Author Produced

קביעה המהירה amylose התפוקה גבוה בדוגמאות פקעת תפוח האדמה להקפיא יבשים

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

פרוטוקול זה מתאר גבוה באמצעות שיטת colorimetric לשים המסתמכת על היווצרות מורכבת בין יוד ושרשרות של מולקולות גלוקוז בעמילן. יוד יוצרת קומפלקסים עם שני amylose ושרשרות ארוכות בתוך amylopectin. לאחר התוספת של יוד לדגימת עמילן, הספיגה מקסימלית של amylose וamylopectin מתרחשת ב620 ו550 ננומטר, בהתאמה. יחס amylose / amylopectin ניתן להעריך מהיחס של ערכי ספיגת ננומטר 620 ו550 ומשווה אותם לעקומת סטנדרט שבו ריכוזים ספציפיים ידוע הם זממו נגד ערכי קליטה. תפוקה גבוהה, שיטה זולה היא אמינה לשחזור, ומאפשרת ההערכה של אוכלוסיות גדולות של שיבוטים תפוחי אדמה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fajardo, D., Jayanty, S. S., Jansky, S. H. Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples. J. Vis. Exp. (80), e50407, doi:10.3791/50407 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר גבוה באמצעות שיטת colorimetric לשים המסתמכת על היווצרות מורכבת בין יוד ושרשרות של מולקולות גלוקוז בעמילן. יוד יוצרת קומפלקסים עם שני amylose ושרשרות ארוכות בתוך amylopectin. לאחר התוספת של יוד לדגימת עמילן, הספיגה מקסימלית של amylose וamylopectin מתרחשת ב620 ו550 ננומטר, בהתאמה. יחס amylose / amylopectin ניתן להעריך מהיחס של ערכי ספיגת ננומטר 620 ו550 ומשווה אותם לעקומת סטנדרט שבו ריכוזים ספציפיים ידוע הם זממו נגד ערכי קליטה. תפוקה גבוהה, שיטה זולה היא אמינה לשחזור, ומאפשרת ההערכה של אוכלוסיות גדולות של שיבוטים תפוחי אדמה.

Introduction

כ 80% מהמשקל הטרי של פקעת תפוח אדמה הוא מים; כמעט את כל החומר היבש שנותר הוא עמילן 1. רוב העמילן (70%) מורכב מamylopectin, והשאר הוא amylose. היחס בין amylose וamylopectin הוא הנכס החשוב ביותר המשפיע על התכונות הפיסיקליות של עמילן. Amylose הוא שרשרת גלוקוז ליניארי אלפא 1-4, בעוד amylopectin היא שרשרת אלפא 1-4 ליניארי עם אלפא 1-6 ענפים 2. שיטות כגון יוד מחייבות, פער הסריקה calorimetry (DSC), כרומטוגרפיה גודל ביצועים גבוהים הדרה (HPSEC) ואינטראקציות concanavalin פותחו עבור נחישות עמילן במינים יבול שונים 3,4. כל פרוטוקול דורש מיומנויות וציוד מיוחדים, מה שהופך את זה קשה בהיקף של עד לכמת דוגמאות רבות בכל פעם. השיטה שאנו מציגים כאן היא פרוטוקול שונה מHovenkamp-Hermelink et al. 5 שהוא יוד אורך גל כפולה מחייבתשיטה מבוססת על גרגרי עמילן מוכתמים. היתרונות של שיטה זו לעומת אחרים כוללים קביעת amylose מעמילן גלם ללא מטהר אותו ואת השימוש במערכת אורך הגל הכפולה כדי להגדיל את הדיוק של 4,6 השיטה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. קביעת amylose מעמילן פקעת תפוח האדמה

  1. מקלפים וחותכים פקעות טריות לקוביות קטנות.
  2. מניחים קוביות תפוחי אדמה בשקיות חומות קטנות ולאחסן לילה בשעה -80 ° C.
  3. העבר את קוביות תפוחי אדמה לשקיות ניילון ולייבוש בהקפאה.
  4. לאחר ההקפאה יבשה, לטחון את מדגם תפוחי האדמה לאבקה באמצעות מכתש ועלי או מיל ויילי.
  5. בצינור 50 מיליליטר, להוסיף 20-30 מ"ג, מדגם פקעת קרקע המיובש בהקפאה.
  6. הכן פתרון של 45% (w / v) חומצת perchloric (לערבב 24.4 מיליליטר של 60% חומצת perchloric ו25.6 מיליליטר של מים טהורים.
  7. הוסף 500 μl של 45% (w / v) חומצת perchloric ולנער או לערבל אותו כדי לפזר גרגרי עמילן.
  8. לאחר תקופת דגירה של ארבע דקות בטמפרטורת חדר, להוסיף 16 מיליליטר של מים טהורים לפתרון ומערבבים על ידי vortexing.
  9. אחרי חומר שאינו מסיס יש התיישב לחלק התחתון של הצינור (7-10 דקות מאוחר יותר), להעביר 40 μl של הפתרון לצלחת microtiter (הימנעות pipetting של כל חלקיקים).
  10. הוסף 50 μl של תמיסת יוד (ז 2 גרם KI + 1 2 ב900 מיליליטר של מים טהורים) ומערבבים את המדגם על ידי pipetting.
  11. קראו את הספיגה ב 550 ננומטר ו620 מייד ננומטר.
  12. לקבוע את אחוז amylose לאחר שהשווה את יחס amylose / amylopectin של כל דגימה (620 ספיגת nm/550 ננומטר) עם עקומת סטנדרט שנוצרה מפתרונות amylose וamylopectin בטווח של ריכוזים. הליך זה יתואר הבא. קראו (תמיסת יוד וחומצת perchloric) ריקות יחד עם דגימות הבדיקה. שימוש נמחק הנתונים לניתוחים.

2. Curve amylose / amylopectin

  1. בצינורות נפרדים שוקלים 12.5 מ"ג amylose ו12.5 מ"ג amylopectin.
  2. הוסף לכל 5 מיליליטר שפופרת של 45% (w / v) חומצת perchloric ומתמוסס לחלוטין.
  3. עבור כל אחד מהפתרונות (amylose וamylopectin), מביא לנפח סופי של 50 מיליליטר עם מים טהורים.
  4. מערבבים 6.25מיליליטר של מניית amylose מהשלב הקודם עם 18.75 מים טהורים מיליליטר. זה יהפוך את פתרון amylose 6.25 מ"ג / מיליליטר.
  5. חזור על התהליך עבור פתרון amylopectin.
  6. שימוש amylose ופתרונות סטנדרטיים amylopectin מצעדים 2.4 ו2.5, להכין את הסטנדרטים amylose אחוזים שהם amylose 0-100% (amylopectin 100-0%) לנפח סופי של 5 מיליליטר כדי ליצור עקומת הסטנדרט במרווחי 10%.
    לדוגמה, כדי להכין:
    0% amylose / 100% סטנדרטיים amylopectin, פיפטה 5 פתרון amylopectin מיליליטר.
    10% amylose / 90% סטנדרטיים amylopectin, לשלב 0.5 amylose מיליליטר ו4.5 מיליליטר פתרונות amylopectin.
    20% amylose / 80% סטנדרטיים amylopectin, לשלב 1.0 amylose מיליליטר ו4.0 מיליליטר פתרונות amylopectin.
    30% amylose / 70% סטנדרטיים amylopectin, לשלב 1.5 amylose מיליליטר ו3.5 מיליליטר פתרונות amylopectin.
    40% amylose / 60% סטנדרטיים amylopectin, לשלב 2.0 amylose מיליליטר ו2.0 מיליליטר פתרונות amylopectin.
    Amylose 50%/ 50% סטנדרטיים amylopectin, לשלב 2.5 amylose מיליליטר ו2.5 מיליליטר פתרונות amylopectin.
    60% amylose / 40% סטנדרטיים amylopectin, לשלב 3.0 amylose מיליליטר ו2.0 מיליליטר amylopectin, וכן הלאה).
  7. העבר 40 μl של כל תערובת סטנדרטית לצלחת microtiter. כולל גם עם 40 μl 45% (w / v) חומצה perchloric כריקה.
  8. הוסף 50 μl של תמיסת יוד (ז 2 גרם KI + 1 2 ב900 מיליליטר של מים טהורים) ומערבבים כל מדגם (כולל את החסר) על ידי pipetting.
  9. קראו absorbances ב 550 ננומטר ו620 מייד ננומטר ולחשב את יחס amylose / amylopectin עבור כל ריכוז.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עקומת הסטנדרט שנבנתה מנתונים נמחקו מפתרוני ריכוז amylose / amylopectin שונים מציגה יחס הספיגה משוער נע .7-1.6 (טבלה 1). קו המגמה של רגרסיה ליניארית מנתונים אלה שימש מאוחר יותר כדי להסיק מסקנת תוכן amylose בדגימות תפוחי אדמה הקפאה יבשה (איור 1).

יש סביבת ייצור צמח השפעה כלשהי על תוכן amylose בפקעת תפוח האדמה 7. קביעות תוכן amylose משוכפלים בשני מיקומי שדה נפרדים הראו וריאציה נמוכה בקרב פקעות תפוחי אדמה (טבלה 2). לא נראים פיגמנטים בתפוחי אדמה בשר בצבע כדי להשפיע על assay נחישות amylose.

% פתרון amylose 1 550 ספיגת ננומטר 620 ספיגת ננומטר יחס 2 620 ננומטר nm/550
0 0.223 0.156 0.700
10 0.225 0.181 0.804
20 0.221 0.203 .919
30 0.220 0.219 0.995
40 0.223 0.246 1.103
60 0.216 0.280 1.296
70 0.231 0.319 1.381
90 0.225 0.347 1.542
100 0.219 0.357 1.630

טבלת 1. קשר בין ריכוז amylose ויחס הספיגה (620 nm/550 ננומטר). יחס ספיגת לעומת amylose אחוזים זממו באיור 1 </ Strong> לקביעת amylose 1. פתרון amylose אחוז היה עשוי amylose ופתרונות מניות amylopectin בריכוזים שונים 2. יחס מחושב מהנתונים נמחקו absorbances ב620 ננומטר ו550 ננומטר.

זן Loc 550 ננומטר 620 ננומטר יחס % Amylose
Adirondack הכחול 1 1.86 1.78 0.955 25.5
2 2.28 2.15 0.946 24.4
רוז המוקדם 1 2.17 2.12 0.977 27.8
2 2.22 2.14 0.967 26.7
Freאדום אדמדם 1 1.99 1.92 0.965 26.5
2 1.98 1.93 0.973 27.4
האינקה זהב 1 1.95 2.00 1.021 32.6
2 2.27 2.28 1.004 30.7
ריינג'ר אדמדם 1 1.88 1.84 0.975 27.6
2 2.15 2.08 0.967 26.7
Norkotah האדמדם 1 1.84 1.79 .972 27.3
2 1.90 1.86 0.975 27.6
סנודן 1 2.23 2.13 .956 25.5
2 1.64 1.61 0.979 28.0
לבנה פנינה 1 2.32 2.28 0.986 28.7
2 2.22 2.18 .983 28.5

טבלה 2. הערכה משוכפלת של תוכן amylose בזני תפוחי אדמה משני מיקומים שונים שדה ייצור (לוק).

איור 1
איור 1. עקומת סטנדרט ריכוז amylose משמשת להסיק תוכן אחוזים amylose בפקעות תפוח אדמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תוכן amylose בפקעות תפוח אדמה בדרך כלל נע בין 20-35% 7,8. אם רוב הערכים הם מחוץ לטווח זה, שקול שגיאות אפשריות הבאות: 1) נתונים גולמיים שימשו במקום נתונים נמחקו לבניית עקומת סטנדרט amylose / amylopectin; 2) נתונים גולמיים שימשו במקום נתונים נמחקו לקביעת amylose / יחסי amylopectin מדגימות תפוחי האדמה, או 3) המים המשמשים לניתוח לא היו טהורים מספיק. שמנו לב שעל ידי שימוש במים מזוקקים ומים לא אולטרה טהורים בניתוח, הערכים שהתקבלו לא היו לשחזור. דרך קלה כדי לוודא שתמיסת יוד מוכנה כראוי או אם הוא עדיין ישן מדי כדי לשמש היא לבדוק אם הערך ספיגת הגלם של המדגם הריק ב550 ננומטר הוא סביב 0.1.

דיוק בהכנה של יוד ופתרוני amylopectin / amylose הוא חיוני כדי לקבל קביעות amylose אמינות. מכיוון שאנו נמצאים בקביעת חלקם של איימילאבד את התוכן ולא את הסכום המדויק של amylose בעמילן תפוח אדמה, אין צעד טיהור לבידוד של עמילן טהור מאבקת תפוחי האדמה כפי שהוצג על ידי שיטות קביעה אחרות.

לקביעת תוכן amylose בזני תפוחי אדמה, שתי פקעות הקפאה עצמאיות מיובשות מזן עובדו בכל יישוב. מצאנו כי הווריאציה לתוכן amylose בין הפקעות תפוחי אדמה הייתה קטנה (נקודת אחוז פחות מאחוז אחד) ולא משמעותית.

לא היה הבדל בקביעת תוכן amylose בשל הכמות הראשונית של עמילן תפוח אדמה, בין 20-30 מ"ג. מחוץ לטווח זה, התוצאות היו לא אמינות או בלתי ניתנות לגילוי על ידי קורא הצלחת שלנו. למרות Hovenkamp-Hermelink et al. 5 מציעים הוספת נפח מים אם המדגם מרוכז מדי, אנו ממליצים reweighing המדגם ולחזור על ההליך.

prese מחקר זהNTS הנתונים מבוססים על תפוחי אדמה בשר לבנים. בנוסף, יש לנו הערכה בשיטה זו עם תפוחי אדמה בצבע עור (צהובה, אדומים וסגולים). אין הפרעה למורכבת יוד / amylose זוהתה. עם זאת, כמו בכל assay מחייב יוד, חלקם של amylose עשוי להפריז במידה מה בשל מחייב של יוד לרשתות ישר במולקולות amylopectin. assay זה מיועד להקרנת מספר גדול של דגימות. ברגע שאנשים amylose גבוהים מזוהים, אנו ממליצים מחדש בדיקות עם assay amylose ספציפי, כגון concanavalin 9,10. assay זה הוא יקר יותר ועבודה אינטנסיבית מ assay מחייב יוד, אבל זה דווקא יותר קובע רמות amylose.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש לנו מה למסור.

Acknowledgements

מימון למחקר זה מסופק בחלקו על ידי תכנית עמיתים מחקר USDA-ARS והוועדה germplasm היבול של משרד החקלאות האמריקנית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Amylose Sigma 859656
Amylopectin Sigma A8515
Perchloric Acid 60% Sigma 311413 Very hazardous to skin and eyes
Iodine Sigma 23214TD
Potassium iodide Sigma 08625JE
Equipment
Plate Reader Bio Tek ELx800

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Composition Hoover, R. molecular structure, and physicochemical properties of tuber and root starches: a review. Carbohydr. 45, (3), 253-267 (2001).
  2. Bertoft, E., Blennow, A. Structure of Potato Starch. Advances in Potato Chemistry and Technology. 1st ed, Elsevier Ltd. 83-98 (2009).
  3. Campbell, M. R., Yeager, H., Abdubek, N., Pollak, L., Glover, D. Comparison of methods for amylose screening in maize starches from exotic backgrounds. Cereal Chem. 79, 317-321 (2002).
  4. Zhu, T., Jackson, D. S., Wehling, R. L., Geera, B. Comparison of amylose determination methods and the development of a dual wavelength iodine binding technique. Cereal Chem. 85, 51-58 (2008).
  5. Hovenkamp-Hermelink, J., Devries, J., Adamse, P., Jacobsen, E., Witholt, B., Feenstra, W. Rapid estimation of the amylose amylopectin ratio in small amounts of tuber and leaf tissue of the potato. Potato Res. 31, 241-246 (1988).
  6. Shannon, J. C., Garwood, D. L., Boyer, C. D. Genetics and Physiology of Starch Development. Starch. 3rd ed, Elsevier Inc. 23-82 (2009).
  7. Haase, N. U., Plate, J. Properties of potato starch in relation to varieties and environmental factors. Stärke. 48, (5), 167-171 (1996).
  8. Johnston, F. B., Urbas, B., Khanzada, G. Effect of storage on the size distribution and amylose/amylopectin ratio in potato starch granules. Am. Pot. J. 45, 315-321 (1968).
  9. Gibson, T. S., Solah, V. A., McCleary, B. V. A procedure to measure amylose in cereal starches and flours with concanavalin A. J. Cereal Sci. 25, (2), 111-119 (1997).
  10. Sun, S., Matheson, N., Yun, S. -H. Estimation of amylose content of starches after precipitation of amylopectin by concanavalin A. Starch. 42, 302-305 (1990).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics