört med överföringshastighet på antipyrin (F / M-förhållandet bör vara över 0,75) 26. Eftersom antipyrin överföringen begränsas huvudsakligen av flödet och utbytet yta, tar denna jämförelse skillnader i flödet och storleken på den genomströmmade hjärtbladsnod hänsyn som kan variera mellan experimenten. Dessutom skulle FITC-dextran tillsättas till fostrets kretsen för att fungera som kontroll för den skada på barriären 26. Fetalt volymförlust används också som markör för barriären integritet. Vanligtvis ett fetalt vätskeförlust upp till 4 ml / h är tillåtet 28, men denre finns ingen allmänt accepterad gräns.

Uppenbarligen finns det vissa nackdelar med ex vivo human placentaperfusionen metod som inter-individuella variationer och en låg framgång (15-20%). Dessutom kan en perfusion period av 6 tim simulera inte en kronisk läkemedelsbehandling och kan därför inte helt utesluta överföring av en xenobiotiskt efter långvarig exponering. En annan begränsning av modellen är att främst transplacental överföring på sikt bedöms medan transport takt tidiga gestational åldrar när barriären är tjockare är fortfarande okänd. Faktum är perfusion av första trimestern placentae möjligt men tillgången på dessa placentae är ganska begränsad. Ändå fram till nu ex vivo placentaperfusionen metod är den enda modell för att studera transporten av olika xenobiotika eller nanopartiklar i organiserad mänsklig placentavävnad. Medan toxikodynamik i ex vivo human perfusion modellen kan analyseras enbart i placental vävnad, kan djurförsök ger faktiskt också information om embryotoxicitet. Men på grund av de anatomiska skillnaderna placentabarriären mellan människa och gnagare dessa resultat inte kan extrapoleras till människor 4,5. En annan möjlighet att undersöka transplacentär överföring kan vara cellodling modeller som primära cytotrofoblaster, koriokarcinom cellinjer, isolerade plasma blåsor membran eller moderkakan vävnadsdelar vävnad 29. Den mest använda modellen är BeWo cellinjen, dessa celler är härledda från en malign gestational koriokarcinom och kan bilda ett sammanflytande monoskikt på ett permeabelt membran, så transportstudier kan utföras. Resultat av transportstudier använder BeWo cellmodell korrelerar väl med resultaten i ex vivo human placentaperfusionen 30. Men, för att studera detaljerna i drogen transport (t.ex. bidrag för en specifik transport protein) och metabolism, kan BeWo cellmodell vara mmalm genomförbart främst eftersom det är lättare att hantera och mottagliga för manipulation som uttryck av genetiskt förändrade transportörer eller enzymer, men när det gäller de allmänna studier läkemedelshantering tillförlitligheten i denna modell är begränsad. Det saknar blodflöde och integritet monoskiktet måste utvärderas noggrant eftersom det beror på flera faktorer som cellodlingsbetingelser, såddtäthet, exponeringstid och membranet insatsen 6,29.

Olika xenobiotika och även nanopartiklar binder till olika plasmaproteiner som väsentligt kan påverka transplacental överföringen 31, överväger bindningen till plasmaproteiner är därför viktigt. Den perfusionsmediet innehåller bovint serumalbumin, den mest frekventa plasmaprotein. Nyligen visade en studie att överföra kvoter av olika ämnen som erhållits med ex vivo human placentaperfusionen modellen korrelerar väl med in vivo navelsträngsblod till modernsblod koncentrationsförhållanden när överföringen nyckeltal har justerats enligt omfattningen plasmaproteinbindningsgraden 12.

Totalt sett är det ex vivo placentaperfusionen modell en giltig och tillförlitlig metod för att studera transport över placenta hos människa och att förutsäga in vivo transplacental passage av xenobiotika och nanopartiklar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgements

Detta arbete stöds ekonomiskt av den schweiziska National Foundation, (NRP 64 program, inte bevilja 4064-131.232).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NCTC-135 medium ICN Biomedicals, Inc. 10-911-22C could be replaced by Medium 199 from Sigma (M3769)
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich, Fluka 71381
Potassium chloride (KCl) Hospital pharmacy also possible: Sigma (P9541)
Monosodium phosphate (NaH2PO4 · H2O) Merck 106346
Magnesium sulfate (MgSO4 · H2O) Sigma-Aldrich, Fluka 63139
Calcium chloride (CaCl, anhydrous) Merck 102388
D(+) Glucose (anhydrous) Sigma-Aldrich, Fluka 49138
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Merck 106329
Dextran from Leuconostoc spp. Sigma-Aldrich 31389
Bovine serum albumin (BSA) Applichem A1391
Amoxicilline (Clamoxyl) GlaxoSmithKline AG 2021101A
Sodium heparin B. Braun Medical AG 3511014
Sodium hydoxide (NaOH) pellets Merck 106498 CAUTION: corrosive
Ortho-phosphoric acid 85% (H3PO4) Merck 100573 CAUTION: corrosive
Maternal gas mixture: 95% synthetic air, 5% CO2 PanGas AG
Fetal gas mixture: 95% N2, 5% CO2 PanGas AG
Antipyrine (N-methyl-14C) American Radiolabeled Chemicals, Inc. ARC 0108-50 μCi CAUTION: radioactive material (specific activity: 55mCi/mmol)
Scintillation cocktail (IrgaSafe Plus) Zinsser Analytic GmbH 1003100
Polystyrene particles 80 nm Polyscience, Inc. 17150
Polystyrene particles 500 nm Polyscience, Inc. 17152
EQUIPMENT
Water bath VWR 462-7001
Thermostat IKA-Werke GmbH Co. KG 3164000
Peristaltic pumps Ismatec ISM 833
Bubble traps (glass) UNI-GLAS Laborbedarf
Flow heater UNI-GLAS Laborbedarf
Pressure sensor + Software for analyses MSR Electronics GmbH 145B5
Notebook Hewlett Packard
Miniature gas exchange oxygenator Living Systems Instrumentation LSI-OXR
Tygon Tube (ID: 1.6 mm; OD: 4.8 mm) Ismatec MF0028
Tubes for pumps (PharMed BPT; ID: 1.52 mm) Ismatec SC0744
Blunt cannulae ( 0.8 mm) Polymed Medical Center 03.592.81
Blunt cannulae ( 1.2 mm) Polymed Medical Center 03.592.90
Blunt cannulae ( 1.5 mm) Polymed Medical Center 03.592.94
Blunt cannulae ( 1.8 mm) Polymed Medical Center 03.952.82
Parafilm VWR 291-1212
Perfusion chamber with tissue holder (plexiglass) Internal technical department Similar equipment is available from Hemotek Limited, UK
Surgical suture material (PremiCron) B. Braun Medical AG C0026005
Winged Needle Infusion Set (21G Butterfly) Hospira, Inc. ASN 2102
Multidirectional stopcock (Discofix C-3) B. Braun Medical AG 16494C
Surgical scissors B. Braun Medical AG BC304R
Dissecting scissors B. Braun Medical AG BC162R
Needle holder B. Braun Medical AG BM200R
Dissecting forceps B. Braun Medical AG BD215R
Automated blood gas system Radiometer Medical ApS ABL800 FLEX
Multi-mode microplate reader BioTek Synergy HT
Liquid scintillation analyzer GMI, Inc. Packard Tri-Carb 2200
Scintillation tubes 5.5 ml Zinsser Analytic GmbH 3020001
Tissue Homogenizer OMNI, Inc. TH-220
pH meter + electrode VWR 662-2779

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ala-Kokko, T. I., Myllynen, P., Vahakangas, K. Ex vivo perfusion of the human placental cotyledon: implications for anesthetic pharmacology. Int. J. Obstet. Anesth. 9, 26-38 (2000).
  2. Panigel, M., Pascaud, M., Brun, J. L. Radioangiographic study of circulation in the villi and intervillous space of isolated human placental cotyledon kept viable by perfusion. J. Physiol. (Paris). 59, 277 (1967).
  3. Schneider, H., Panigel, M., Dancis, J. Transfer across the perfused human placenta of antipyrine, sodium and leucine. Am. J. Obstet. Gynecol. 114, 822-828 (1972).
  4. Enders, A. C., Blankenship, T. N. Comparative placental structure. Adv. Drug Deliv. Rev. 38, 3-15 (1999).
  5. Takata, K., Hirano, H. Mechanism of glucose transport across the human and rat placental barrier: a review. Microsc. Res. Tech. 38, 145-152 (1997).
  6. Saunders, M. Transplacental transport of nanomaterials. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 1, 671-684 (2009).
  7. Buerki-Thurnherr, T., von Mandach, U., Wick, P. Knocking at the door of the unborn child: engineered nanoparticles at the human placental barrier. Swiss Med. Wkly. 142, w13559 (2012).
  8. Gendron, M. P., Martin, B., Oraichi, D., Berard, A. Health care providers' requests to Teratogen Information Services on medication use during pregnancy and lactation. Eur. J. Clin. Pharmacol. 65, 523-531 (2009).
  9. Burns, L., Mattick, R. P., Lim, K., Wallace, C. Methadone in pregnancy: treatment retention and neonatal outcomes. Addiction. 102, 264-270 (2007).
  10. von Mandach, U. Drug use in pregnancy. Ther. Umsch. 62, 29-35 (2005).
  11. Malek, A., Obrist, C., Wenzinger, S., von Mandach, U. The impact of cocaine and heroin on the placental transfer of methadone. Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 61 (2009).
  12. Hutson, J. R., Garcia-Bournissen, F., Davis, A., Koren, G. The human placental perfusion model: a systematic review and development of a model to predict in vivo transfer of therapeutic drugs. Clin. Pharmacol. Ther. 90, 67-76 (2011).
  13. International Organization for Standardization (ISO). Technical Specification (ISO/TS) 27687. Nanotechnologies – Terminology and definitions for nano-objects – Nanoparticles, nanofibre and nanoplate. (2008).
  14. Pietroiusti, A. Health implications of engineered nanomaterials. Nanoscale. 4, 1231-1247 (2012).
  15. Latzin, P., Roosli, M., Huss, A., Kuehni, C. E., Frey, U. Air pollution during pregnancy and lung function in newborns: a birth cohort study. Eur. Respir. J. 33, 594-603 (2009).
  16. Lacasana, M., Esplugues, A., Ballester, F. Exposure to ambient air pollution and prenatal and early childhood health effects. Eur. J. Epidemiol. 20, 183-199 (2005).
  17. Menezes, V., Malek, A., Keelan, J. A. Nanoparticulate drug delivery in pregnancy: placental passage and fetal exposure. Curr. Pharm. Biotechnol. 12, 731-742 (2011).
  18. Muhlemann, K., Menegus, M. A., Miller, R. K. Cytomegalovirus in the perfused human term placenta in vitro. Placenta. 16, 367-373 (1995).
  19. Wick, P., et al. Barrier capacity of human placenta for nanosized materials. Environ. Health Perspect. 118, 432-436 (2010).
  20. Dancis, J. Why perfuse the human placenta. Contrib Gynecol. Obstet. 13, 1-4 (1985).
  21. May, K., et al. Perfusion of human placenta with hemoglobin introduces preeclampsia-like injuries that are prevented by alpha1-microglobulin. Placenta. 32, 323-332 (2011).
  22. Guller, S., et al. Protein composition of microparticles shed from human placenta during placental perfusion: Potential role in angiogenesis and fibrinolysis in preeclampsia. Placenta. 32, 63-69 (2011).
  23. Challier, J. C. Criteria for evaluating perfusion experiments and presentation of results. Contrib. Gynecol. Obstet. 13, 32-39 (1985).
  24. Kraemer, J., Klein, J., Lubetsky, A., Koren, G. Perfusion studies of glyburide transfer across the human placenta: implications for fetal safety. Am. J. Obstet. Gynecol. 195, 270-274 (2006).
  25. leal, J. K., et al. Modification of fetal plasma amino acid composition by placental amino acid exchangers in vitro. J. Physiol. 582, 871-882 (2007).
  26. athiesen, L., et al. Quality assessment of a placental perfusion protocol. Reprod. Toxicol. 30, 138-146 (2010).
  27. Myllynen, P., et al. Preliminary interlaboratory comparison of the ex vivo dual human placental perfusion system. Reprod Toxicol. 30, 94-102 (2010).
  28. Malek, A., Sager, R., Schneider, H. Maternal-fetal transport of immunoglobulin G and its subclasses during the third trimester of human pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 32, 8-14 (1994).
  29. Prouillac, C., Lecoeur, S. The role of the placenta in fetal exposure to xenobiotics: importance of membrane transporters and human models for transfer studies. Drug Metab. Dispos. 38, 1623-1635 (2010).
  30. Poulsen, M. S., Rytting, E., Mose, T., Knudsen, L. E. Modeling placental transport: correlation of in vitro BeWo cell permeability and ex vivo human placental perfusion. Toxicol. In Vitro. 23, 1380-1386 (2009).
  31. Mathiesen, L., Rytting, E., Mose, T., Knudsen, L. E. Transport of benzo[alpha]pyrene in the dually perfused human placenta perfusion model: effect of albumin in the perfusion medium. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 105, 181-187 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics