Verfahren für Kreuze in

Environment
 

Summary

Wir haben eine Methodik für die Durchführung Kreuze in Setaria viridis (S. viridis) entwickelt. Das Verfahren beinhaltet das Beschneiden der Rispe vor einer Heißwasserbehandlung, um lebensfähige Pollen zu töten. Kreuze werden nach einem gut kontrollierten Wachstum Regime durchgeführt und in der Regel bei der Gewinnung von 1 bis 7 Quer bestäubt-Saatgut / s pro Rispe führen.

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Jiang, H., Barbier, H., Brutnell, T. Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses. J. Vis. Exp. (80), e50527, doi:10.3791/50527 (2013).

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Abstract

Setaria viridis ist eine neue Modellsystem für C 4 Gräser. Es ist eng mit der Bioenergie Futter-Vorrat Rutenhirse und der Getreideernte Kolbenhirse zusammen. Vor kurzem hat die 510 Mb Genom von Kolbenhirse, S. italica, wurde sequenziert 1,2 und eine 25-fache Abdeckung des Genoms relativ schmächtig S. viridis ist in Arbeit. S. viridis hat eine Reihe von Eigenschaften, die es ein potentiell hervorragendes Modell genetische System mit einem schnellen Generationszeit, kleine Statur, einfache Wachstumsanforderungen, fruchtbare Samenproduktion 3 und entwickelten Systeme sowohl für transiente und stabile Transformation 4 zu machen. Jedoch die Genetik von S. viridis weitgehend unerforscht, teilweise aufgrund des Fehlens von detaillierten Verfahren zum Ausführen von Kreuzungen. Bis heute hat keine Standard-Protokoll verabschiedet, die schnelle Produktion von Saatgut aus kontrolliert Kreuze erlauben.

Die Protokolldrucktierte hier ist für die Durchführung genetischer Kreuze in S. optimiert viridis, Beitritt A10.1. Wir haben ein einfaches Wärmebehandlung mit warmem Wasser für Entmannung nach dem Beschneiden der Rispe zu 20-30 Röschen und Kennzeichnung von Blumen zu behalten, um Samen von neu entwickelten Blüten nach Entmannung zu eliminieren beschäftigt. Nach der Prüfung einer Reihe von Wärmebehandlungen bei permissiven Temperaturen und Variieren der Dauer des Eintauchens, haben wir eine optimale Temperatur-und Zeitbereich von 48 ° C für 3-6 min hergestellt. Durch Verwendung dieses Verfahrens kann ein Minimum von 15 Kreuzungen von einem einzigen Arbeiter pro Tag durchgeführt werden, und durchschnittlich 3-5 outcross Nachkommen pro Rispe wiederhergestellt werden können. Daher kann ein Durchschnitt von 45-75 outcross Nachkommen von einer Person an einem Tag hergestellt werden. Grundzüge der Implementierung dieser Technik wird die Entwicklung von rekombinanten Inzuchtlinie Populationen von S. erleichtern X S. viridis viridis oder S. X S. viridis italica, Kartierung Mutationen durch Groß segregant Analyse und Erstellung von höherer Ordnung Mutanten für die genetische Analyse.

Introduction

S. viridis ist eine NADP-ME-Subtyp C 4 Gras eng mit der Bioenergie Futter-Vorrat Rutenhirse (NAD-ME Subtyp), der Getreideernte Kolbenhirse und landwirtschaftlichen Versuchs Unkraut Gras 5 zusammen. Die 510 Mb Genom der Zuchtform Setaria, S. italica, wurde kürzlich sequenziert 1,2 und eine 25-fache Abdeckung des Genoms relativ schmächtig, S. viridis, ist in Arbeit (unveröffentlicht). S. viridis hat eine Reihe von Eigenschaften, die es ein potentiell hervorragendes Modell genetische System mit einem schnellen Generationszeit, kleine Statur, einfache Wachstumsanforderungen und fruchtbare Samenproduktion 3 zu machen. Wichtig ist, daß Methoden kürzlich sowohl transiente und stabile Transformation von S. entwickelt viridis, die die Möglichkeit zur Schaffung von transgenen Pflanzen 4 vorzusehen. Doch ein großer Engpass bei der Entwicklung genetischer Werkzeuge für S. viridis ist seine recalcitrance zu Auskreuzung. Bis heute hat kein Standardprotokoll veröffentlicht worden, die schnelle Produktion von Saatgut aus kontrolliert Kreuze erlauben.

Genetische Kreuze in S. italica werden üblicherweise durch Entmannung durch Entfernung der Staubbeutel aus Blumen 6,7,8 oder durch Wärmebehandlung von Blüten der weiblichen Eltern 9-11 durchgeführt. Nach diesen Behandlungen, Staubbeutel oder Rispen von nicht-behandelten Blüten / männlich Eltern sanft gegen Narben frei Pollen abgerieben. In Entmannung, sind Staubbeutel mit einer feinen Pinzette sofort nach dem Blümchen öffnet und der Staubbeutel beginnt exsert entfernt, ist aber noch nicht vergossen Pollen 6-8. Unter den Herausforderungen dieser letzteren Verfahren ist die Schwierigkeit bei der Durchführung Schwächung in einem schmalen Zeitintervall zwischen dem Öffnen und Pollen Schuppen der Blume. Die Dauer der Öffnungs-und Schließ einer einzigen Blume wird in Abhängigkeit von der Beitritts-und Umweltbedingungen variieren und kann von 7 min reichen <sup> 6-2,5 h 12 in S. italica. Da Shedding von Pollen tritt als Antheren exsert von Blümchen, müssen Staubbeutel sorgfältig und schnell entfernt werden, und daher ist es schwierig, Verunreinigungen durch Selbstbestäubung zu vermeiden. Zusätzlich, wie Bestäubungen unmittelbar nach Kastration ausgeführt wird, ist die Anzahl von Kreuzungen, die pro Person pro Tag durchgeführt werden kann / begrenzt.

Als alternative Methode kann reifen Rispen in warmen Wasser getaucht werden, um Wärme-kill Entwicklung Pollenkörner 9,10,13,14 mit dem Vorteil der Durchführung Kreuze auf einer großen Anzahl von Rispen. Die Temperatur und Dauer der Wärmebehandlung variiert jedoch stark von verschiedenen Experimenten (zB 47 ° C für 10 min 14 und 42 ° C für 20 min 10). Weiterhin keine systematischen Analysen über die Wirksamkeit von Wärme-vermittelte Entmannungen veröffentlicht worden. Somit ist ein Standard und einfaches Verfahren zur Durchführung der genetischen Kreuzungen in S. viridis würde genetische Ressource Entwicklung und Etablierung von S. stark beschleunigen viridis als Modellsystem in der Forschungsgemeinschaft.

Wir berichten über die Entwicklung und Optimierung von einem Standard-Protokoll für die Durchführung genetischer Kreuze in S. viridis. Pflanzen werden unter kontrollierten Umgebungen Blütenentwicklung synchronisieren und erhöhen die Reproduzierbarkeit des Verfahrens geworden. Kreuze werden mit einer transgenen S. durchgeführt viridis Zeile wie das männliche Elternteil, die das GUS-Reportergen 4 um die Identifizierung erfolgreich gesteuert genetischen Kreuzungen zu erleichtern. Die GUS-Transgen durch einen Ubiquitin-Promotor, der Reis das Zählen von F1 Samen sofort nach der Ernte und ermöglicht somit bequem qualitativen Assay, um die Effizienz der Schwächung und der Bestäubung bestimmen angetrieben. Wir haben ein einfaches Wärmebehandlung mit warmem Wasser für Entmannung begleitet von Blumen, die Kennzeichnung von emascula gewesen sind eingesetztted Samen von neu entwickelten Blüten nach Entmannung zu eliminieren. Nach der Prüfung einer Reihe von Wärmebehandlungen bei permissiven Temperaturen und Variation der Dauer Eintauchen in warmes Wasser haben wir eine optimale Temperatur-und Zeitdauern von 48 ° C 3-6 min etabliert. A pre-dawn Kältebehandlung wurde festgestellt, Synchron Blüte in beiden Eltern, um Fremdbestäubung zu erleichtern fördern. Wir haben auch die wichtigsten Schritte in der Protokoll-und der künftigen Anwendung dieser Methode auf andere Setaria Beitritte diskutiert.

Protocol

1. Wachstum von S. viridis

  1. Stellen Sie die Wachstumskammer Bedingungen 31 ° C/22 ° C (Tag / Nacht), 12 h Licht/12 h dunkel, 50% relative Luftfeuchte mit einem pre-dawn Behandlung von 15 ° C 8.30 bis 09.00 Uhr Uhr. (Fig. 1). Unter diesen Bedingungen S. viridis A10.1 dauert etwa 21-22 Tage von Aussaat bis Blüte.
  2. Füllen Wohnungen (4 x 9-Zellen) mit Metro Mix 360 und entfernen Sie eine Zelle für die Bewässerung.
  3. Leicht Nebel Wasser auf Bodenoberfläche.
  4. Aussaat der Samen auf der Oberfläche der Erde, einen Samen pro Zelle.
  5. Gehören die Samen mit einer Erdschicht (etwa 0,5 cm)
  6. Mist die Oberfläche des Bodens und des Wassers Wohnungen aus dem Boden. Halten Sie die Bewässerung von unten nach Aussaat.
  7. Für jeden Quer, die mindestens drei Anlagen durchgeführt werden als weibliche Eltern und neun Pflanzen verwendet werden, wie männliche Eltern verwendet werden. Aussaat sollte als alle Pflanzen nicht blühen am selben Tag versetzt werden. Seed sowing über einen Zeitraum von drei Tagen empfohlen, jeden Tag.
  8. Gießen Sie die Pflanzen 1-2 mal am Tag, die abhängig von der Größe der Pflanzen und Boden Zustand. Überschüssiges Wasser im Boden ist nicht günstig für ein optimales Wachstum der Pflanzen und können das Pilzwachstum im Boden und Beschädigung der Blattgewebe führen.
  9. Düngen der Pflanzen zweimal pro Woche, mit Jacks 15-16-17 in einer Konzentration von 100 ppm.

2. Trimmen und Kennzeichnung von Rispe Vor Entmannung - Tag 1

  1. Am Nachmittag oder am Abend vor der Bestäubung, bewegen Sie Pflanzen aus der Wachstumskammer an das Labor (Temperatur-(T): 24,06 ° C ± 0,13 ° C, relative Feuchtigkeit (RH) 21,79% ± 1,15%).
  2. Wählen Sie die primären Rispen mit 1 Blume auf 1/3 der Blumen auf der Rispe, die bereits geblüht haben.
  3. In dieser Studie wurden die vier Domänen innerhalb der Rispe sind wie folgt definiert (2A; Spitze distal mittlere, mittlere und proximale Basis).
  4. Idealerweise choosea Rispe mit 1-5 Blüten, die geblüht haben, schneiden Sie die Spitze der Rispe (distalen Ende), und entfernen Sie alle Blumen in den proximalen Herz-und Basisteile mittels Feder Schere oder feinen Pinzette.
  5. Wenn eine Rispe hat etwa 1/10 bis 1/5 der Blumen, die geblüht haben, schneiden Sie die Spitze und Zierblumen aus dem Boden der Rispe, nur für weitere Trimmen behalten den unteren Bereich des distalen mittleren und oberen Bereich des proximalen Mitte.
  6. Wenn eine Rispe hat etwa 1/4 bis 1/2 der Blumen, die geblüht haben, schneiden Sie die distalen Mittelteil und den proximalen mittleren Abschnitt für weitere Trimmen nur behalten.
  7. Verwenden chirurgische Schere leicht schneiden Sie die Borsten.
  8. Entfernen Sie alle Blumen, die geblüht haben und alle unreifen Blüten verlassen ca. 20-30 Blüten / Rispe, die gleichmäßig in der Region verteilt sind (Abbildung 3). Üben Sie Sorgfalt, um die Borsten in der Region, um Röschen von möglichen Hitzeschäden zu schützen bestäubt werden beibehalten.Für jedes Ährchen, behalten die Ober reifste Blümchen. Die oberste Blümchen wird eine höhere Wahrscheinlichkeit der Blüte zum Zeitpunkt der Bestäubung (2B) haben.
  9. Markieren Sie eine Seite jeder Blume mit einem roten Edding und notieren Sie die Anzahl der Blüten auf dem Rispe (2B).
  10. Flagge der Rispe mit den folgenden Informationen: das Datum der Entmannung, der Dauer und der Temperatur, bei der die Entmannung durchgeführt.
  11. Sobald der Rispe getrimmt, entfernen Sie alle Motorhacken jeder Pflanze, um die Neuverteilung von Ressourcen, um die Entwicklung der Haupt Rispe zu gewährleisten.

3. Entmannung mit Warmwasser-Tauchen - Tag 1

  1. Stellen Sie das Wasserbad auf 48 ° C ± 0,1 ° C für die Wärmebehandlung.
  2. Vorsichtig biegen die Rispen abgeschnitten und tauchen sie in warmem Wasser bei 48 ° C für 3-6 min. Seien Sie vorsichtig, nicht auf den Stamm der Rispe zu brechen.
  3. Über 3-4 Rispen kann getaucht werden together zu einer Zeit, und gleichzeitig genügend Raum zwischen den Rispen für eine gleichmäßige Verteilung der Wärme. Es ist wichtig, die gesamte Rispe in warmes Wasser tauchen während der Wärmebehandlung. Die Flagge Blatt (das Blatt aufspannt die Rispe, die die Nährstoffe in die Rispe bietet) sollten nicht in Kontakt mit warmem Wasser kommen, um Hitzeschäden an Blattgewebe zu verhindern.
  4. Sobald der Entmannung für die gewünschte Dauer durchgeführt, entfernen Rispen aus dem Wasserbad und schütteln Sie das Wasser von der Rispe.
  5. Legen Sie eine kundenspezifische Mikrolochbrottasche, um vollständig zu decken entmannt Rispe und sichern Sie es mit einem Twist-tie. Micro-perforierten Brotbeutel kann je nach der Größe der Rispe angepasst werden (enthalten in Video).
  6. Zeigen Pflanzen zurück in der Wachstumskammer bis zum nächsten Tag.

4. Crossing / Bestäubung nach Entmannung - Tag 2 und Tag 3

  1. Um 9:00 Uhr am Tag 2 und Tag 3, bewegen weiblich (kastriert) und malE Eltern aus der Wachstumskammer zu dem Labor (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, relative Feuchtigkeit: 21,79% ± 1,15%), um Kreuzungen durchzuführen.
  2. Beobachten Sie und fügen Sie ein weiteres roten Punkt, um Blumen, die geblüht haben oder blühen mit einem roten Edding. Notieren Sie sich die Gesamtzahl der blühte Blüten pro Rispe.
  3. Notieren Sie das Datum der Bestäubung und den Namen des männlichen Elternteils auf dem Tag zu verfolgen, was Kreuze werden durchgeführt, zu halten.
  4. Beachten Sie die Peak-Zeit der Blüte bei männlichen Eltern. Unter unserem Kammerbedingungen (Abbildung 1) Blumen auf den Rispen der männliche Elternteil beginnen Synchronöffnung um 10.10 Uhr. Ab dem Zeitpunkt der Öffnung der Blüten, wird die komplette exsertion von Staubbeuteln und Freisetzung von Pollen nach 20 Minuten auftreten.
  5. Die ideale Bühne für die Bestäubung ist die Phase, in der die Pollen der männlichen Eltern freigegeben wird. Die Blumen werden nach 20 Minuten von Pollenfreisetzung zu schließen. Daher ist etwa 40 Minuten ab dem Zeitpunkt der Öffnung des Strömungs die Dauer der BlüteERS. Die Farbe ändert sich von Pollen gelblich weiß bis braun über einen Zeitraum von etwa 30 min nach der Blüte schließt.
  6. Starten Bestäubung, sobald gelblich-weißen Staubbeuteln auf Blumen des männlichen Eltern sichtbar sind. Befruchtungen werden am Tag 2 und Tag 3 unter Verwendung einer der drei Techniken durchgeführt:
    1. Rispe zu Rispe Bestäubung: freistehend mit einer Rispe als männlich, sanft einmassieren das zusammen mit der Rispe Rispe entmannt, um die Bestäubung zu erleichtern und entsorgen Sie die männlichen Rispe, um eine Kontamination zu vermeiden. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die Bestäubung jeder Rispe entmannt wurde von 2-3 Rispen bestäubt worden.
    2. Staubbeutel-zu-Stigma Bestäubung: mit einer Pinzette nehmen eine Blume, die mit gelblich-weißen Staubbeuteln blühen wird oder holen Staubbeutel und körperlich berühren Sie die Narbe der Blüte auf den weiblichen Elternteil. Verwenden Sie eine Blume aus dem männlichen Elternteil auf eine Blume auf dem entmannt Rispe bestäuben. Wiederholen Sie die Bestäubung process bis jede Narbe auf der Rispe entmannt wurde von ein paar (ca. 2-3) Blumen / Staubbeutel bestäubt worden. Das Tragen eines Vergrößerungsblende wird eine bessere Sichtbarkeit zu machen, um die Bestäubung durchzuführen.
    3. Zwischen den Befruchtungen von verschiedenen männlichen Eltern, tauchen die Zange in 95% Ethanol, gefolgt durch Abwischen mit Kimwipes, um eine Kontamination durch Verschleppung von Pollen zwischen verschiedenen Kreuzungen zu vermeiden.
    4. Rispe Bindung: Nach Entmannung, wählen 3-4 Rispen auf den männlichen Elternteil, das am nächsten Tag blühen wird. Binde sie zusammen mit dem entmannt Rispe des weiblichen Elternteils mit einem Twist-Krawatte. Positionieren Sie den entmannt Rispe Rispe leicht unter dem des männlichen Elternteils. Legen Sie ein Glassine-Tasche über den Rispen und sichern Sie die Tasche an der Basis mit einer Büroklammer. Dies kann am Tag 2 abgeschlossen werden, sobald die Rispen des männlichen Eltern Blüte beginnen.
    5. Während der Blütezeit in den Morgen von Tag 2 und Tag 3, Flick oder schütteln Sie die Glassine-Tasche, um facilitate Bestäubung. Fahren Sie über die gesamte Dauer der Blüte am Morgen (zwischen 9.00 Uhr-11: 00 AM) Flick oder schütteln Rispen alle 15 min. Rispen des männlichen Eltern entfernen nach der Bestäubung und beschriften Sie die gegenüberliegende Seite der blühten Blumen auf dem entmannt Rispe. Notieren Sie die Anzahl der blühten Blumen auf der Rispe von jedem weiblichen Elternteil.
  7. Sobald die Bestäubung durchgeführt wurde, legen Sie eine kundenspezifische Mikrolochbrottasche, die Rispe des weiblichen Elternteils abdecken und sichern an der Basis mit Hilfe eines Twist-tie nach der Bestäubung bis zur Samenernte.

5. Seed Ernten

  1. Ernte Samen nach 2 Wochen (14-16 Tage) ab dem Tag der Bestäubung. Legen Sie den Tag in der gleichen Tasche der Samen. Samen, die roten Markierungen auf beiden Seiten stellen die Samen, die aus der kontrollierten genetischen Kreuzung geführt. Diese werden voraussichtlich Outcross Nachkommen sein.
  2. Entsorgen Sie die Samen ohne rote Markierungen, wie sie vertretendie Samen, die aus neu entwickelten Blüten nach Entmachtung führen. Samen mit roten Markierungen nur auf einer Seite wird wahrscheinlich stellen die Samen, die aus Selbstbestäubung, da sie nicht zu der Zeit, wenn die Kreuze gesteuert wurden durchgeführt, zu blühen.
  3. Trockene Samen bei 30 º C für 2 Tage in einem Keim Trockner. Shop getrockneten Samen im Labor (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21,79% ± 1,15%) oder in einer Saatgutkammer (T: 4,0 ° C ± 1,0 ° C, RH: 20% ± 1%).

Representative Results

In dieser Studie, die sequenziert S. verwendeten wir viridis Beitritt A10.1 als das weibliche Elternteil und einem transgenen S. viridis Leitung (auch A10.1), die das GUS-Reportergen 4 als männliche Eltern für alle Befruchtungen. Eine optimierte Wachstumsregime wurde zur Blüte zu synchronisieren, wie in Fig. 1 gezeigt. Wir haben mehrere Kombinationen von Temperatur und Zeit der Wärmebehandlung für Entmannung getestet und festgestellt, dass etwa 40-80% der an der Rispe entmannt beibehalten Blumen blühten auf dem 2. Tag, während der Rest blühte am 3. Tag (Abbildung 2). Wenn jedoch die Wärmebehandlung zu stark, zum Beispiel 49 ° C für 4 min, sehr wenige oder keine Blumen blühten am 2. Tag. Kreuzbestäubung wurde am 2. oder 3. Tag nach der Kastration, die abhängig von der Spitzenzeit von der Blüte der männlichen Eltern durchgeführt.

Es war Beobachtered, dass die jungen Blumen weiter nach Entmannung entwickeln, gereift und selbstbestäubten 3-6 Tage nach kontrollierter Befruchtungen. Nach 7-10 Tage nach der Bestäubung sind Blumen, die in der Farbe weiß sind auf der Rispe sichtbar. Diese weißen Blüten werden entweder aufgrund von Hitzeschäden oder schlechte Bestäubung unbefruchtet. Zur gleichen Zeit, die Blumen, die erfolgreich bestäubt haben, beginnen zu dunklen Samen tragen, und starten bewegend nach 14 Tagen. Die dunklen Samen mit roten Markierungen auf dem 14. Tag nach der Bestäubung geerntet klar aus den Samen ohne rote Markierungen, die noch grün waren und nicht zerbrechen unterschieden werden. Wenn die Ernte verzögert, die anthecium der Samen mit und ohne rote Markierungen sowohl dunkel werden, ist es schwierig, schnell die Samen mit roten Markierungen in geerntet Pools zu unterscheiden.

Zur Optimierung der Kreuzung Protokolls mehrere Wärmebehandlungsversuche wurden durchgeführt, wie in Tabelle 1 zusammengefasst. Durchschnitt0-10 Samen / Rispe wurden von verschiedenen Wärmebehandlungsversuche gewonnen. Nach der Ernte wurden die Samen bei 30 º C für 2 Tage in einer Samentrockner, gefolgt von der Entfernung des anthecium Verwendung eines anthecium Entferner getrocknet. Nachdem die anthecium entfernt war, wurden mutmaßliche F1-Samen mit GUS-Färbelösung gefärbt und Outcross Nachkommen blau gefärbt Farbe in 1-2 h (2F). Basierend auf diesen Ergebnissen empfehlen wir eine Wärmebehandlung von 48 ° C für 3-6 min. Darüber hinaus empfehlen wir, dass Kreuze auf beiden Tag 2 und Tag 3 folgenden Entmannung durchgeführt werden.

Um die Wirksamkeit dieser Technik in Ausführen von Kreuzungen mit anderen Setaria Beitritt oder Arten zu untersuchen, kreuzt zwischen S. viridis A10.1 und acht verschiedenen S. viridis Beitritte und ein S. pumila Beitritt durchgeführt. Obwohl Tage bis zur Blüte variiert unter den Beitritten wir festgestellt, dass die Blumen von allen acht S. viridis Beitritte und ein S.pumila Beitritt Öffnung zwischen 10.00 Uhr bis 11.00 Uhr beginnen mit einem Spitzenöffnungszeit auf 10.20 bis 11.00 Uhr nach der Morgendämmerung Kältebehandlung. Dies zeigt, dass die Morgendämmerung Kältebehandlung kann auf vielfältige Setaria Beitritte angewendet werden. Eine Wärmebehandlung von 48 ° C für 5-6 min wurde verwendet, um S. entmannen viridis A10.1, die als das weibliche Elternteil für alle durchgeführt Kreuze verwendet wurde. Wir erholten uns von einem bis zu 12 Samen aus Kreuzungen zwischen A10.1 und drei der vielfältigen S. viridis Beitritte und sechs Samen aus einer Kreuzung zwischen S. viridis A10.1 und ein Einzel S. pumila Beitritt. Doch zu diesem Zeitpunkt haben wir nicht festgestellt, ob diese Samen resultierte aus einer erfolgreichen testcross oder waren das Ergebnis von Selbstkontamination. Unabhängig deuten diese vorläufigen Ergebnisse, dass die für S. verwendeten Wachstumsbedingungen viridis A10.1 kann verwendet werden, um Kreuzungen mit verschiedenen S. erzeugen viridis Beitritte und möglicherweise auch andere Arten von Setaria.

Temp Wärmebehandlung (° C) Wärmebehandlungszeit (min) # Kreuze Rel. # Von Blumen nach trim Tag der Bestäubung (Tag nach emasc) Rel. # Samen (rot) / Rispe (Mittelwert) Rel. Gus% (+) / Samen (rot) Rel. # Hyb Samen (Gus +) Min # Hyb Samen Max # hyb Samen
47 10 2 27 2. Tag 0 0 0 0 0
48 3 3 36 2. Tag 5 60 3 1 5
4 3 25 3. Tag 10 50 5 3 7
5 8 25 2. Tag 5 60 3 1 6
6 3 25 2. Tag 4 75 3 0 4
7 4 24 2. Tag 3 33 1 0 4
7 1 25 3. Tag 4 75 3 N / A N /A
49 1 3 23 2. Tag 5 25 1 0 2
2 7 26 2. Tag 8 25 2 0 4
3 5 22 2. Tag 0 0 0 0 1
4 4 25 2. Tag 0 0 0 0 0

Tabelle 1. Optimierung der Wärmebehandlung zur Schwächung. Ergebnisse der Veränderung sowohl der Temperatur und Zeit der Wärmebehandlung. Befruchtungen wurden ein (2. Tag) oder zwei Tage (3. Tag) durchgeführt folgenden Entmannung und erfolgreiche Auskreuzungen smit GUS-Färbung entkernt

Figur 1
Fig. 1 ist. Optimierte Wachstumskammer Bedingungen mit einem pre-dawn Kältebehandlung. Temperatur und Fristen für optimales Wachstum und Synchronität der Blumenproduktion gezeigt. Grüne und rote Pfeile zeigen optimale Fenster für die Durchführung Kreuze und Entmannung auf.

Figur 2
2. Rispe Vorbereitung für die Überfahrt und die GUS-Färbung von Outcross Nachkommen. (A) Eine Rispe von Setaria viridis A10.1 vor dem Trimmen, zeigt etwa 1/10 der Blumen eröffnet. Die vier Abschnitte und Direktionalität in Fortschreiten der Blüte an der Rispe gezeigt. (C) Ein entmannt Rispe nach der Entfernung der Borsten. (D) Ein entmannt Rispe am Tag 2 nach der Entmannung, zeigt Blumen, die blühen werden (Bild, um 10:30 genommen AM). (E) Eine Rispe des männlichen Elternteils (Setaria viridis transgenen A10.1 Linie mit einem β-Glucuronidase (GUS)-Reporter-Gen), die nach dem pre-dawn-Behandlung (Bild, um 10:30 Uhr genommen) blühen wird. A bis E, Maßstabsbalken = 1 mm. (F) Vermutliche outcross Nachkommen nach GUS-Färbung für 2 Stunden, gefolgt von distaining in 70% (v / v) Ethanol. Die beiden Samen von rechts sind negative und positive Kontrollen.

Fig. 3
3. Flussdiagramm des Protokolls eine schematische Darstellung des michtige Schritte bei der Durchführung beteiligt S. viridis quert.

Discussion

Die Bedeutung der pre-dawn Behandlung

Um eine hohe Frequenz von Outcross Nachkommen zu erhalten, ist es wichtig, hochsynchronen Blüte der männlichen und weiblichen Eltern haben. Zunächst fuhren wir Temperatur-und Lichtsysteme (31 ° C/22 ° C Tag / Nacht) und nutzte die S. viridis Beitritt A10.1 für alle Befruchtungen. Unter diesen Bedingungen, öffnen die meisten Blumen am frühen Morgen, bevor die Temperatur steigt auf 31 ° C, obwohl einige Blüten geöffnet zufällig zwischen 08.00 Uhr-8: 00 PM. Frühere Studien in S. italica zeigen, dass die Tageszeit, Standort und Jahreszeit dazu beitragen, in der Blüte 7,15,16 variante. Siles et al. 6 darauf hingewiesen, dass der Blüte wurde mit raschen Veränderungen in Temperatur und Luftfeuchtigkeit verbunden, aber nicht mit niedriger Temperatur und hoher Luftfeuchtigkeit, an sich, wie in früheren Studien 7,15 abgeschlossen. Deshalb beschäftigten wir pre-dawn Kältebehandlung von 15 ° C für 30 min (ab 08.30 Uhr-9: 12.00 Uhr) zu imitierendie natürliche pre-dawn Zustand. Das pre-dawn Kältebehandlung bei der Synchronisierung der Blüte bei den Eltern unterstützt. Wir beobachteten, dass, obwohl die Einstellung der Kammer für eine relative Luftfeuchtigkeit von 50%, die relative Feuchtigkeit in der Kammer auf ein Niveau von über 70%, wenn die Temperatur sank von 22 ° C bis 15 ° C und weiter auf über 70% zu bleiben, bis die Temperatur stieg allmählich auf 31 ° C nach 09.30 Uhr. Um 9:00 AM, entmannt weiblichen Eltern und Pflanzen der männlichen Eltern werden ins Labor gebracht (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21,79% ± 1,15%). Blumen der männlichen Eltern beginnen Öffnung um 10.10 Uhr, und der Bestäubung kann um 10:30 Uhr-11 durchgeführt werden: 00.00. Eine detaillierte Liste mit allen Reagenzien und Geräte ist in Tabelle 2 angegeben.

Die Bedeutung der Rispe Vorbereitung für Entmannung

Unter den Kammerbedingungen in dieser Studie (Abbildung 1), die Dauer der Primär Rispe Blüte reichte von2-3 Tage. Typischerweise Blumen am distalen Mitte des Blütenstandes (Abbildung 2A) offene erste und Öffnungsvoran proximal und distal. Die ideale Anzahl von Blumen auf der Rispe beibehalten 20-30. Bei der Entfernung von unreifen Blüten sollten Vorsicht genommen, so dass nur gut entwickelten Blüten (die oberste Blume oder auf der größten Ährchen 17) beibehalten werden. Die Markierung mit roten Marker auf beiden Seiten der Blumen hilft, effizienter zu unterscheiden mutmaßlichen Outcross Nachkommen von Samen aus neu entwickelten Blüten nach Entmannung. Darüber hinaus ist es wichtig, die Borsten auf den Rispen vor Entmannung zu verlassen, um die Blüten aus dem umfangreichen Hitzeschäden zu schützen, aber als Option, sie können nach der Entmannung mit Feder Schere, um die Bestäubung zu erleichtern entfernt werden, insbesondere wenn eine Rispe verbindlich Technik eingesetzt wird (2C und 2D).

Optimierte Temperatur eind Behandlungsdauer für Warmwasseraufbereitung

Die Grundlage für die Entmannung durch warmes Wasser Tauchen ist, dass Pollen ist empfindlicher auf Hitze als die Narbenfläche. Allerdings kann die Dauer und Temperatur der Wärmebehandlungen unter Setaria-Arten und Beitritte variieren. Im allgemeinen wird eine höhere Temperatur eine kürzere Behandlungszeit oder einer niedrigeren Temperatur mit einer längeren Behandlungszeit die gleiche Wirkung auf die Schwächung. Es wurde berichtet, dass eine Wärmebehandlung von 42 ° C für 20 min 10 oder 47 ° C für 10 min 14 wieder S. italica Pollen nicht lebensfähigen, aber die Effizienz dieser Behandlung wurde nicht bestimmt. Wir haben unser Protokoll nach der Hypothese, dass unter einer optimierten Temperatur und Dauer der Behandlung, Pollen aller Blumen beibehalten auf das weibliche Elternteil wird nicht lebensfähig, während Narben empfänglich bleiben entwickelt. Jedoch nach dem Vergleich und Analyse der Wirkungen von verschiedenen Temperaturen undBehandlungszeiten (Tabelle 1) haben wir festgestellt, daß die Empfindlichkeit der Wärmebehandlung variiert je nach dem an jedem Rispe gehalten Blumen, so ist es schwer, Samen aus Selbstbestäubung vollständig zu eliminieren. Wir schließen daraus, daß die Effizienz der Herstellung outcross Nachkommen ist am größten, wenn Behandlungen bei 48 ° C für 3-6 min in S. durch viridis Beitritt A10.1.

Peak-Zeit der Blüte und Fremdbestäubung

Wenn die Blumen Reife erreichen und sind dabei, sich zu öffnen, Staubbeutel sind gelblich-weiß in Farbe und Pollen wird so bald wie Staubbeutel exsert aus den Blüten 8 vergießen. Staubbeutel allmählich braun werden nach Pollen Schuppen wie die Blumen beginnen zu schließen. Einmal freigesetzt, die Lebensfähigkeit der Pollen, ist unbekannt. Daher ist es wichtig, den Pollen von Öffnung oder frisch geöffneten Blüten auf dem männlichen Elternteil, sobald wie möglich zu verwenden. Unter unserem Kammerbedingungen (Abbildung 1), die Mehrheit der flowers der männlichen Eltern beginnen um 10:10 Uhr öffnen und die geöffneten Blüten Pollen vergossen um 10:30 Uhr. Somit ist das wünschenswert Fenster für die Durchführung der Bestäubung von 10.30 bis 11.00 Uhr. Die Narben bleiben außerhalb der Spelzen nach Blumen in der Nähe und können Pollen empfänglich zu sein. Dies wurde zuvor beobachtet worden, und in S. bestätigt italica, dass die Narben sind offen für etwa 48 Stunden nach der Blume, die von Siles et al. 6, so ist es wichtig, Tasche Rispen folgende Wärmebehandlung und nach der Durchführung kontrolliert Kreuze. Wie oben besprochen, empfehlen wir leistungs Bestäubungen sowohl auf Tag 2 und Tag 3 nach der Entmannung.

Methoden für die Bestäubung

Wir verglichen die Wirksamkeit von drei Bestäubungstechniken. Wenn blühenden Blumen sind nicht einschränkend ist Rispe zu Rispe Bestäubung der effizienteste Technik und eine höhere Anzahl von Outcross Nachkommen zu erhalten. Wenn blühenden Rispen begrenzen, eine höhere Frequenz von outcross Nachkommen produziert werden, wenn der Staubbeutel-zu-Stigma-Methode verwendet wird. Wir haben Outcross Nachkommen von beiden Methoden erfolgreich erhalten. Die "Bindung Rispen"-Methode hat in der Überfahrt S. verwendet italica 6, aber wir fanden diese Methode, um die am wenigsten effiziente Methode sein, da das Zeitfenster für die Pollen Abstoßung der männliche Elternteil ist kurz. Darüber hinaus gibt es weniger Einfluss auf die Bestäubung und die Borsten auf S. viridis Rispen kann auch die Bewegung der Pollen auf die Narbenfläche zu behindern.

Seed Ernte, Trocknung und Lagerung

Nach der Ernte sollten Samen bei 30-33 ° C für 2 Tage getrocknet. Anthecium sollte für GUS-Färbung entfernt werden, falls erforderlich. Samen sollten an einem trockenen, kühlen Ort gelagert werden (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21,79% ± 1,15%) für die kurzfristige Lagerung (weniger als zwei Jahre) oder in einer Saatgutkammer (T: 4,0- 10 ° C ± 1,0 ° C, relative Feuchtigkeit 20% ± 1%) für die langfristige Lagerung.Schlechte Lagerbedingungen können in niedrigen Raten Lebensfähigkeit 8 führen. Wir haben beobachtet, dass die Keimrate von S. viridis A10.1 etwa 5%, wenn gesät 4 Tage nach der Ernte, sondern kann auf 90-96% nach der Lagerung im Labor (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, relative Feuchtigkeit: 21,79% ± 1,15%) erhöht werden für 110 Tage nach der Ernte, gefolgt von einer dreitägigen Schichtung bei -80 ° C bis Samenruhe zu brechen. Für die Schichtung bei -80 ° C, trockenen Samen in einem luftdichten Behälter (zB Mikrozentrifugenröhrchen oder eine Münze in einem verschlossenen Umschlag Plastiktüte) platziert werden und für 3 Tage vor dem Pflanzen gehalten bei -80 ° C. Nach 16 Monaten Lagerung im Labor (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, relative Feuchtigkeit: 21,79% ± 1,15%), kann die Keimung Prozentsatz der noch 90-95% erhalten werden. Darüber hinaus, um die Keimruhe zu brechen, Samen können bei 30-33 ° C für 2 Tage nach der Ernte getrocknet werden, und dann bei drei-Tage-Schichtung bei -80 ° C, gefolgt von der Entfernung deranthecium vor dem Einpflanzen. Nach diesen Behandlungen können die Samenkeimung Raten von bis zu 33% erreicht werden.

Vorteile, Grenzen und mögliche Änderungen

Hier stellen wir die erste Standard-Protokoll für die Durchführung Kreuze in S. viridis A10.1 durch Verwendung einer Wärmebehandlung für Entmannung. Im Gegensatz zu physikalischen emasculation ist dieses Protokoll weniger invasiv und relativ einfach im Labor herzustellen. Es dauert in der Regel etwa 15 Minuten, um eine Rispe schneiden und etwa 15 Rispen können getrimmt und überquerte / Person / Tag werden. Bei durchschnittlich 3-5 Outcross Nachkommen / Rispe können unter optimierten Bedingungen gewonnen werden, können insgesamt 45-75 Outcross Nachkommen von einer Person an einem Tag hergestellt werden. Darüber hinaus kann diese Technik angewandt werden, um in anderen Setaria-Arten kreuzt, wenn zusätzliche Optimierungen wahrscheinlich. Wenn Wachstumskammer der Platz begrenzt ist, können die Pflanzen im Gewächshaus oder Wachstumskammern ohne pre-dawn TREA angebaut werdentment bis der Rispe tritt, bevor sie den optimierten Bedingungen Kammer bewegt werden.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgements

Wir danken Sankalpi Warnasooriya und Amy Humboldt für das kritische Lesen und Bearbeiten des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von Department of Energy (DE-SC0008769) und der National Science Foundation (IOS-1127017) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scissors, spring World Precision Instruments, Inc 14126
Forceps, Dumostar Biology Polished SPI Supplies TD5BP-XD
Surgical Scissors F.S.T (Fine Science Tools) 14005-12
Europack Clear Polypropylene Micro-Perforated Crusty Bread Bags 6"x28" http://www.pjpmarketplace.com 361001
Flats T.O. Plastics 715401C
metro mix 360 Hommert International 10-0356-1
Jack's 15-16-17 Hommert International 07-5925-1
Kimwipes VWR International 34120
Sharpie Ultra Fine Point Permanent Markers, Red Staples 37002
Donegan DA-10 OptiVisor Headband Magnifier, 3.5x Magnification, 4" Focal Length Amazon DA-10, B0015IP380
12"24/7 Packaging Hand Impulse Sealer Heat Seal Machine Poly Sealing Free Element Grip Amazon N/A
water bath VWR scientific Model: 1166
BDW walk in plant growth chamber Conviron BDW 40

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References

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