रुक सूखे आलू कंद नमूने में रैपिड उच्च Throughput amylose निर्धारण

Chemistry

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Summary

इस प्रोटोकॉल आयोडीन और स्टार्च में ग्लूकोज अणु की जंजीरों के बीच एक जटिल के गठन पर निर्भर करता है कि डाल वर्णमिति विधि के माध्यम से एक उच्च वर्णन करता है. आयोडीन amylose और amylopectin भीतर लंबी श्रृंखला के साथ दोनों परिसरों रूपों. एक स्टार्च नमूना करने के लिए आयोडीन के अलावा के बाद, amylose और amylopectin की अधिकतम अवशोषण क्रमश: 620 और 550 एनएम पर होता है. amylose / amylopectin अनुपात 620 और 550 एनएम absorbance के मूल्यों के अनुपात से अनुमान लगाया और विशिष्ट ज्ञात सांद्रता के अवशोषण मूल्यों के खिलाफ साजिश रची है, जिसमें एक मानक वक्र करने के लिए उन्हें तुलना की जा सकती है. इस उच्च throughput, सस्ती विधि आलू क्लोन की बड़ी आबादी के मूल्यांकन की अनुमति, विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है.

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Fajardo, D., Jayanty, S. S., Jansky, S. H. Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples. J. Vis. Exp. (80), e50407, doi:10.3791/50407 (2013).

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Abstract

इस प्रोटोकॉल आयोडीन और स्टार्च में ग्लूकोज अणु की जंजीरों के बीच एक जटिल के गठन पर निर्भर करता है कि डाल वर्णमिति विधि के माध्यम से एक उच्च वर्णन करता है. आयोडीन amylose और amylopectin भीतर लंबी श्रृंखला के साथ दोनों परिसरों रूपों. एक स्टार्च नमूना करने के लिए आयोडीन के अलावा के बाद, amylose और amylopectin की अधिकतम अवशोषण क्रमश: 620 और 550 एनएम पर होता है. amylose / amylopectin अनुपात 620 और 550 एनएम absorbance के मूल्यों के अनुपात से अनुमान लगाया और विशिष्ट ज्ञात सांद्रता के अवशोषण मूल्यों के खिलाफ साजिश रची है, जिसमें एक मानक वक्र करने के लिए उन्हें तुलना की जा सकती है. इस उच्च throughput, सस्ती विधि आलू क्लोन की बड़ी आबादी के मूल्यांकन की अनुमति, विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है.

Introduction

एक आलू कंद की ताजा वजन का लगभग 80% पानी है, लगभग सभी शेष शुष्क बात की स्टार्च 1 है. शेष amylose है जबकि स्टार्च (70%) के अधिकांश, amylopectin से बना है. amylose और amylopectin के बीच अनुपात स्टार्च के भौतिक गुणों को प्रभावित करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण संपत्ति है. Amylopectin अल्फा 1-6 शाखाओं 2 के साथ एक रेखीय अल्फा 1-4 श्रृंखला है, जबकि amylose, एक रेखीय अल्फा 1-4 ग्लूकोज श्रृंखला है. जैसे आयोडीन तरीके बंधन, अंतर स्कैनिंग calorimetry (डीएससी), उच्च प्रदर्शन आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (HPSEC) और concanavalin एक बातचीत विभिन्न फसल प्रजातियों 3,4 में स्टार्च निर्धारण के लिए विकसित किया गया है. प्रत्येक प्रोटोकॉल यह मुश्किल एक बार में कई नमूने यों के लिए पैमाने पर करने के लिए बना विशेष कौशल और उपकरणों की आवश्यकता है. यहाँ प्रस्तुत विधि बाध्यकारी एक दोहरी तरंगदैर्ध्य आयोडीन है जो Hovenkamp-Hermelink एट अल. 5 से एक संशोधित प्रोटोकॉल हैदाग स्टार्च कणिकाओं पर आधारित विधि. दूसरों की तुलना में इस विधि का लाभ यह सफ़ाई के बिना कच्चे स्टार्च से amylose दृढ़ संकल्प और विधि 4,6 की शुद्धता बढ़ाने के लिए दोहरी तरंगदैर्ध्य प्रणाली का उपयोग शामिल है.

