Metoder for Performing Crosses i
1Donald Danforth Plant Science Center, 2Boyce Thompson Institute

Environment
 

Summary

Vi har udviklet en metode til at udføre krydser i Setaria viridis (S. viridis). Metoden indebærer beskæring panicle forud for et varmt vand behandling for at dræbe levedygtige pollen. Crosses udføres efter et godt kontrolleret vækst regime og typisk resultere i inddrivelse af 1 til 7 krydsbestøvede frø / s pr panicle.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jiang, H., Barbier, H., Brutnell, T. Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses. J. Vis. Exp. (80), e50527, doi:10.3791/50527 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Setaria viridis er en ny model for C 4 græsser. Det er tæt forbundet med bioenergi forrådsmaterialet præriegræs og kornhøsten rævehale hirse. For nylig, 510 Mb genomet af rævehale hirse, S. italica, er blevet sekventeret 1,2 og 25x dækning genom-sekvensen af skvattet relative S. viridis er i gang. S. viridis har en række karakteristika, der gør det en potentielt glimrende model genetisk system, herunder en hurtig generation tid, lille statur, simple vækst krav, frodig frøproduktion 3 og udviklet systemer til både forbigående og stabil transformation 4.. Men genetik S. viridis er stort set uudforsket, delvis på grund af mangel på detaljerede metoder til at udføre kors. Til dato har ingen standard-protokol vedtaget, der vil tillade hurtig produktion af frø fra kontrollerede krydsninger.

Protokollen presteret her er optimeret til at udføre genetiske krydser i S. viridis, tiltrædelsen A10.1. Vi har ansat en enkelt varmebehandling med varmt vand til kastrering efter beskæring panicle at beholde 20-30 buketter og mærkning af blomster til at fjerne frø som følge af nyudviklede blomster efter kastrering. Efter at have testet en række varmebehandlinger ved eftergivende temperaturer og varierende varighed dypning, har vi etableret en optimal temperatur og tidsinterval på 48 ° C i 3-6 min. Ved at bruge denne metode, kan mindst 15 krydser udføres af en enkelt arbejdstager per dag og et gennemsnit på 3-5 udkryds afkom pr panicle kan inddrives. Derfor kan et gennemsnit på 45-75 udkryds afkom blive produceret af en person på en enkelt dag. Bred gennemførelse af denne teknik vil lette udviklingen af rekombinante indavlede linje populationer af S. viridis X S. viridis eller S. viridis X S. Italica, kortlægning af mutationer gennem hovedparten segregant analyse og skabe højere orden mutanter til genetisk analyse.

Introduction

S. viridis er en NADP-ME subtype C4 græs tæt knyttet til bioenergi-feed lager præriegræs (NAD-ME-undertype), kornhøsten rævehale hirse og landbrugets ukrudt guinea græs 5.. 510 Mb genomet af dyrkede form af Setaria, S. Italica, er for nylig blevet sekventeret 1,2 og 25x dækning genom sekvens af skvattet slægtning, S. viridis, er i gang (ikke offentliggjort). S. viridis har en række karakteristika, der gør det en potentielt glimrende model genetisk system, herunder en hurtig generation tid, lille statur, simple vækst krav og frodig frøproduktion 3. Vigtigere er det, er for nylig blevet udviklet metoder til både transient og stabil transformation af S. viridis som giver mulighed for at skabe transgene planter 4. Men en væsentlig flaskehals i udviklingen af genetiske værktøjer til S. viridis er dens Recalcitrance til indkrydsning. Til dato har ingen standard-protokol blevet offentliggjort, der vil tillade hurtig produktion af frø fra kontrollerede krydsninger.

Genetiske krydser i S. Italica er normalt udføres af kastrering gennem fjernelse af støvknapper fra blomster 6,7,8 eller ved varmebehandling af blomster af kvindelige forældre 9-11. Efter disse behandlinger, støvknapper eller toppe fra ikke-behandlede blomster / er mandlige forældre forsigtigt slibes mod støvfang frigive pollen. I kastrering er støvknapper fjernes med fine tænger umiddelbart efter floret åbnes og støvknap begynder at exsert, men har endnu ikke afgivet pollen 6-8. Blandt de udfordringer, denne sidstnævnte fremgangsmåde er vanskeligheden ved at udføre kastration i en smal tidsinterval mellem åbningen og pollen stald blomsten. Varigheden af ​​åbning og lukning af en enkelt blomst vil variere afhængigt af tiltrædelsen og miljømæssig stand, og kan variere fra 7 min <sup> 6-2,5 hr 12 i S. Italica. Siden kaste af pollen forekommer som støvknapper exsert fra floret, behøver støvknapper fjernes omhyggeligt og hurtigt, og derfor er det svært at undgå forurening som følge af selvbestøvning. Hertil kommer, som bestøvninger udføres umiddelbart efter kastrering, antallet af krydsninger, der kan udføres pr person / dag er begrænset.

Som en alternativ metode kan modne toppe dyppes i varmt vand til at opvarme-kill udvikle pollenkorn 9,10,13,14 med fordel ved at udføre kors på et stort antal toppe. Men temperaturen og varigheden af varmebehandlingen varierer meget fra forskellige eksperimenter (fx 47 ° C i 10 minutter 14 og 42 ° C i 20 minutter 10). Desuden har ingen systematiske analyser af effekten af ​​varme-medierede emasculations blevet offentliggjort. Således er en standard og enkel fremgangsmåde til udførelse af genetiske krydsninger i S. viridis ville i høj grad fremskynde udviklingen genetiske ressourcer og etablering af S. viridis som modelsystem i forskningsverdenen.

Vi rapporterer udvikling og optimering af en standard-protokol til at udføre genetiske krydser i S. viridis. Planter dyrkes under kontrollerede miljøer at synkronisere blomst udvikling og øger reproducerbarhed af proceduren. Krydsninger udføres ved hjælp af en transgen S. viridis linje som den mandlige forælder indeholder GUS-reportergenet 4 for at lette identifikationen af succesfulde kontrollerede genetiske kors. GUS-transgen er drevet af en ris ubiquitin promotor, som gør det muligt for scoring af F1 frø umiddelbart efter høst og tilvejebringer således en let kvalitativ analyse for at bestemme effektiviteten af ​​kastrering og bestøvning. Vi har ansat en enkelt varmebehandling med varmt vand til kastrering ledsaget af mærkning af blomster, der har været emasculaTED at fjerne frø som følge af nyudviklede blomster efter kastrering. Efter at have testet en række varmebehandlinger ved eftergivende temperaturer og varierende varighed dyppe i varmt vand, har vi etableret en optimal temperatur og tid varigheder på 48 ° C 3-6 min. En præ-dawn kuldebehandling blev fundet at fremme synkron anthesis i begge forældre for at lette krydsbestøvning. Vi har også drøftet de vigtigste skridt i protokollen og den fremtidige anvendelse af denne metode til andre Setaria tiltrædelser.

Protocol

1.. Vækst af S. viridis

  1. Indstil vækstkammeret forhold til 31 ° C/22 ° C (dag / nat), 12 hr light/12 hr mørk, 50% relativ fugtighed med en pre-dawn behandling på 15 ° C fra 8:30 til 09:00 AM. (Figur 1). Under disse betingelser, S. viridis A10.1 tager cirka 21-22 dage fra frø såning til anthesis.
  2. Fyld lejligheder (4 x 9 celler) med Metro Mix 360 og fjerne en celle til vanding.
  3. Let tåge vand på jordoverfladen.
  4. Sår frø på overfladen af ​​jord, ét frø pr celle.
  5. Dæk frøene med et lag af jord (ca. 0,5 cm)
  6. Tåge overfladen af ​​jord og vand flats fra bunden. Hold vanding fra bunden efter frø såning.
  7. For hvert kryds, der vil blive udført mindst tre anlæg vil blive anvendt som kvindelige forældre og ni anlæg vil blive anvendt som mandlige forældre. Frø såning bør være forskudt som alle planter vil ikke blomst på samme dag. Seed SOWIng anbefales hver dag over en periode på tre dage.
  8. Vande planter 1-2 gange om dagen, som er afhængig af størrelsen af ​​planterne og jordbundsforholdene. Overskydende vand i jorden er ikke gunstig for optimal vækst af planterne, og kan føre til svampevækst i jord og skader af blade væv.
  9. Befrugte planter to gange om ugen ved hjælp af Jack 15-16-17 ved en koncentration på 100 ppm.

2. Trimning og mærkning af panicle Før Kastrering - Dag 1

  1. I eftermiddag eller aften forud for bestøvning, flytte planter fra kammeret vækst til laboratoriet (Temperatur (T): 24,06 ° C ± 0,13 ° C, relativ luftfugtighed (RH) 21,79% ± 1,15%).
  2. Vælg de primære toppe med 1 blomst til 1/3 af blomster på gren, der allerede blomstrede.
  3. I denne undersøgelse de fire domæner i panicle er defineret som følger (figur 2A, tip, distal midten, proksimal midten og base).
  4. Ideelt set choosea panicle med 1-5 blomster, der har blomstrede, afbrød spidsen af ​​panicle (distale ende), og fjerne alle blomsterne i de proksimale midterste og base sektioner ved hjælp af foråret saks eller fine tænger.
  5. Hvis en gren har omkring 1/10 til 1/5 af blomster, der har blomstrede, afbrød spids og trimme blomster fra bunden af ​​den gren, kun at bevare den nederste del af den distale midterste og øvre sektion af proksimal midt for yderligere trimning.
  6. Hvis en gren har omkring 1/4 til 1/2 af blomster, der har blomstrede, afbrød distale midtersektion og kun bibeholde proximale midterste sektion for yderligere trimning.
  7. Brug kirurgiske sakse til let trimme børsterne.
  8. Fjern alle blomster, der har blomstrede, og alle umodne blomster forlader ca 20-30 blomster / panicle der er jævnt fordelt i regionen (figur 3). Praksis omhu for at fastholde børsterne i den region, der skal bestøves for at beskytte buketter fra mulige skader varme.For hver spikelet, bevarer den øverste mest modne floret. De øverste floret har en højere sandsynlighed for anthesis ved bestøvning (figur 2B).
  9. Markere den ene side af hver blomst med en rød permanent markør og registrere antallet af buketter på panicle (figur 2B).
  10. Flag panicle med følgende oplysninger: den dato, kastrering, varighed og den temperatur, hvor svækkelsen udføres.
  11. Når panicle er trimmet, fjerne alle havefræsere af hver plante for at sikre en omfordeling af flere ressourcer til udvikling af de vigtigste gren.

3. Kastrering med varmt vand-dypning - Dag 1

  1. Indstil vandbad til 48 ° C ± 0,1 ° C til varmebehandling.
  2. Bøj forsigtigt klippede toppe og dyppe dem i varmt vand ved 48 ° C i 3-6 min. Vær forsigtig ikke at bryde stilk gren.
  3. Omkring 3-4 toppe kan dyppes together på én gang, og samtidig opretholde tilstrækkelig plads mellem toppe for ensartet fordeling af varme. Det er vigtigt at oversvømme hele panicle i varmt vand under varmebehandling. Flaget blad (bladet ses under den gren, der giver næringsstoffer til panicle), bør ikke komme i kontakt med varmt vand for at forhindre varmeskader på blad væv.
  4. Når kastrering er udført i den ønskede tid, fjerne toppe fra vandbadet og forsigtigt ryste vandet fra panicle.
  5. Placer en skræddersyet mikro-perforeret brød taske til fuldt ud at dække den kastreret panicle og fastgør den med et twist-tie. Mikro-perforerede brød poser kan tilpasses i henhold til størrelsen af ​​den gren (inkluderer i video).
  6. Placer planterne tilbage i kammeret vækst indtil den følgende dag.

4.. Crossing / bestøvning efter Kastrering - Dag 2 og Dag 3

  1. På 9:00 på dag 2 og dag 3, flytter hun (kastreret) og male forældre fra kammeret vækst til laboratoriet (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21,79% ± 1,15%) for at udføre kors.
  2. Observere og tilføje en anden rød prik til blomster, der har blomstrede, eller blomstrer med en rød permanent markør. Optag det samlede antal blomstrede blomster pr panicle.
  3. Notér datoen for bestøvning og navnet på den mandlige forælder på tag for at holde styr på, hvad kors er udført.
  4. Overhold den maksimale tid anthesis i mandlige forældre. Under vores kammer betingelser (figur 1) blomster på toppe af den mandlige forælder begynder synkron åbning omkring 10:10. Fra tidspunktet for åbningen af ​​blomster, vil den fuldstændige exsertion af støvknapper og frigivelse af pollen opstå efter 20 min.
  5. Den ideelle scene til bestøvning er det stadium, hvor pollen fra den mandlige forælder er frigivet. Blomsterne lukker efter 20 min fra pollen udgivelse. Derfor varigheden for anthesis er ca 40 min fra tidspunktet for åbningen af ​​flowers. Farven af ​​pollen ændringer fra gullighvid til brun i løbet af en periode på omkring 30 minutter efter blomsten lukker.
  6. Start bestøvning øjeblikkeligt, når gullighvide støvknapper er synlige på blomster af den mandlige forælder. Bestøvninger udføres på dag 2 og dag 3 ved hjælp af en af ​​de tre teknikker:
    1. Panicle-til-panicle bestøvning: ved hjælp af en fritliggende panicle som den mandlige, forsigtigt gnide panicle sammen med den kastreret panicle at lette bestøvning og kassere den mandlige panicle at undgå forurening. Gentag bestøvning processen indtil hver kastreret panicle er blevet bestøvet af 2-3 toppe.
    2. Også på et andet-til-stigmatisering bestøvning: ved hjælp af pincet plukke en blomst, der er blomstrende med gullige hvide støvknapper eller pluk støvknapper og fysisk røre stigmatisering af blomsten på den kvindelige forælder. Brug en blomst fra den mandlige forælder at bestøve en blomst på kastreret panicle. Gentag bestøvning pprocesmodeller indtil hver stigmatisering på den kastreret panicle er blevet bestøvet af nogle få (ca. 2-3) blomster / støvknapper. Iført en visir forstørrelsesglas vil gøre bedre synlighed til at udføre bestøvning.
    3. Mellem bestøvninger forskellige mandlige forældre, dyppe tangen i 95% ethanol efterfulgt af aftørring med Kimwipes at undgå forurening som følge af fremførsel af pollen mellem forskellige kors.
    4. Panicle binding: Efter kastrering, skal du vælge 3-4 toppe på det mandlige forælder, der blomstrer den følgende dag. Binde dem sammen med den kastreret panicle af den kvindelige forælder hjælp twistlukker. Placer kastreret panicle lidt under panicle af den mandlige forælder. Placer en pergamyn pose over toppe og fastgør posen i bunden med en papirclips. Dette kan være afsluttet på dag 2, når toppe af den mandlige forælder starte anthesis.
    5. I den blomstrende tid om morgenen på dag 2 og dag 3, svirp eller ryste pergamyn pose til Facilitate bestøvning. Fortsæt med at svirpe eller ryste toppe hver 15 min i hele varigheden af ​​anthesis i morgen (mellem 9.00 11: 00:00). Fjern toppe af den mandlige forælder efter bestøvning og mærke den modsatte side af de blomstrede blomster på kastreret panicle. Registrere antallet af blomstrede blomster på gren af ​​hver hun forælder.
  7. Når bestøvningen er udført, skal du placere en skræddersyet mikro-perforeret brød pose til at dække panicle af den kvindelige forælder og sikker på foden ved hjælp af en twistlukker efter bestøvning indtil frø høst.

5.. Seed Høst

  1. Harvest frø efter 2 uger (14-16 dage) fra den dag, bestøvning. Placer tag i samme pose af frøene. Frø, der har røde markeringer på begge sider repræsenterer de frø, der førte fra den kontrollerede genetiske kors. Disse forventes at være udkrydsning afkom.
  2. Kassér alle frø uden røde markeringer, da de repræsentererfrø, der skyldes nyudviklede blomster efter kastrering. Frø med røde aftegninger kun på den ene side vil sandsynligvis repræsentere froe fra selvbestøvning, da de ikke var blomstrende på det tidspunkt, hvor de kontrollerede krydser blev udført.
  3. Tørre frø ved 30 ° C i 2 dage i et frø tørretumbler. Store tørrede frø i laboratoriet (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21,79% ± 1,15%) eller i et frø kammer (T: 4.0 ° C ± 1,0 ° C, RH: 20% ± 1%).

Representative Results

I denne undersøgelse, brugte vi sekventeret S. viridis tiltrædelse A10.1 som den kvindelige forælder, og en transgen S. viridis linje (også A10.1) indeholdende GUS-reportergenet 4 som faderindividet for alle bestøvninger. En optimeret vækstregime blev anvendt til at synkronisere blomstring, som vist i figur 1. Vi har testet en række kombinationer af temperatur og tid for varmebehandling for kastrering og observerede, at omkring 40-80% af blomsterne tilbageholdt på stækket panicle blomstrede på 2. dagen, mens resten blomstrede på den 3. dag (figur 2). Men hvis varmebehandling var for svær, for eksempel 49 ° C i 4 min, meget få eller ingen blomster blomstrede på 2. dagen. Krydsbestøvning blev udført på 2. eller 3. dag efter kastrering, som var afhængig af spidsbelastningen af anthesis af mandlige forældre.

Det var obsered at unge blomster fortsatte med at udvikle sig efter kastrering, modnet og selvbestøvende 3-6 dage efter kontrollerede bestøvninger. Efter 7-10 dage efter bestøvning, blomster, der er hvide i farven er synlige på gren. Disse hvide blomster er ubefrugtede, enten på grund varmeskader eller dårlig bestøvning. Samtidig, blomster, der med succes er blevet bestøvet begynder at bære mørke frø og begynde brud efter 14 dage. De mørke frø med røde markeringer høstes på den 14. dag efter bestøvning klart kunne skelnes fra frøene uden røde markeringer, der var stadig grøn og ikke splintres. Hvis høsten forsinkes, anthecium af frøene med og uden røde markeringer både vende mørke, hvilket gør det vanskeligt hurtigt at skelne mellem frøene med røde markeringer i høstede puljer.

For at optimere protokol passage flere varmebehandling blev udført som opsummeret i tabel 1. Et gennemsnit på0-10 frø / panicle blev udvundet fra forskellige varmebehandling eksperimenter. Efter høst blev frøene tørret ved 30 ° C i 2 dage i et frø tørretumbler efterfulgt af fjernelse af anthecium hjælp af en anthecium remover. Efter anthecium blev fjernet, formodede F1 frø farvet med GUS-farvning opløsning og udkrydsning afkom farves blå farve i 1-2 timer (figur 2F). Baseret på disse resultater, anbefaler vi en varmebehandling på 48 ° C i 3-6 min. Derudover anbefaler vi, at kors udføres på både dag 2 og dag 3 efter kastrering.

For at undersøge effektiviteten af denne teknik i at udføre krydsninger med andre Setaria tiltrædelser eller arter, krydser mellem S. viridis A10.1 og otte forskelligartede S. viridis tiltrædelser og et S. pumila tiltrædelse blev udført. Selv dage til blomstring varierede blandt de tiltrædelser fandt vi, at blomster af alle otte S. viridis tiltrædelser og et S.pumila tiltrædelse begynde åbning mellem 10:00 til 11:00 med et højdepunkt åbning tid på 10:20 til 11:00, efter at predawn kuldebehandling. Dette indikerer, at den predawn kuldebehandling kan anvendes til forskellige Setaria tiltrædelser. En varmebehandling af 48 ° C i 5-6 min blev anvendt til at svække S. viridis A10.1 der blev anvendt som moderindividet for alle krydsninger udføres. Vi genvundet fra et til 12 frø fra krydsninger mellem A10.1 og tre af de forskellige S. viridis tiltrædelser og seks frø fra en enkelt krydsning mellem S. viridis A10.1 og en enkelt S. pumila tiltrædelse. Men på dette tidspunkt, vi ikke har opgjort, hvis disse frø resulterede fra en vellykket testcross eller var resultatet af selv-forurening. Uanset disse foreløbige resultater tyder på, at de anvendte vækstbetingelser for S. viridis A10.1 kan anvendes til at generere kors med forskellige S. viridis tiltrædelser og eventuelt andre arter af Setaria.

Temp varmebehandling (° C) Time varmebehandling (min) # kors Gsn. # Af blomster efter trim Day of bestøvning (dagen efter emasc) Gsn. # frø (rød) / panicle (gennemsnit) Gsn. % Gus (+) / frø (rød) Gsn. # Hyb frø (Gus +) Min # Hyb frø Max # Hyb frø
47 10 2 27 2. dag 0 0 0 0 0
48 3 3 36 2. dag 5. 60 3 1 5.
4. 3 25 3. dag 10 50 5. 3 7
5. 8. 25 2. dag 5. 60 3 1 6
6 3 25 2. dag 4. 75 3 0 4.
7 4. 24 2. dag 3 33 1 0 4.
7 1 25 3. dag 4. 75 3 N / A N /A
49 1 3 23. 2. dag 5. 25 1 0 2
2 7 26 2. dag 8. 25 2 0 4.
3 5. 22 2. dag 0 0 0 0 1
4. 4. 25 2. dag 0 0 0 0 0

Tabel 1. Optimering af en varmebehandling til kastrering. Resultater af ændring både temperatur og tid for varmebehandlingen. Bestøvninger blev udført én (2. dag), eller to dage (3. dag) efter kastrering og succesfulde udparringer skernehus med GUS-farvning

Figur 1
Figur 1. Optimeret vækst kammer forhold med en pre-dawn kuldebehandling. Temperatur og frister for optimal vækst og synkront blomst produktion bliver vist. Grønne og røde pile viser optimal vindue til at udføre kors og kastrering, hhv.

Figur 2
Figur 2. Forberedelse til passage og GUS-farvning af udkrydsning afkom panicle. (A) en gren af Setaria viridis A10.1 før trimning, viser ca 1/10 af blomster åbnet. De fire sektioner og retningsbestemthed i progression af anthesis langs panicle vises. (C) En kastreret panicle efter fjernelse af børster. (D) En kastreret panicle på dag 2 efter kastrering, viser blomster, der blomstrer (billede taget på 10:30 AM). (E) en gren af den mandlige forælder (transgene Setaria viridis A10.1 linje bærer en β-glucuronidase (GUS) reporter-gen), som er blomstrende efter pre-dawn behandling (billede taget kl 10:30). A gennem E skalapanelerne = 1 mm. (F) Formodede outcross afkom efter GUS-farvning i 2 timer efterfulgt af distaining i 70% (v / v) ethanol. De to frø fra højre er negative og positive kontroller, hhv.

Figur 3
Figur 3. Rutediagram af protokol En skematisk fremstilling af major trin involveret i at udføre S. viridis krydser.

Discussion

Betydningen af ​​pre-dawn behandling

For at opnå en høj frekvens af udkrydsning afkom er det vigtigt at have meget synkron anthesis af mandlige og kvindelige forældre. I første omgang, vi cyklede temperatur og lys regimer (31 ° C/22 ° C, dag / nat) og brugte S. viridis tiltrædelse A10.1 for alle bestøvninger. Under disse betingelser, de fleste blomster åbne tidligt om morgenen, før temperaturen stiger til 31 ° C, selv om et par blomster åben tilfældigt mellem 8:00 8: 12:00. Tidligere undersøgelser i S. Italica indikere, at tidspunktet på dagen, sted og årstid bidrager til variation i anthesis 7,15,16. Siles et al. 6 bemærkes, at anthesis var forbundet med hurtige ændringer i temperatur og fugtighed, men ikke med lav temperatur og høj luftfugtighed, per se, som konkluderet i tidligere undersøgelser 7,15. Derfor vi ansat en pre-dawn kuldebehandling på 15 ° C i 30 min (fra 8:30-9: 12:00) at efterligneden naturlige pre-dawn tilstand. Denne pre-dawn kuldebehandling hjulpet i synkronisering anthesis i forældrene. Vi observerede, at på trods af at sætte kammeret for relative luftfugtighed på 50%, den relative fugtighed inden i kammeret steg til et niveau på over 70%, idet temperaturen faldt fra 22 ° C til 15 ° C og fortsatte med at ligge over 70%, indtil temperaturen efterhånden steg til 31 ° C efter 9:30. På 9:00, kastreret kvindelige forældre og planter af mandlig forælder bringes til laboratoriet (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21,79% ± 1,15%). Blomster af de mandlige forældre begynde at åbne omkring 10:10, og bestøvning kan udføres kl 10:30-11: 12:00. En detaljeret liste over alle reagenser og udstyr er angivet i tabel 2.

Betydningen af ​​forberedelse panicle for kastrering

Under kammeret forhold i denne undersøgelse (figur 1), varigheden af primære gren blomstrende varierede fra2-3 dage. Typisk blomster placeret på den distale midten af blomsterstanden (figur 2A) åben første og åbning forud proksimalt og distalt. Det ideelle antal af blomster, der skal lagres på panicle er 20-30. Der bør udvises forsigtighed under fjernelse af umodne blomster, så at der kun veludviklede blomster (den øverste blomst eller største på spikelet 17) tilbage. Mærkning med rød markør på begge sider af blomsterne er med til at skelne effektivt formodede outcross afkom fra frø fra nyudviklede blomster efter kastrering. Desuden er det vigtigt at lade børsterne på toppe før kastrering at beskytte buketter fra omfattende varme skader, men som en mulighed, at de kan fjernes efter kastrering hjælp foråret saks for at lette bestøvning, især når en gren bindende teknik er ansat (figur 2C og 2D).

Optimeret temperatur end behandlingsvarighed til varmt vand behandling

Grundlaget for kastration gennem varmt vand dypning at pollen er mere følsom over for varme end Stigmatiseredes overflade. Varighed og temperatur varmebehandlinger kan dog variere blandt Setaria arter og tiltrædelser. Generelt vil en højere temperatur med en kortere behandlingstid eller en lavere temperatur med en længere behandlingstid have samme effekt på kastrering. Det er blevet rapporteret, at en varmebehandling på 42 ° C i 20 minutter 10 eller 47 ° C i 10 minutter 14 afsmeltet S. italica pollen ikke-levedygtige, men effektiviteten af disse behandlinger blev ikke bestemt. Vi har udviklet vores protokol efter den hypotese, at under en optimeret temperatur og varighed af behandlingen, pollen af ​​alle blomsterne tilbageholdes på den kvindelige forælder vil være ikke-levedygtige, mens støvfang vil være modtagelige. Men efter at sammenligne og analysere virkningen af ​​flere temperaturer ogbehandlingsperioder (tabel 1), fandt vi, at følsomheden over for varmebehandling varierer blandt blomsterne tilbageholdt på hver gren, og dermed er det svært helt at eliminere frø som følge af selvbestøvning. Vi konkluderer, at effektiviteten af fremstilling af udkrydsning afkom, er størst, når behandlinger udføres ved 48 ° C i 3-6 minutter i S. viridis tiltrædelse A10.1.

