凍結乾燥したジャガイモ塊茎のサンプルの急速なハイスループットアミロース決定

Chemistry

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Summary

このプロトコルは、ヨウ素とデンプン中のグルコース分子の鎖の間の複合体の形成に依存して置い比色法による高について説明します。ヨウ素は、アミロースとアミロペクチンの中に長い鎖の両方と複合体を形成している。澱粉試料に​​ヨウ素を添加した後、アミロースとアミロペクチンの最大吸収は、それぞれ、620および550nmで発生する。アミロース/アミロペクチン比は、620および550 nmの吸光度値の比から推定され、特定の既知の濃度を吸収値に対してプロットした標準曲線と比較することもできる。この高いスループットは、安価な方法は、ジャガイモのクローンの大集団の評価ができるように、信頼性と再現性である。

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Fajardo, D., Jayanty, S. S., Jansky, S. H. Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples. J. Vis. Exp. (80), e50407, doi:10.3791/50407 (2013).

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Abstract

このプロトコルは、ヨウ素とデンプン中のグルコース分子の鎖の間の複合体の形成に依存して置い比色法による高について説明します。ヨウ素は、アミロースとアミロペクチンの中に長い鎖の両方と複合体を形成している。澱粉試料に​​ヨウ素を添加した後、アミロースとアミロペクチンの最大吸収は、それぞれ、620および550nmで発生する。アミロース/アミロペクチン比は、620および550 nmの吸光度値の比から推定され、特定の既知の濃度を吸収値に対してプロットした標準曲線と比較することもできる。この高いスループットは、安価な方法は、ジャガイモのクローンの大集団の評価ができるように、信頼性と再現性である。

Introduction

ジャガイモ塊茎の生体重の約80%は水である。ほぼすべての残りの乾物は、澱粉1です。残りはアミロースであり、一方デンプン(70%)のほとんどは、アミロペクチンから構成される。アミロースとアミロペクチンとの比は、デンプンの物理的特性に影響を与える最も重要な特性である。アミロペクチンは、α1-6枝2を有する線状アルファ1-4鎖であるが、アミロースは、直鎖状α-グルコース1-4鎖である。ヨウ素のような方法は、結合、示差走査熱量測定(DSC)は、高性能サイズ排除クロマトグラフィー(HPSEC)とコンカナバリンAとの相互作用は、異なる作物種3,4におけるデンプンの判定のために開発されている。各プロトコルには、それが困難な時に多数のサンプルを定量化するためにスケールアップすること、特別なスキルや機器を必要とします。我々はここで紹介する方法は、結合二波長ヨウ素であるHovenkamp-Hermelink 5から変更されたプロトコルであり、染色されたデンプン粒に基づく方法。他人に対するこの方法の利点は、それを精製することなく、生デンプンのアミロースの決定方法4,6の精度を高めるために二重波長システムの使用を含む。

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Protocol

1。ジャガイモ塊茎のデンプンからアミロース決定

  1. 皮をむき、小さな立方体に新鮮な塊茎を切った。
  2. 小さな茶色の袋にジャガイモのキューブを配置し、-80℃で一晩保存する
  3. ナイロン袋にジャガイモのキューブを転送し、凍結乾燥のための。
  4. 凍結乾燥した後、乳鉢と乳棒またはワイリーミルを用いて粉末にポテトサンプルを挽く。
  5. 50mlチューブ中で、凍結乾燥し、粉砕塊茎試料の20〜30 mgの追加。
  6. 45%の溶液を調製し(w / v)の過塩素酸(60%過塩素酸24.4 mlの超純水25.6mlを混合する。
  7. 45パーセントの500μL(w / v)の過塩素酸を加え、振ったり、デンプン粒を分散させるために、それを旋回。
  8. 室温での4分間のインキュベーション期間の後、この溶液に超純水16ミリリットルを加え、ボルテックスで混和する。
  9. 非水溶性物質をチューブの底に沈殿した後に(7月10日分後)、(マイクロタイタープレートに溶液40μlを転送)任意の粒子のピペッティングを避ける。
  10. ヨウ素溶液(2グラムKI + 1グラムのI超純水900ミリリットル中2)の50μLを加え、ピペッティングによりサンプルを混ぜる。
  11. すぐに550 nmおよび620 nmの吸光度を読んでください。
  12. 濃度の範囲でのアミロースとアミロペクチンの溶液から作成した標準曲線と各サンプルのアミロース/アミロペクチン比(620 nm/550 nmの吸光度)を比較した後、アミロースの割合を決定する。この手順について説明する。試験サンプルと一緒にブランク(ヨウ素溶液と過塩素酸)をお読みください。使用は、分析のためのデータをブランク。

2。アミロース/アミロペクチンカーブ

  1. 別々のチューブ中のアミロースの12.5 mgおよびアミロペクチンの12.5 mgの重量を量る。
  2. 45%の各チューブ5mlまで入れる(w / v)の過塩素酸を完全に溶解させる。
  3. 溶液(アミロース及びアミロペクチン)のそれぞれについて、超純水で50mlの最終容量にもたらす。
  4. 6.25を混ぜる18.75ミリリットル超純水で前のステップからのアミロース株式ミリリットル。これは6.25 mg / mlのアミロース溶液を作製します。
  5. アミロペクチンソリューションの手順を繰り返します。
  6. ステップ2.4​​および2.5からのアミロースとアミロペクチンの標準溶液を用いて、10%の間隔で標準曲線を作成するために、5mlの最終容積に0-100%アミロース(100から0パーセントのアミロペクチン)がパーセントアミロース標準液を調製。
    たとえば、準備するには、次のように
    0%のアミロース/アミロペクチン100%の規格、ピペットを5mlアミロペクチン溶液。
    10%のアミロース/アミロペクチン90%の規格は、0.5mlのアミロースおよびアミロペクチン4.5ミリリットル溶液を組み合わせる。
    20%のアミロース/ 80%のアミロペクチン標準は、1.0ミリリットルアミロースとアミロペクチン4.0ミリリットルのソリューションを組み合わせています。
    30%のアミロース/ 70%のアミロペクチン標準は、1.5ミリリットルアミロースとアミロペクチン3.5ミリリットルのソリューションを組み合わせています。
    40%のアミロース/ 60%のアミロペクチン標準は、2.0ミリリットルアミロースとアミロペクチン2.0ミリリットルのソリューションを組み合わせています。
    50%のアミロース/ 50%のアミロペクチン標準、2.5ミリリットルアミロースとアミロペクチン2.5ミリリットルのソリューションを組み合わせています。
    60%のアミロース/アミロペクチン40%の標準は、3.0ミリリットルアミロースとアミロペクチン2.0ミリリットルを組み合わせるなど)。
  7. マイクロタイタープレートに各標準液40μlのを転送します。空白だけでなく、40μlの45パーセントと(w / v)の過塩素酸などが挙げられる。
  8. ヨウ素溶液(2グラムKI + 1グラムのI超純水900ミリリットル中2)の50μLを加え、ピペッティングにより(空白を含む)の各サンプルを混ぜる。
  9. 550 nmの吸光度を読み、620 nmの直後に、それぞれの濃度について、アミロース/アミロペクチン比を計算します。

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Representative Results

別のアミロース/アミロペクチン濃度溶液のブランクデータから作成した標準曲線を、0.7〜1.6近似吸光度比( 表1)を示す。これらのデータからの線形回帰トレンド線は、後に凍結乾燥したジャガイモ試料中のアミロース含有量( 図1)を推定するために使用される。

植物生産環境は、ジャガイモ塊茎7のアミロース含量に何らかの影響を有する。つの別々のフィールド位置で複製されたアミロース含有量の決定は、ジャガイモ塊茎( 表2)のうち低い変動を示した。着色された肉のジャガイモ中の顔料は、アミロース決定アッセイに影響を与えていないようです。

%アミロース溶液 1 550 nmの吸光度 620 nmの吸光度 2 620 nm/550 nmの
0 0.223 0.156 0.700
10 0.225 0.181 0.804
20 0.221 0.203 0.919
30 0.220 0.219 0.995
40 0.223 0.246 1.103
60 0.216 0.280 1.296
70 0.231 0.319 1.381
90 0.225 0.347 1.542
100 0.219 0.357 1.630

%のアミロース対アミロースの濃度と吸光度比(620 nm/550 nm)の間に表1の関係吸光度比は、 図1 <にプロットするアミロース決定1> /強い。パーセンテージアミロース溶液が異なる濃度2のアミロースとアミロペクチンの原液から作られた。ブランクデータから計算された比率は、620 nmおよび550 nmで吸光度。

栽培品種 LOC 550 nmの 620 nmの アミロース%
アディロンダックブルー 1 1.86 1.78 0.955 25.5
2 2.28 2.15 0.946 24.4
初期のローズ 1 2.17 2.12 0.977 27.8
2 2.22 2.14 0.967 26.7
FREEDOMラセット 1 1.99 1.92 0.965 26.5
2 1.98 1.93 0.973 27.4
インカゴールド 1 1.95 2.00 1.021 32.6
2 2.27 2.28 1.004 30.7
レンジャーラセット 1 1.88 1.84 0.975 27.6
2 2.15 2.08 0.967 26.7
あずき色のNorkotah 1 1.84 1.79 0.972 27.3
2 1.90 1.86 0.975 27.6
スノーデン 1 2.23 2.13 0.956 25.5
2 1.64 1.61 0.979 28.0
ホワイトパール 1 2.32 2.28 0.986 28.7
2 2.22 2.18 0.983 28.5

表2。二つの異なるフィールドの生産拠点(LOC)からジャガイモ品種におけるアミロース含量の評価が複製された。

図1
図1。ジャガイモ塊茎におけるアミロース含有割合を推測するために使用アミロース濃度標準曲線。

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Discussion

ジャガイモ塊茎中のアミロース含量は、典型的には20〜35% の7,8の範囲である。ほとんどの値がこの範囲外である場合、これらのエラーの可能性を検討し、1)生データは、アミロース/アミロペクチン標準曲線の構築のために代わりにブランクデータを使用した、2)生データは、アミロースの決定のために代わりにブランクデータを用いた/アミロペクチンジャガイモのサンプルからの比、または3)解析に用いた水は十分に純粋ではなかった。我々の分析ではなく、蒸留水、超純水を用いることにより、得られる値が再現可能ではなかったことに気づいた。それはまだ使用するには古すぎる場合、ヨウ素溶液が正しく準備やされていることを確認する簡単な方法は、550nmでのブランク試料の生の吸光度値は約0.1であるかどうかをチェックすることです。

ヨウ素及びアミロペクチン/アミロース溶液の調製の精度、信頼性の高いアミロース決定を得るために非常に重要です。私たちは、エイミーの割合を決定しているのでむしろジャガイモデンプン中のアミロースの正確な量よりもコンテンツを失う、他の決定方法によって提示されるようジャガイモ粉からの純粋なデンプンの単離のための精製工程は存在しない。

ジャガイモ品種におけるアミロース含有量の決定については、各品種の二つの独立した凍結乾燥した塊茎を、各地域で処理した。私たちは、ジャガイモ塊茎間のアミロース含量のため変動が小さい(1%ポイント未満)と有意ではなかったことがわかった。

20〜30mgの間のジャガイモデンプンの初期量によるアミロース含有量の決定、に差はなかった。この範囲外の結果は、我々のプレートリーダーによる信頼性の低いまたは検出不可能となった。 Hovenkamp-Hermelink 5は、サンプルがあまりにも集中している場合は、水の量を追加することを示唆しているにもかかわらず、我々は、サンプルを秤量し、手順を繰り返すことをお勧めします。

この研究のpresaの複数形白い果肉がジャガイモに基づくNTSデータ。加えて、我々は色の肉ジャガイモ(黄、赤、紫)で、この方法を評価した。ヨウ素/アミロース複合体との干渉は検出されなかった。しかし、任意のヨウ素の結合アッセイと同様に、アミロースの割合は、アミロペクチン分子中の直鎖へのヨウ素の結合に幾分過大評価される可能性がある。このアッセイは、多数のサンプルをスクリーニングするために意図されている。かつて高アミロースの個人が識別され、我々はそのような9,10コンカナバリンなどアミロース特異的アッセイで再テストすることをお勧めします。このアッセイは、ヨウ素結合アッセイよりも高価で、労働集約的であるが、より正確には、アミロースレベルを決定する。

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Disclosures

我々は、開示することは何もありません。

Acknowledgements

この研究のための資金は、米国農務省、ARSの研究アソシエイト·プログラムおよび農務省作物遺伝資源委員会によって部分的に提供されていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Amylose Sigma 859656
Amylopectin Sigma A8515
Perchloric Acid 60% Sigma 311413 Very hazardous to skin and eyes
Iodine Sigma 23214TD
Potassium iodide Sigma 08625JE
Equipment
Plate Reader Bio Tek ELx800

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References

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