Metodi per l'esecuzione di Croci nel

Environment
 

Summary

Abbiamo sviluppato una metodologia per l'esecuzione di croci in viridis Setaria viridis (S.). Il metodo prevede la potatura pannocchia prima di un trattamento con acqua calda per uccidere polline vitale. Croci sono eseguite seguendo un regime di crescita ben controllata e in genere portato al recupero di 1-7 impollinazione incrociata seme / s per pannocchia.

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Jiang, H., Barbier, H., Brutnell, T. Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses. J. Vis. Exp. (80), e50527, doi:10.3791/50527 (2013).

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Abstract

Setaria viridis è un sistema modello emergente per C 4 erbe. Esso è strettamente legato al feed bioenergia magazzino verga e il raccolto di grano coda di volpe miglio. Recentemente, il genoma 510 Mb di coda di volpe miglio, S. italica, è stato sequenziato 1,2 e una sequenza del genoma 25x copertura del erbacce relativo S. viridis è in corso. S. viridis ha una serie di caratteristiche che lo rendono un sistema genetico modello potenzialmente eccellente tra cui un tempo rapido di generazione, bassa statura, semplici esigenze di crescita, produzione di sementi prolifico 3 e sistemi sviluppati sia transiente e stabile trasformazione 4. Tuttavia, la genetica di S. viridis è ampiamente esplorato, in parte, a causa della mancanza di metodi dettagliati per lo svolgimento croci. Ad oggi, nessun protocollo standard è stato adottato che permetterà una rapida produzione di sementi da incroci controllati.

La pressione del protocolloENTED qui è ottimizzato per l'esecuzione di incroci genetici in S. viridis, A10.1 adesione. Abbiamo impiegato un semplice trattamento termico con acqua calda per emasculation dopo la potatura la pannocchia di mantenere 20-30 cimette e l'etichettatura dei fiori per eliminare i semi derivanti dai fiori di nuova concezione dopo la castrazione. Dopo aver testato una serie di trattamenti termici a temperature permissive e variando la durata di immersione, abbiamo stabilito una temperatura ottimale e l'intervallo di tempo di 48 ° C per 3-6 min. Utilizzando questo metodo, un minimo di 15 croci può essere eseguito da un solo operatore per giorno e una media di 3-5 progenie out-cross per pannocchia può essere recuperato. Pertanto, una media di 45-75 progenie out-cross può essere prodotto da una persona in un solo giorno. Attuazione ampio di questa tecnica faciliterà lo sviluppo delle popolazioni di linea inbred ricombinanti di S. viridis X S. viridis o S. viridis X S. italica, mappare le mutazioni attraverso la massa seanalisi gregant e la creazione di mutanti di ordine superiore per l'analisi genetica.

Introduction

S. viridis è un NADP-ME sottotipo C 4 erba strettamente legato al feed bioenergia magazzino panico verga (NAD-ME sottotipo), il raccolto di grano coda di volpe miglio, e la agricolo erbaccia guinea erba 5. Il genoma 510 Mb di forma coltivata di Setaria, S. italica, è stato recentemente sequenziato 1,2 e una sequenza del genoma 25x copertura del relativo erbacce, S. viridis, è in corso (inedito). S. viridis ha una serie di caratteristiche che lo rendono un sistema genetico modello potenzialmente eccellente tra cui un tempo rapido di generazione, bassa statura, semplici esigenze di crescita e produzione di sementi prolifico 3. È importante sottolineare che i metodi sono stati recentemente sviluppato sia per trasformazione transiente e stabile di S. viridis che prevede la possibilità di creare piante transgeniche 4. Tuttavia, un serio ostacolo allo sviluppo di strumenti genetici per S. viridis è la sua recalcitrance a outcrossing. Ad oggi, nessun protocollo standard è stato pubblicato che permetterà una rapida produzione di sementi da incroci controllati.

Incroci genetici a S. italica sono di solito eseguite da castrazione attraverso la rimozione delle antere dai fiori 6,7,8 o attraverso il trattamento termico di fiori dei genitori femminili 9-11. A seguito di questi trattamenti, antere o pannocchie di fiori non trattati / genitori maschi sono leggermente abrase contro stimmi liberando il polline. In evirazione, antere vengono rimossi con una pinza sottile subito dopo il fiorellino si apre e l'antera sta cominciando a exsert, ma non ha ancora emesso polline 6-8. Tra le sfide di questo secondo metodo è la difficoltà nell'esecuzione emasculation in un intervallo di tempo stretto tra l'apertura e polline capannone del fiore. La durata di apertura e chiusura di un unico fiore varierà a seconda delle condizioni ambientali e di adesione, e può variare da 7 min <sup> 6-2,5 ore 12 in S. italica. Poiché spargimento di polline si presenta come antere exsert dal fiorellino, antere devono essere rimossi con attenzione e in modo rapido, e quindi, è difficile evitare la contaminazione a causa di auto-impollinazione. Inoltre, come impollinazioni vengono eseguite immediatamente dopo castrazione, il numero di incroci che possono essere eseguite per persona / al giorno è limitato.

Come metodo alternativo, pannocchie mature possono essere immersi in acqua calda per riscaldare-uccidere sviluppo grani di polline 9,10,13,14 con il vantaggio di eseguire croci su un gran numero di pannocchie. Tuttavia, la temperatura e la durata del trattamento termico varia ampiamente da diversi esperimenti (ad esempio 47 ° C per 10 min 14 e 42 ° C per 20 min 10). Inoltre, nessuna analisi sistematiche sull'efficacia di emasculations calore mediata sono stati pubblicati. Così, uno standard e metodo semplice per eseguire incroci genetici in S. viridis potrebbe accelerare notevolmente lo sviluppo delle risorse genetiche e la creazione di S. viridis come sistema modello all'interno della comunità di ricerca.

Riportiamo lo sviluppo e l'ottimizzazione di un protocollo standard per l'esecuzione di incroci genetici in S. viridis. Le piante sono coltivate in ambienti controllati per sincronizzare lo sviluppo del fiore e aumentare la riproducibilità della procedura. Croci sono eseguiti utilizzando una S. transgenico linea viridis come il genitore maschio contenente il gene GUS giornalista 4 per facilitare l'identificazione di incroci genetici controllate successo. Il transgene GUS è guidata da un promotore ubiquitina riso che consente il punteggio di semi F1 immediatamente dopo la raccolta e quindi fornisce un saggio qualitativo facile determinare l'efficienza di castrazione e impollinazione. Abbiamo impiegato un semplice trattamento termico con acqua calda per emasculation accompagnati da una etichettatura di fiori che sono stati emasculated per eliminare i semi derivanti dai fiori di nuova concezione dopo la castrazione. Dopo aver testato una serie di trattamenti termici a temperature permissive e variando la durata di immersione in acqua calda, abbiamo stabilito una temperatura e tempo ottimali durata di 48 ° C 3-6 min. Un pre-alba trattamento a freddo è stato trovato per promuovere all'antesi sincrono in entrambi i genitori al fine di facilitare l'impollinazione incrociata. Abbiamo anche discusso i passaggi chiave del protocollo e la futura applicazione di questo metodo ad altre adesioni Setaria.

Protocol

1. Crescita di S. viridis

  1. Impostare le condizioni della camera di crescita a 31 ° C/22 ° C (giorno / notte), 12 ore light/12 ore scuro, il 50% di umidità relativa con un trattamento prima dell'alba di 15 ° C 8:30-09:00 AM. (Figura 1). In queste condizioni, S. viridis A10.1 dura circa 21-22 giorni dalla semina seme al antesi.
  2. Riempire appartamenti (4 x 9 celle) con Metro Mix 360 e rimuovere una cella per l'irrigazione.
  3. Acqua leggermente nebbia sulla superficie del suolo.
  4. Seminare sulla superficie del suolo, un seme per cellula.
  5. Coprire i semi con uno strato di terreno (circa 0,5 cm)
  6. Nebbia la superficie del suolo e delle acque appartamenti dal basso. Tenere annaffiare dal basso dopo la semina di sementi.
  7. Per ogni croce che verrà eseguito almeno tre impianti sarà utilizzato come genitori di sesso femminile e nove piante da utilizzare come genitori di sesso maschile. Seme di semina deve essere scaglionato come tutte le piante non fioriranno lo stesso giorno. Seed sowing è raccomandato ogni giorno per un periodo di tre giorni.
  8. Innaffiare le piante 1-2 volte al giorno, che dipende dalle dimensioni degli impianti e delle condizioni del suolo. L'acqua in eccesso nel suolo non è favorevole per la crescita ottimale delle piante, e può portare alla crescita di funghi nel terreno e danneggiamento del tessuto fogliare.
  9. Fecondare le piante due volte a settimana, utilizzando Jack 15-16-17 ad una concentrazione di 100 ppm.

2. Taglio ed etichettatura delle Grappolo Prima di evirazione - Day 1

  1. Nel pomeriggio o la sera prima di impollinazione, spostare le piante dalla camera di crescita in laboratorio (temperatura (T): 24.06 ° C ± 0,13 ° C, umidità relativa (RH) 21.79% ± 1,15%).
  2. Selezionare le pannocchie primarie dover 1 fiore a 1/3 di fiori sulla pannocchia che hanno già fiorito.
  3. In questo studio i quattro domini all'interno della pannocchia sono definite come segue (Figura 2A; punta, metà distale, medio prossimale e base).
  4. Idealmente, choosea pannocchia con 1-5 fiori che hanno fiorito, tagliò la punta della pannocchia (estremità distale), e rimuovere tutti i fiori nelle sezioni centrali e di base prossimale utilizzando forbici a molla o una pinza sottile.
  5. Se una pannocchia ha circa 1/10 a 1/5 di fiori che hanno fiorito, tagliare la punta e tagliare fiori dalla base della pannocchia, solo mantenere la sezione inferiore della metà distale e la parte superiore del mezzo prossimale per ulteriore rifilatura.
  6. Se una pannocchia ha circa 1/4 a 1/2 di fiori che hanno fiorito, tagliare la parte centrale distale e conserverà solo la sezione centrale prossimale per ulteriore rifilatura.
  7. Usare le forbici chirurgiche per tagliare leggermente le setole.
  8. Rimuovere tutti i fiori che hanno fiorito e tutti i fiori immaturi che escono circa 20-30 fiori / pannocchia che sono uniformemente distribuiti nella regione (Figura 3). Pratica cura per mantenere le setole della regione che saranno impollinate al fine di proteggere gli ornamenti da possibili danni dovuti al calore.Per ogni spighetta, mantenere il fiorellino più maturo superiore. Il maggior fiorellino superiori avranno una maggiore probabilità di antesi al momento dell'impollinazione (Figura 2B).
  9. Segnare un lato di ogni fiore con un pennarello indelebile rosso e registrare il numero di ornamenti sulla pannocchia (Figura 2B).
  10. Bandiera della pannocchia con le seguenti informazioni: la data di evirazione, la durata e la temperatura alla quale la castrazione viene eseguita.
  11. Una volta che la pannocchia è tagliata, rimuovere tutte le frese di ogni pianta per garantire la ridistribuzione delle maggiori risorse per lo sviluppo della pannocchia principale.

3. Evirazione con acqua calda-dipping - Day 1

  1. Impostare bagnomaria a 48 ° C ± 0,1 ° C per il trattamento termico.
  2. Piegare delicatamente le pannocchie tagliate e immergeteli in acqua calda a 48 ° C per 3-6 min. Fare attenzione a non rompere il gambo della pannocchia.
  3. Circa 3-4 pannocchie possono essere immersi together contemporaneamente, mantenendo spazio sufficiente tra le pannocchie per la distribuzione uniforme del calore. E 'essenziale per immergere l'intera pannocchia in acqua calda durante il trattamento termico. La foglia bandiera (la foglia sottende la pannocchia che fornisce i nutrienti per la pannocchia) non deve venire a contatto con acqua calda per evitare danni dovuti al calore al tessuto fogliare.
  4. Una volta che l'evirazione viene eseguita per la durata desiderata, rimuovere le pannocchie dal bagnomaria e delicatamente scrollarsi di dosso l'acqua dalla pannocchia.
  5. Posizionare un sacchetto del pane microforata personalizzato per coprire completamente la pannocchia evirato e fissarlo con un twist-cravatta. Sacchetti del pane di micro-perforati possono essere personalizzati in base alle dimensioni della pannocchia (comprendono in video).
  6. Mettere le piante di nuovo in camera di crescita fino al giorno seguente.

4. Crossing / impollinazione dopo evirazione - Day 2 e Day 3

  1. Alle 09:00 il giorno 2 e il giorno 3, spostare femmina (castrato) e male genitori dalla camera di crescita al laboratorio (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, UR: 21.79% ± 1,15%) per eseguire croci.
  2. Osservare e aggiungere un altro punto rosso a fiori che hanno fiorito o sono in fiore con un pennarello indelebile rosso. Registrare il numero totale di fiori sbocciati per pannocchia.
  3. Registrare la data di impollinazione e il nome del genitore maschio sulla tag per tenere traccia di ciò che vengono eseguite croci.
  4. Osservare il tempo di picco di antesi nei genitori maschi. Nelle nostre condizioni camera (Figura 1) fiori sulle pannocchie del genitore maschio cominciano apertura sincrona intorno 10:10. Dal momento dell'apertura dei fiori, la exsertion completa di antere e il rilascio di polline avverrà dopo 20 min.
  5. Il palcoscenico ideale per l'impollinazione è la fase in cui il polline del genitore maschio viene rilasciato. I fiori si chiudono dopo 20 min dal rilascio del polline. Pertanto, la durata per antesi è di circa 40 minuti dal momento della apertura di flussoers. Il colore del polline cambia da bianco giallastro al marrone per un periodo di circa 30 minuti dopo il fiore si chiude.
  6. Inizia subito impollinazione volta antere bianche giallastre sono visibili sui fiori del genitore maschio. Impollinazioni sono eseguite il giorno 2 e giorno 3 utilizzando una delle tre tecniche:
    1. Pannocchia-to-pannocchia impollinazione: utilizzando una pannocchia distaccato come il maschio, strofinare delicatamente la pannocchia insieme alla pannocchia evirato per facilitare l'impollinazione e scartare la pannocchia maschile per evitare la contaminazione. Ripetere il processo di impollinazione finché ogni pannocchia evirato è stato impollinato da 2-3 pannocchie.
    2. Antera-to-stigma impollinazione: usando pinze scegliere un fiore che sta sbocciando con antere bianco-giallastro o scegli antere e fisicamente toccare lo stigma del fiore sul genitore di sesso femminile. Utilizzare un fiore dal genitore maschio per impollinare un fiore sulla pannocchia evirato. Ripetere l'impollinazione process finché ogni stigma sulla pannocchia evirato è stato impollinato da pochi (circa 2-3) fiori / antere. Indossa una visiera d'ingrandimento renderà migliore visibilità per eseguire l'impollinazione.
    3. Tra le impollinazioni di diversi genitori di sesso maschile, immergere le pinze in etanolo al 95% seguita da strofinando con Kimwipes per evitare la contaminazione a causa di carry-over di polline tra le diverse croci.
    4. Pannocchia vincolante: Dopo evirazione, selezionare 3-4 pannocchie sul genitore maschio che fioriranno il giorno seguente. Legare insieme con la pannocchia evirato del genitore di sesso femminile con un twist-cravatta. Posizionare la pannocchia evirato leggermente al di sotto della pannocchia del genitore maschile. Mettere un sacchetto glassine sopra le pannocchie e fissare la borsa alla base con una graffetta. Questo può essere completata il giorno 2 una volta che le pannocchie del genitore maschio inizio antesi.
    5. Durante il periodo di fioritura del mattino del giorno 2 e il giorno 3, flick o scuotere il sacchetto glassine per Facilbile per consentire l'impollinazione. Continuare a sfogliare o scuotere pannocchie ogni 15 minuti per tutta la durata della antesi la mattina (tra le 09:00-11: 00 AM). Rimuovere pannocchie del genitore maschio dopo l'impollinazione e l'etichetta sul lato opposto dei fiori sbocciati sulla pannocchia evirato. Registrare il numero di fiori sbocciati sulla pannocchia di ciascun genitore di sesso femminile.
  7. Una volta che è stata eseguita l'impollinazione, posizionare un sacchetto del pane microforata personalizzato per coprire la pannocchia del genitore femmina e fissare alla base utilizzando un twist-cravatta dopo l'impollinazione fino al raccolto di semi.

5. Seed raccolta

  1. Semi raccolto dopo 2 settimane (14-16 giorni) a partire dal giorno di impollinazione. Posizionare il tag nello stesso sacchetto dei semi. I semi che hanno macchie rosse su entrambi i lati rappresentano i semi che ha portato dalla croce genetica controllata. Questi dovrebbero essere progenie out-cross.
  2. Eliminare le sementi senza macchie rosse in quanto rappresentanoi semi che derivano da fiori di nuova concezione dopo la castrazione. Semi con segni rossi solo su un lato probabilmente rappresentare i semi derivanti da autoimpollinazione quanto non erano in fiore al momento in cui sono stati eseguiti gli incroci controllati.
  3. Semi secchi a 30 ° C per 2 giorni in un essiccatore seme. Conservare i semi essiccati in laboratorio (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, UR: 21.79% ± 1,15%) o in una camera di seme (T: 4,0 ° C ± 1,0 ° C, umidità relativa: 20% ± 1%).

Representative Results

In questo studio, abbiamo utilizzato la S. sequenziato viridis A10.1 adesione come il genitore di sesso femminile, ed una S. transgenico Linea viridis (anche A10.1) contenente il gene GUS giornalista 4 come genitore maschio per tutte le impollinazioni. Un regime di crescita ottimale è stato usato per sincronizzare fioritura come mostrato in Figura 1. Abbiamo testato diverse combinazioni di temperatura e tempo di trattamento termico per emasculation e osservato che circa il 40-80% dei fiori ritenute su pannocchia castrato fiorì sulla 2 ° giorno, mentre la restante fiorì sulla 3 ° giorno (Figura 2). Tuttavia, se il trattamento termico era troppo grave, per esempio, 49 ° C per 4 min, molto pochi o nessun fiori fiorì sulla ° giorno 2. L'impollinazione incrociata è stata eseguita sulla ° 2 o il 3 ° giorno dopo la castrazione, che era dipendente il momento di picco di antesi dei genitori di sesso maschile.

Era osservatoriEd i fiori che i giovani hanno continuato a svilupparsi dopo evirazione, maturati e di auto-impollinate impollinazioni 3-6 giorni dopo controllati. Dopo 7-10 giorni post-impollinazione, i fiori che sono di colore bianco sono visibili sulla pannocchia. Questi fiori bianchi sono non fecondato dovuti a danni dovuti al calore o scarsa impollinazione. Allo stesso tempo, i fiori che sono state impollinate con successo cominciano a dare i semi scuri e inizia la rottura dopo 14 giorni. Gli scuri semi con segni rossi raccolti il 14 ° giorno dopo l'impollinazione potrebbero essere chiaramente distinti dai semi senza macchie rosse che erano ancora verdi e non frantumano. Se la raccolta è in ritardo, il anthecium di con e senza segni rossi sia i semi girare scuro, il che rende difficile distinguere rapidamente con marcature rosse in piscine raccolti i semi.

Per ottimizzare il protocollo attraversamento diversi esperimenti di trattamento termico sono stati eseguiti come riassunto in Tabella 1. Una media di0-10 semi / pannocchia sono stati recuperati da vari esperimenti trattamento termico. Dopo la raccolta, i semi sono stati essiccati a 30 ° C per 2 giorni in un essiccatore seme seguita dalla rimozione del anthecium utilizzando uno struccante anthecium. Dopo la anthecium è stato rimosso, i semi F1 putativi sono state colorate con soluzione colorante GUS, e progenie outcross macchiati di colore blu in 1-2 ore (Figura 2F). Sulla base di questi risultati, si consiglia un trattamento termico di 48 ° C per 3-6 min. Inoltre, si consiglia di croci essere eseguite sia su giorno 2 e il giorno seguente 3 evirazione.

Per esaminare l'efficacia di questa tecnica nello svolgimento incroci con altre adesioni Setaria o specie, incroci tra S. viridis A10.1 e otto diverse S. adesioni viridis ed una S. sono stati eseguiti pumila adesione. Anche se giorno di fioritura varia tra le adesioni, abbiamo riscontrato che i fiori di tutti e otto S. adesioni viridis ed una S.pumila adesione cominciare apertura tra 10:00-11:00 con un tempo di apertura picco a 10:20-11:00 dopo il trattamento a freddo che precede l'alba. Ciò indica che il trattamento a freddo predawn può essere applicato a diversi adesioni Setaria. Un trattamento termico di 48 ° C per 5-6 min è stato usato per evirare S. viridis A10.1 che è stato utilizzato come il genitore di sesso femminile per tutti gli incroci eseguiti. Abbiamo recuperato da uno a 12 semi da incroci tra A10.1 e tre le diverse S. adesioni viridis e sei semi da un singolo incrocio tra S. viridis A10.1 e un singolo S. adesione pumila. Tuttavia, in questo momento non abbiamo determinato se questi seme derivato da una testcross successo o sono il risultato di auto-contaminazione. Indipendentemente da ciò, questi risultati preliminari suggeriscono che le condizioni di crescita utilizzate per S. viridis A10.1 può essere utilizzato per generare incroci con diverse S. adesioni viridis ed eventualmente altre specie di Setaria.

Trattamento termico Temp (° C) Trattamento termico (min) # croci Avg. # Di fiori dopo assetto Giorno di impollinazione (giorno dopo emasc) Avg. semi # (rosso) / pannocchia (media) Avg. % Gus (+) / semi (rosso) Avg. Semi # Hyb (Gus +) Min # hyb semi Max # semi Hyb
47 10 2 27 2 ° giorno 0 0 0 0 0
48 3 3 36 2 ° giorno 5 60 3 1 5
4 3 25 3 ° giorno 10 50 5 3 7
5 8 25 2 ° giorno 5 60 3 1 6
6 3 25 2 ° giorno 4 75 3 0 4
7 4 24 2 ° giorno 3 33 1 0 4
7 1 25 3 ° giorno 4 75 3 N / A N /La
49 1 3 23 2 ° giorno 5 25 1 0 2
2 7 26 2 ° giorno 8 25 2 0 4
3 5 22 2 ° giorno 0 0 0 0 1
4 4 25 2 ° giorno 0 0 0 0 0

Tabella 1. Ottimizzazione del trattamento termico di castrazione. Risultati di alterare temperatura e tempo di trattamento termico. Impollinazioni sono state eseguite una (2 ° giorno) o due giorni (3 ° giorno) a seguito di evirazione e incroci di successo sanimato con colorazione GUS

Figura 1
Figura 1. Sono mostrati Ottimizzato condizioni della camera crescita con un pre-trattamento a freddo dell'alba. Temperatura e termini per la crescita ottimale e la sincronia della produzione di fiori. Frecce verdi e rosse mostrano finestra ottimale per l'esecuzione di croci e di evirazione, rispettivamente.

Figura 2
Figura 2. Preparazione pannocchia per l'attraversamento e GUS colorazione della progenie out-cross. (A) Una pannocchia di Setaria viridis A10.1 prima di tagliare, mostrando circa 1/10 di fiori aperti. Le quattro sezioni e direzionalità in progressione antesi lungo la pannocchia è mostrato. (C) Una pannocchia evirato dopo la rimozione delle setole. (D) Una pannocchia evirato il giorno 2 post-evirazione, mostrando fiori che sbocciano (foto scattata alle 10:30 AM). (E) una pannocchia del genitore maschio (Setaria viridis transgenico linea A10.1 portando un β-glucuronidasi (GUS) gene reporter), che sta fiorendo dopo il trattamento prima dell'alba (foto scattata alle 10:30). A a E, barre di scala = 1 mm. (F) progenie outcross putativo dopo colorazione GUS per 2 ore seguita da distaining nel 70% (v / v) di etanolo. I due semi dalla destra sono controlli negativi e positivi, rispettivamente.

Figura 3
Figura 3. Diagramma di flusso del protocollo Una rappresentazione schematica del mpassaggi RINCIPALI coinvolti nello svolgimento di S. viridis attraversa.

Discussion

Importanza del trattamento pre-dawn

Per ottenere una elevata frequenza di progenie out-cross è essenziale avere antesi altamente sincrona dei genitori maschili e femminili. Inizialmente, abbiamo pedalato regimi di temperatura e di luce (31 ° C/22 ° C, giorno / notte) e usato il S. viridis A10.1 adesione per tutte le impollinazioni. In queste condizioni, la maggior parte dei fiori si aprono al mattino presto prima che la temperatura sale a 31 ° C, anche se alcuni fiori aperti in modo casuale tra 08:00-8: 12:00. Precedenti studi a S. italica indicano che ora del giorno, il luogo e la stagione contribuiscono alla variazione antesi 7,15,16. Siles et al. 6 osservato che antesi è stato associato con rapidi cambiamenti di temperatura e umidità, ma non a bassa temperatura e alta umidità, di per sé, come concluso in studi precedenti 7,15. Pertanto, abbiamo impiegato un pre-alba trattamento a freddo di 15 ° C per 30 minuti (dalle 8:30 AM-9: 12:00) per imitarela naturale condizione di pre-alba. Questo trattamento a freddo prima dell'alba aiutato nella sincronizzazione antesi nei genitori. Abbiamo osservato che, nonostante l'impostazione della camera di livelli di umidità relativa del 50%, l'umidità relativa all'interno della camera è aumentata a un livello superiore al 70% quando la temperatura è scesa da 22 ° C a 15 ° C e ha continuato a rimanere al di sopra del 70% fino a che la temperatura gradualmente aumentata a 31 ° C dopo 09:30. Alle 09:00, evirato genitori femminili e piante di genitore maschio vengono portati al laboratorio (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, UR: 21.79% ± 1,15%). I fiori dei genitori maschi cominciano ad aprirsi intorno 10:10, e l'impollinazione possono essere eseguite a 10:30 AM-11: 12:00. Un elenco dettagliato di tutti i reagenti e attrezzature sono fornite nella tabella 2.

Importanza della preparazione pannocchia di evirazione

Nelle condizioni della camera in questo studio (Figura 1), la durata di primaria fioritura pannocchia variava da2-3 giorni. Tipicamente, fiori situata a metà distale della infiorescenza (Figura 2A) aperta prima e precede apertura prossimale e distale. Il numero ideale di fiori da conservare sulla pannocchia è 20-30. Si deve usare cautela durante la rimozione dei fiori immaturi in modo che solo fiori ben sviluppati (il fiore più in alto o più grandi sulla spighetta 17) vengono mantenuti. Etichettatura con un pennarello rosso su entrambi i lati dei fiori aiuta a distinguere in modo efficiente putativo progenie out-cross da semi di fiori di recente sviluppato dopo la castrazione. Inoltre, è importante lasciare le setole sulle pannocchie prima di evirazione per proteggere le cimette di ingenti danni al calore, tuttavia, come opzione, possono essere rimossi dopo l'evirazione con le forbici a molla per facilitare l'impollinazione, soprattutto quando si associa una pannocchia tecnica viene impiegata (Figure 2C e 2D).

Ottimizzato una temperaturadurata d trattamento per il trattamento dell'acqua calda

La base per emasculation mediante immersione acqua calda è che il polline è più sensibile al calore rispetto alla superficie dello stimma. Tuttavia, la durata e la temperatura dei trattamenti termici possono variare tra le specie e adesioni Setaria. In generale, una temperatura più alta con un tempo di trattamento più breve o una temperatura inferiore con un tempo di trattamento più lungo avrà lo stesso effetto sulla castrazione. E 'stato riportato che un trattamento termico di 42 ° C per 20 min 10 o 47 ° C per 10 min 14 resi S. italica polline non vitale, ma l'efficacia di questi trattamenti non è stata determinata. Abbiamo sviluppato il nostro protocollo segue l'ipotesi che sotto una temperatura ottimale e la durata del trattamento, polline di tutti i fiori trattenuto sul genitore femmina sarà non vitali, mentre stimmi rimarranno ricettivo. Tuttavia, dopo aver confrontato e analizzando gli effetti delle diverse temperature eperiodi di trattamento (Tabella 1), abbiamo scoperto che la sensibilità al trattamento termico varia tra i fiori trattenute su ogni pannocchia, quindi è difficile da eliminare completamente i semi derivanti da auto-impollinazione. Concludiamo che l'efficienza della produzione di progenie out-cross è il massimo quando i trattamenti vengono effettuati a 48 ° C per 3-6 min in S. viridis A10.1 adesione.

Tempo di picco di antesi e impollinazione incrociata

Quando i fiori raggiungono la maturità e sono in procinto di aprire, antere sono di colore bianco di colore giallastro e polline viene versato non appena antere exsert dai fiori 8. Antere gradualmente diventano marroni dopo che il polline è sparso come i fiori cominciano a chiudere. Una volta rilasciato, la vitalità del polline è sconosciuta. Pertanto, è fondamentale utilizzare il polline di apertura o fiori appena aperti sul genitore maschile appena possibile. Nelle nostre condizioni camera (Figura 1), la maggioranza di flowers dei genitori maschi cominciano ad aprirsi alle 10:10 ed i fiori aperti capannone polline alle 10:30. Così, la finestra auspicabile per l'esecuzione di impollinazione è 10:30-11:00. Gli stimmi rimangono al di fuori delle glume dopo fiori stretti e possono essere ricettivi al polline. Questo è stato precedentemente osservato e confermato in S. italica che gli stimmi sono ricettivi per circa 48 ore post-fiore di apertura da Siles et al. 6, quindi è importante pannocchie borsa dopo il trattamento termico e dopo l'esecuzione incroci controllati. Come discusso sopra, si consiglia di impollinazioni performanti sia il Day 2 e Day 3 post-evirazione.

Metodi per l'impollinazione

Abbiamo confrontato l'efficacia di tre tecniche di impollinazione. Se fiorite fiori non sono limitativi, impollinazione pannocchia a pannocchia è la tecnica più efficace e produrrà un maggior numero di progenie out-cross. Se pannocchie fioritura sono limitanti, una maggiore frequenza di outcross progenie sarà prodotto quando viene utilizzato il metodo antera-to-stimma. Abbiamo ottenuto progenie out-cross da entrambi i metodi con successo. Il metodo "pannocchie vincolante" è stato usato in attraversamento S. italica 6 ma abbiamo trovato che questo metodo sia il metodo meno efficace come la finestra temporale di polline spargimento del genitore maschio è breve. Inoltre, c'è meno controllo sulla impollinazione e le setole su S. pannocchie viridis possono anche ostacolare il movimento del polline sulla superficie dello stigma.

Raccolta dei semi, essiccazione e stoccaggio

Dopo la raccolta, semi vanno essiccati a 30-33 ° C per 2 giorni. Anthecium deve essere rimosso per la colorazione GUS, se necessario. I semi devono essere conservati in un luogo fresco e asciutto (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, UR: 21.79% ± 1,15%) per la conservazione a breve termine (meno di due anni) o in una camera di seme (T: 4.0 10 ° C ± 1,0 ° C, umidità relativa: 20% ± 1%) per la conservazione a lungo termine.Cattive condizioni di conservazione possono causare bassi tassi di redditività 8. Abbiamo osservato che il tasso di germinazione di S. viridis A10.1 è di circa il 5% quando seminato quattro giorni dopo la raccolta, ma può essere aumentata al 90-96% dopo lo stoccaggio in laboratorio (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, UR: 21.79% ± 1,15%) per 110 giorni post-raccolta seguita da una tre giorni di stratificazione a -80 ° C per rompere dormienza dei semi. Per la stratificazione a -80 ° C, semi secchi possono essere inseriti in un contenitore ermetico (ad esempio tubo micro-centrifuga o una busta moneta in un sacchetto di plastica sigillato) e conservati a -80 ° C per 3 giorni prima della semina. Dopo 16 mesi di conservazione in laboratorio (T: 24.06 ° C ± 0,13 ° C, UR: 21.79% ± 1,15%), le percentuali di germinazione del 90-95% possono ancora essere ottenuti. Inoltre, per rompere la dormienza, semi possono essere asciugati a 30-33 ° C per 2 giorni dopo la raccolta, e poi dato tre giorni stratificazione a -80 ° C, seguita dalla rimozione dianthecium prima di piantare. Dopo questi trattamenti, sementi tassi di germinazione fino al 33% può essere raggiunto.

Vantaggi, limiti e le possibili modifiche

Qui forniamo il primo protocollo standard per l'esecuzione di croci in S. viridis A10.1 mediante un trattamento termico per l'evirazione. In contrasto castrazione fisica, questo protocollo è meno invasiva e relativamente facile stabilire in un laboratorio. Di solito ci vogliono circa 15 minuti per tagliare una pannocchia e circa 15 pannocchie può essere tagliata e attraversò / persona / giorno. Ipotizzando una media di 3-5 out-cross discendenti / pannocchia può essere recuperato in condizioni ottimali, per un totale di 45-75 progenie out-cross può essere prodotto da una persona in un solo giorno. Inoltre, questa tecnica può essere applicata a croci in altre specie Setaria, se ottimizzazioni supplementari saranno probabilmente. Se lo spazio camera di crescita è limitato, le piante possono essere coltivate in serra o camere di crescita senza trea prima dell'albaTIMENTO fino a quando la pannocchia emerge prima di essere spostati le condizioni della camera ottimizzate.

Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgements

Ringraziamo Sankalpi Warnasooriya e Amy Humboldt per la lettura critica e la modifica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Department of Energy (DE-SC0008769) e la National Science Foundation (IOS-1.127.017).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scissors, spring World Precision Instruments, Inc 14126
Forceps, Dumostar Biology Polished SPI Supplies TD5BP-XD
Surgical Scissors F.S.T (Fine Science Tools) 14005-12
Europack Clear Polypropylene Micro-Perforated Crusty Bread Bags 6"x28" http://www.pjpmarketplace.com 361001
Flats T.O. Plastics 715401C
metro mix 360 Hommert International 10-0356-1
Jack's 15-16-17 Hommert International 07-5925-1
Kimwipes VWR International 34120
Sharpie Ultra Fine Point Permanent Markers, Red Staples 37002
Donegan DA-10 OptiVisor Headband Magnifier, 3.5x Magnification, 4" Focal Length Amazon DA-10, B0015IP380
12"24/7 Packaging Hand Impulse Sealer Heat Seal Machine Poly Sealing Free Element Grip Amazon N/A
water bath VWR scientific Model: 1166
BDW walk in plant growth chamber Conviron BDW 40

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References

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