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Protocol

1. आलू कंद स्टार्च से amylose निर्धारण

  1. पील और छोटे cubes में ताजा कंद काटा.
  2. छोटे भूरे रंग के बैग में आलू क्यूब्स प्लेस और सेल्सियस -80 पर रात भर की दुकान
  3. नायलॉन बैग के लिए और फ्रीज सुखाने के लिए आलू क्यूब्स स्थानांतरण.
  4. फ्रीज सूखे के बाद, मोर्टार और मूसल या एक विले चक्की का उपयोग पाउडर में आलू नमूना पीस.
  5. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में, फ्रीज सूखे, जमीन कंद नमूना की 20-30 मिलीग्राम जोड़ें.
  6. 45% की एक समाधान तैयार (w / v) परक्लोरिक एसिड (60% परक्लोरिक एसिड के 24.4 मिलीग्राम और अति शुद्ध पानी की 25.6 मिलीलीटर मिश्रण.
  7. 45% की 500 μl (w / v) परक्लोरिक एसिड जोड़ें और हिला या स्टार्च कणिकाओं को फैलाने के लिए यह ज़ुल्फ़.
  8. कमरे के तापमान पर एक चार मिनट ऊष्मायन अवधि के बाद, समाधान के लिए अति शुद्ध पानी की 16 मिलीलीटर जोड़ने और vortexing द्वारा मिश्रण.
  9. गैर घुलनशील पदार्थ ट्यूब के नीचे बसे होने के बाद (7-10 मिनट बाद), (एक microtiter प्लेट के लिए समाधान के 40 μl हस्तांतरणकिसी भी कणों की pipetting बचने).
  10. आयोडीन के घोल (2 जी KI + 1 ग्राम मैं अति शुद्ध पानी की 900 मिलीलीटर में 2) का 50 μl जोड़ें और pipetting द्वारा नमूना मिश्रण.
  11. 550 एनएम पर absorbance पढ़ें और 620 तुरंत एनएम.
  12. सांद्रता की एक श्रृंखला पर amylose और amylopectin समाधान से उत्पन्न एक मानक वक्र के साथ प्रत्येक नमूने की amylose / amylopectin अनुपात (620 nm/550 एनएम absorbance) की तुलना करने के बाद amylose प्रतिशत निर्धारित करते हैं. यह प्रक्रिया अगले वर्णित किया जाएगा. परीक्षण के नमूने के साथ रिक्त (आयोडीन समाधान और परक्लोरिक एसिड) पढ़ें. इस्तेमाल की विश्लेषण के लिए डेटा blanked.

2. Amylose / amylopectin वक्र

  1. अलग नलियों में amylose के 12.5 मिलीग्राम और amylopectin के 12.5 मिलीग्राम वजन.
  2. 45% की प्रत्येक ट्यूब 5 मिलीलीटर जोड़ें (w / v) परक्लोरिक एसिड और पूरी तरह से भंग.
  3. समाधान (amylose और amylopectin) में से प्रत्येक के लिए, अति शुद्ध पानी के साथ 50 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए ले आओ.
  4. 6.25 मिक्स18.75 मिलीलीटर अति शुद्ध पानी के साथ पिछले चरण से amylose शेयर की मिलीलीटर. यह एक 6.25 मिलीग्राम / एमएल amylose समाधान कर देगा.
  5. Amylopectin समाधान के लिए प्रक्रिया दोहराएँ.
  6. कदम 2.4 और 2.5 से amylose और amylopectin मानक समाधान का उपयोग करना, 10% अंतराल में मानक वक्र बनाने के लिए 5 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए 0-100% amylose (100-0% amylopectin) हैं जो प्रतिशत amylose मानकों तैयार करते हैं.
    उदाहरण के लिए, तैयार करने के लिए:
    0% amylose / 100% amylopectin मानक, पिपेट 5 एमएल amylopectin समाधान.
    10% amylose / 90% amylopectin मानक, 0.5 मिलीलीटर amylose और 4.5 मिलीलीटर amylopectin समाधान गठबंधन.
    20% amylose / 80% amylopectin मानक, 1.0 मिलीलीटर amylose और 4.0 मिलीलीटर amylopectin समाधान गठबंधन.
    30% amylose / 70% amylopectin मानक, 1.5 मिलीग्राम amylose और 3.5 मिलीग्राम amylopectin समाधान गठबंधन.
    40% amylose / 60% amylopectin मानक, 2.0 मिलीलीटर amylose और 2.0 मिलीलीटर amylopectin समाधान गठबंधन.
    50% amylose/ 50% amylopectin मानक, 2.5 मिलीलीटर amylose और 2.5 मिलीलीटर amylopectin समाधान गठबंधन.
    60% amylose / 40% amylopectin मानक, 3.0 मिलीलीटर amylose और 2.0 मिलीलीटर amylopectin गठबंधन, और इतने पर).
  7. एक microtiter प्लेट के लिए प्रत्येक मानक मिश्रण के 40 μl स्थानांतरण. रिक्त के रूप में एक अच्छी तरह से 40 μl 45% के साथ (w / v) परक्लोरिक एसिड भी शामिल है.
  8. आयोडीन के घोल (2 जी KI + 1 ग्राम मैं अति शुद्ध पानी की 900 मिलीलीटर में 2) का 50 μl जोड़ें और pipetting द्वारा (रिक्त सहित) प्रत्येक नमूना मिश्रण.
  9. 550 एनएम पर absorbances पढ़ें और 620 तुरंत एनएम और प्रत्येक एकाग्रता के लिए amylose / amylopectin अनुपात की गणना.

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Representative Results

विभिन्न amylose / amylopectin एकाग्रता समाधान की खाली डेटा से निर्माण मानक वक्र 0.7 से 1.6 (1 टेबल) को लेकर लगभग absorbance के अनुपात से पता चलता है. इन आंकड़ों से एक रेखीय प्रतिगमन प्रवृत्ति लाइन बाद में फ्रीज सूखे आलू के नमूने में amylose सामग्री (चित्रा 1) inferring के लिए प्रयोग किया जाता है.

संयंत्र उत्पादन वातावरण आलू कंद 7 में amylose सामग्री पर कुछ प्रभाव पड़ता है. दो अलग क्षेत्र स्थानों में दोहराया amylose सामग्री निर्धारण आलू कंद के बीच कम भिन्नता (तालिका 2) से पता चला है. रंग का मांस आलू में पिगमेंट amylose दृढ़ संकल्प परख प्रभावित करने के लिए नहीं लगती.

% Amylose समाधान 1 550 एनएम absorbance 620 एनएम absorbance अनुपात 2 620 nm/550 एनएम
0 0.223 0.156 0.700
10 0.225 0.181 0.804
20 0.221 0.203 0.919
30 0.220 0.219 0.995
40 0.223 0.246 1.103
60 0.216 0.280 1.296
70 0.231 0.319 1.381
90 0.225 0.347 1.542
100 0.219 0.357 1.630

प्रतिशत amylose बनाम amylose एकाग्रता और absorbance के अनुपात (620 nm/550 एनएम) के बीच तालिका 1. रिश्ता. Absorbance अनुपात चित्रा 1 <में साजिश रची हैAmylose दृढ़ संकल्प 1 के लिए> / मजबूत. प्रतिशत amylose समाधान अलग सांद्रता 2 में amylose और amylopectin शेयर समाधान से बनाया गया था. खाली डेटा से गणना अनुपात 620 एनएम और 550 एनएम पर absorbances.

Cultivar नियंत्रण रेखा 550 एनएम 620 एनएम अनुपात Amylose%
Adirondack ब्लू 1 1.86 1.78 0.955 25.5
2 2.28 2.15 0.946 24.4
गुलाब की शुरुआत 1 2.17 2.12 0.977 27.8
2 2.22 2.14 0.967 26.7
फुटबॉलएदोम लाल सा 1 1.99 1.92 0.965 26.5
2 1.98 1.93 0.973 27.4
इंका गोल्ड 1 1.95 2.00 1.021 32.6
2 2.27 2.28 1.004 30.7
रेंजर लाल सा 1 1.88 1.84 0.975 27.6
2 2.15 2.08 0.967 26.7
लाल सा Norkotah 1 1.84 1.79 0.972 27.3
2 1.90 1.86 0.975 27.6
Snowden 1 2.23 2.13 0.956 25.5
2 1.64 1.61 0.979 28.0
मोती का रंग 1 2.32 2.28 0.986 28.7
2 2.22 2.18 0.983 28.5

तालिका 2. दो अलग अलग क्षेत्र के उत्पादन स्थानों (एलओसी) से आलू खेती में amylose सामग्री की दोहराया मूल्यांकन.

चित्रा 1
चित्रा 1. Amylose एकाग्रता मानक वक्र आलू कंद में amylose प्रतिशत सामग्री अनुमान किया.

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Discussion

आलू कंद में amylose सामग्री आम तौर पर 20-35% 7,8 से चलता है. सबसे मानों इस सीमा के बाहर हैं, तो ये संभव त्रुटियों पर विचार: 1) कच्चे डेटा amylose / amylopectin मानक वक्र के निर्माण के लिए जगह खाली डेटा का इस्तेमाल किया गया है, 2) कच्चे डेटा amylose के निर्धारण के लिए बजाय खाली डेटा का इस्तेमाल किया गया / amylopectin आलू के नमूने से अनुपात, या 3) के विश्लेषण के लिए उपयोग किए गए पानी पर्याप्त शुद्ध नहीं था. हम विश्लेषण में आसुत जल और नहीं अति शुद्ध पानी का उपयोग करके, प्राप्त मूल्यों प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नहीं थे कि देखा. यह अभी भी इस्तेमाल किया जाएगा बहुत पुराना है अगर आयोडीन समाधान सही ढंग से तैयार किया जाता है या कि सत्यापित करने के लिए एक आसान तरीका है 550 एनएम पर खाली नमूना कच्चा absorbance के मूल्य चारों ओर 0.1 है कि क्या जांच करने के लिए है.

आयोडीन और amylopectin / amylose समाधान की तैयारी में प्रेसिजन विश्वसनीय amylose निर्धारण हो रही करने के लिए महत्वपूर्ण है. हम एमी के अनुपात का निर्धारण कर रहे हैंबल्कि आलू स्टार्च में amylose की सही राशि से सामग्री खो, अन्य दृढ़ संकल्प विधियों द्वारा प्रस्तुत के रूप में आलू पाउडर से शुद्ध स्टार्च के अलगाव के लिए कोई शुद्धि कदम है.

आलू खेती में amylose सामग्री के निर्धारण के लिए, प्रत्येक फसल से दो स्वतंत्र फ्रीज सूखे कंद प्रत्येक इलाके में प्रोसेस किया गया. हम आलू कंद के बीच amylose सामग्री के लिए परिवर्तन (कम से कम एक प्रतिशत अंक) छोटे और महत्वपूर्ण नहीं था.

Amylose सामग्री दृढ़ संकल्प में कोई अंतर के कारण 20-30 मिलीग्राम के बीच आलू स्टार्च की प्रारंभिक राशि, वहाँ था. इस सीमा के बाहर, परिणाम हमारी थाली पाठक द्वारा अविश्वसनीय या undetectable हो गया. Hovenkamp-Hermelink एट अल. 5 नमूना भी ध्यान केंद्रित किया है, तो पानी की एक मात्रा जोड़ने का सुझाव है, भले ही हम नमूना Reweighing और प्रक्रिया को दोहरा सलाह देते हैं.

इस अध्ययन preseसफेद गूदे आलू पर आधारित एनटीएस डेटा. इसके अलावा, हम रंग का मांस आलू (पीले, लाल और बैंगनी) के साथ इस पद्धति का मूल्यांकन किया है. आयोडीन / amylose जटिल के साथ कोई हस्तक्षेप का पता चला था. हालांकि, किसी भी आयोडीन बाध्यकारी परख के साथ के रूप में, amylose के अनुपात के कारण amylopectin अणुओं में सीधे श्रृंखला के लिए आयोडीन के बंधन को कुछ हद तक overestimated हो जाने की संभावना है. यह परख नमूनों की बड़ी संख्या स्क्रीनिंग के लिए करना है. एक बार उच्च amylose व्यक्तियों की पहचान कर रहे हैं, हम इस तरह एक 9,10 concanavalin के रूप में एक amylose विशेष परख के साथ फिर से जांच की सिफारिश. इस परख अधिक महंगी और श्रम प्रधान आयोडीन बाध्यकारी परख की तुलना में है, लेकिन यह ज्यादा ठीक amylose स्तर निर्धारित करता है.

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgements

इस शोध के लिए अनुदान USDA-ARS रिसर्च एसोसिएट प्रोग्राम और यूएसडीए फसल जर्मप्लाज्म समिति के हिस्से में प्रदान किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Amylose Sigma 859656
Amylopectin Sigma A8515
Perchloric Acid 60% Sigma 311413 Very hazardous to skin and eyes
Iodine Sigma 23214TD
Potassium iodide Sigma 08625JE
Equipment
Plate Reader Bio Tek ELx800

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References

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