Peak tid anthesis og krydsbestøvning

Når blomsterne nå modenhed og er ved at åbne, støvknapper er gullighvide og pollen er udgydt så snart støvknapper exsert fra blomsterne 8. Støvknapper gradvist blive brune efter pollen er udgydt som blomsterne begynder at lukke. Når frigivet, levedygtigheden af ​​pollen er ukendt. Derfor er det vigtigt at anvende pollen fra åbning eller frisk åbnet blomster på hanindividet så hurtigt som muligt. Under vores kammer betingelser (figur 1), størstedelen af blomstrs af de mandlige forældre begynder at åbne ved 10:10 og de åbnede blomsterne kaste pollen på 10:30. Således ønskelig vindue for at udføre bestøvning er fra 10:30 til 11:00. Stoevfangenes forbliver uden avnerne efter blomster tæt og kan være modtagelig for pollen. Det er tidligere blevet observeret, og bekræftet i S. italica at støvfang er modtagelige for omkring 48 timer efter blomst åbning af Siles et al. 6, så det er vigtigt at posen toppe efter varmebehandling og efter udførelse af kontrollerede kors. Som diskuteret ovenfor, anbefaler vi præsterer bestøvninger på både Dag 2 og Dag 3 efter kastrering.

Metoder til bestøvning

Vi sammenlignede effektiviteten af ​​tre bestøvning teknikker. Hvis blomstrende blomster ikke er begrænsende, panicle-til-panicle bestøvning er den mest effektive teknik og vil give et større antal udkryds afkom. Hvis blomstrende toppe er begrænsende, en højere frekvens af outcross afkom vil blive produceret, når støvknap-til-stigma metode anvendes. Vi har fået udkryds afkom fra begge metoder med succes. Den "bindende toppe" Metoden har været brugt i at krydse S. Italica 6, men vi fandt denne metode for at være den mindst effektive metode som tidsvindue for pollen udgydelse af den mandlige forælder er kort. Desuden er der mindre kontrol over bestøvning og børstehårene på S. viridis toppe kan også hindre bevægelsen af pollen på Stigmatiseredes overflade.

Seed høst, tørring og opbevaring

Efter høsten skal frø tørres ved 30-33 ° C i 2 dage. Anthecium bør fjernes for GUS-farvning, hvis det er nødvendigt. Frø skal opbevares på et tørt, køligt sted (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21,79% ± 1,15%) for kortvarig opbevaring (mindre end to år) eller i et frø kammer (T: 4,0- 10 ° C ± 1,0 ° C, RH: 20% ± 1%) for langtidsopbevaring.Fattige opbevaringsforhold kan resultere i lav rentabilitet satser 8. Vi har observeret, at spiring sats på S. viridis A10.1 er cirka 5%, når sået 4 dage efter høst, men kan øges til 90-96% efter opbevaring i laboratoriet (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21,79% ± 1,15%) til 110 dage efter høst, efterfulgt af en tre-dages lagdeling ved -80 ° C til at bryde frø hviletilstand. Til stratificering ved -80 ° C, kan tørre frø anbringes i en lufttæt beholder (fx mikro-centrifugeglas eller en mønt kuvert i en forseglet plastpose) og holdt ved -80 ° C i 3 dage før plantning. Efter 16 måneders opbevaring i laboratoriet (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21,79% ± 1,15%), kan stadig fås spiring procenter af 90-95%. Desuden, for at bryde hvileperioden frø kan tørres ved 30-33 ° C i 2 dage efter høst, og derefter givet tre dages lagdeling ved -80 ° C efterfulgt af fjernelse afanthecium før plantning. Efter disse behandlinger kan der opnås frøspiring på op til 33%.

Fordele, begrænsninger og eventuelle ændringer

Her giver vi den første standard-protokol til at udføre kors i S. viridis A10.1 ved hjælp af en varmebehandling til kastrering. I modsætning til fysisk kastrering, denne protokol er mindre invasiv og relativt let at etablere sig i et laboratorium. Det tager normalt omkring 15 minutter for at trimme en gren og omkring 15 toppe kan trimmes og krydsede / person / dag. Antages et gennemsnit på 3-5 udkryds afkom / panicle kan inddrives under optimerede betingelser, kan i alt 45-75 udkryds afkom blive produceret af en person på en enkelt dag. Endvidere kan denne teknik anvendes til sender i andre Setaria arter, selv om yderligere optimeringer vil være sandsynligt. Hvis væksten kammer pladsen er begrænset, kan planterne dyrkes i drivhus eller vækstkamre uden en pre-dawn treatment indtil panicle opstår, før de flyttes til de optimerede kammer forhold.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgements

Vi takker Sankalpi Warnasooriya og Amy Humboldt til kritisk læsning og redigering af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Department of Energy (DE-SC0008769) og National Science Foundation (IOS-1.127.017).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scissors, spring World Precision Instruments, Inc 14126
Forceps, Dumostar Biology Polished SPI Supplies TD5BP-XD
Surgical Scissors F.S.T (Fine Science Tools) 14005-12
Europack Clear Polypropylene Micro-Perforated Crusty Bread Bags 6"x28" http://www.pjpmarketplace.com 361001
Flats T.O. Plastics 715401C
metro mix 360 Hommert International 10-0356-1
Jack's 15-16-17 Hommert International 07-5925-1
Kimwipes VWR International 34120
Sharpie Ultra Fine Point Permanent Markers, Red Staples 37002
Donegan DA-10 OptiVisor Headband Magnifier, 3.5x Magnification, 4" Focal Length Amazon DA-10, B0015IP380
12"24/7 Packaging Hand Impulse Sealer Heat Seal Machine Poly Sealing Free Element Grip Amazon N/A
water bath VWR scientific Model: 1166
BDW walk in plant growth chamber Conviron BDW 40

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bennetzen, J. L., et al. Reference genome sequence of the model plant Setaria. Nat Biotechnol. 30, 555-561 (2012).
  2. Zhang, G., et al. Genome sequence of foxtail millet (Setaria italica) provides insights into grass evolution and biofuel potential. Nat Biotechnol. 30, 549-554 (2012).
  3. Li, P., Brutnell, T. P. Setaria viridis and Setaria italica, model genetic systems for the Panicoid grasses. J Exp Bot. 62, 3031-3037 (2011).
  4. Brutnell, T. P., et al. Setaria viridis: a model for C4 photosynthesis. Plant Cell. 22, 2537-2544 (2010).
  5. Doust, A. N., Kellogg, E. A., Devos, K. M., Bennetzen, J. L. Foxtail millet: a sequence-driven grass model system. Plant Physiol. 149, 137-141 (2009).
  6. Siles, M. M., Baltensperger, D. D., Nelson, L. A. Technique for artificial hybridization of foxtail millet [Setaria italica (L.) Beauv.]. Crop Sci. 41, 1408-1412 (2001).
  7. Li, H. W., Meng, C. J., Liu, T. N. Problems in the Breeding of Millet (Setaria Italica (L.) Beauv.). Agron. J. 27, 963-970 (1935).
  8. Willweber-Kishimoto, E. Interspecific relationships in the genus setaria. Contributions from the Biological Laboratory, Kyoto University. 14, 1-41 (1962).
  9. Chang, L. P. Studies on flowering and hybridization technique in Setaria. Nungyeh-hsueh Pao (Jour. Agric.) Act. Agric. Sin. 9, 68-76 (1958).
  10. Darmency, H., Pernes, J. Use of wild Setaria viridis (L.) Beauv. to improve triazine resistance in cultivated S. italica (L.) by hybridization. Weed Research. 25, 175-179 (1985).
  11. Sakai, S., Shin, C. Artificial hybridization of Setaria italica by hot water treatment. Bull. Fac. Agric. Kagoshima Univ. 28-37 (1955).
  12. Malm, N. R., Rachie, K. O. Setaria millets: A review of the world literature S.B. University of Nebraska, Lincoln. 513-529 (1971).
  13. Miyaji, Y., Samura, T. The influence of atmospheric humidity on flowering and pollination in Setaria italica. Bull. Fac. Agric. Kagoshima Univ. 1-6 (1954).
  14. Wang, Z. M., Devos, K. M., Liu, C. J., Wang, R. Q., Gale, M. D. Construction of RFLP-based maps of foxtail millet, Setaria italica (L.). P. Beauv. Theoret. Appl. Genetics. 96, 31-36 (1998).
  15. RangaswamiAyyangar, G. N., Narayanan, T. R., Seshadri Sarma, P. Studies in Setaria italica (Beauv.), the Italian millet. Part I. Indian J. Agr. Sci. 561-571 (1933).
  16. Heh, C. M., Mei, T. F., Yang, S. S. Anthesis of Millet, Setaria Italica (L.) Beauv. Agron. J. 29, 845-853 (1937).
  17. Doust, A. N., Devos, K. M., Gadberry, M. D., Gale, M. D., Kellogg, E. A. The genetic basis for inflorescence variation between foxtail and green millet (poaceae). Genetics. 169, 1659-1672 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics