सूक्ष्म शैवाल में फैटी एसिड सामग्री और संरचना का विश्लेषण

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Summary

यांत्रिक सेल व्यवधान, विलायक आधारित लिपिड निष्कर्षण, ट्रान्सएस्टरीफिकेशन, और मात्रा का ठहराव और गैस क्रोमैटोग्राफी का उपयोग फैटी एसिड की पहचान पर आधारित microalgae में फैटी एसिड सामग्री और संरचना के निर्धारण के लिए एक विधि का वर्णन किया है. एक tripentadecanoin आंतरिक मानक निष्कर्षण और अधूरा ट्रान्सएस्टरीफिकेशन दौरान संभावित नुकसान के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

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Breuer, G., Evers, W. A., de Vree, J. H., Kleinegris, D. M., Martens, D. E., Wijffels, R. H., Lamers, P. P. Analysis of Fatty Acid Content and Composition in Microalgae. J. Vis. Exp. (80), e50628, doi:10.3791/50628 (2013).

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Abstract

Microalgae में मौजूद कुल फैटी एसिड की सामग्री और संरचना निर्धारित करने के लिए एक विधि का वर्णन किया है. फैटी एसिड microalgal बायोमास का एक प्रमुख घटक हैं. इन फैटी एसिड अलग एसाइल लिपिड कक्षाओं में उपस्थित हो सकते हैं. वे परिवहन ईंधन, थोक रसायनों, Nutraceuticals (ω-3 फैटी एसिड होता है), और खाद्य वस्तुओं के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है क्योंकि खासकर triacylglycerol (टैग) में मौजूद फैटी एसिड होता है, वाणिज्यिक हित के हैं. व्यावसायिक अनुप्रयोगों का विकास, फैटी एसिड सामग्री और संरचना की मात्रा का ठहराव के लिए विश्वसनीय विश्लेषणात्मक तरीकों की जरूरत है. सूक्ष्म शैवाल एक कठोर कोशिका दीवार से घिरा एकल कक्षों हैं. एक फैटी एसिड विश्लेषण विधि सभी एसाइल लिपिड और इस्तेमाल किया निष्कर्षण प्रक्रिया सभी एसाइल लिपिड वर्गों निकालने के लिए सक्षम होना चाहिए आजाद कराने के लिए पर्याप्त सेल व्यवधान प्रदान करना चाहिए.

विधि यहाँ प्रस्तुत के साथ microalgae में मौजूद सभी फैटी एसिड पहचान सही और reproducibly किया जा सकता हैtified और उनकी चेन लंबाई, unsaturation की डिग्री, या लिपिड वर्ग वे का हिस्सा हैं की स्वतंत्र नमूना की छोटी मात्रा में (5 मिलीग्राम) का उपयोग मात्रा.

इस विधि अलग लिपिड वर्गों के रिश्तेदार बहुतायत के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है, लेकिन एक दूसरे से लिपिड कक्षाएं अलग करने के लिए बढ़ाया जा सकता है.

विधि यांत्रिक सेल व्यवधान, विलायक आधारित लिपिड निष्कर्षण, फैटी एसिड मिथाइल एस्टर (fames) के लिए फैटी एसिड की ट्रान्सएस्टरीफिकेशन, और मात्रा का ठहराव और गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी खूंटी) का उपयोग fames की पहचान के एक दृश्य पर आधारित है. एक टैग आंतरिक मानक (tripentadecanoin) निष्कर्षण और अधूरा ट्रान्सएस्टरीफिकेशन दौरान नुकसान के लिए सही करने के लिए पूर्व विश्लेषणात्मक प्रक्रिया में जोड़ा जाता है.

Introduction

फैटी एसिड microalgal बायोमास के प्रमुख घटकों में से एक है और आमतौर पर सेल सूखी वजन 1-3 की 5-50% के बीच अप कर रहे हैं. वे glycerolipids के रूप में मुख्य रूप से उपस्थित रहे. बदले में ये glycerolipids मुख्य रूप से phospholipids, glycolipids, और triacylglycerol (टैग) से मिलकर बनता है. वे परिवहन ईंधन, थोक रसायनों, Nutraceuticals (ω-3 फैटी एसिड होता है), और खाद्य वस्तुओं 3-6 के उत्पादन के लिए एक संसाधन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है क्योंकि विशेष रूप से टैग में मौजूद फैटी एसिड होता है, वाणिज्यिक हित के हैं. सूक्ष्म शैवाल, समुद्र के पानी आधारित खेती मीडिया में विकसित कर सकते हैं स्थलीय पौधों की तुलना में काफी अधिक है areal उत्पादकता हो सकता है, और संभवतः भी अपतटीय, कृषि के लिए अनुपयुक्त हैं कि स्थानों पर photobioreactors में खेती की जा सकती. इन कारणों के लिए, microalgae अक्सर biodiesel और अन्य थोक उत्पादों 3-6 के उत्पादन के लिए स्थलीय पौधों के लिए एक आशाजनक विकल्प माना जाता है. संभवतः कोई कृषि एलऔर या ताजा पानी (बंद photobioreactors या जब में खेती जब समुद्री microalgae उपयोग किया जाता है) को अपने उत्पादन के लिए आवश्यक है. इसलिए, microalgae से व्युत्पन्न जैव ईंधन 3 पीढ़ी के जैव ईंधन माना जाता है.

फैटी एसिड (सूखी वजन का%), लिपिड वर्ग संरचना है, साथ ही फैटी एसिड की लंबाई और संतृप्ति की डिग्री की कुल सेलुलर सामग्री microalgae प्रजातियों के बीच अत्यधिक चर रहे हैं. इसके अलावा, इन गुणों में इस तरह के पोषक तत्वों की उपलब्धता, तापमान, पीएच, और प्रकाश की तीव्रता 1,2 के रूप में खेती की स्थिति के साथ बदलती हैं. नाइट्रोजन भुखमरी के संपर्क में जब उदाहरण के लिए, microalgae टैग की बड़ी मात्रा में जमा कर सकते हैं. इष्टतम विकास की स्थिति के अंतर्गत टैग आमतौर पर सूखी वजन का कम से कम 2% का गठन किया, लेकिन नाइट्रोजन भुखमरी टैग सामग्री के संपर्क में जब microalgal सूखी वजन 1 के ऊपर से 40% तक बढ़ सकता है.

सूक्ष्म शैवाल मुख्य रूप से 16 और 18 की चेन लंबाई के साथ फैटी एसिड का उत्पादनकार्बन परमाणुओं, लेकिन कुछ प्रजातियों की लंबाई 24 कार्बन परमाणुओं के फैटी एसिड बना सकते हैं. अत्यधिक असंतृप्त वसीय अम्लों microalgae द्वारा उत्पादित कर रहे हैं के रूप में दोनों के रूप में अच्छी तरह से संतृप्त. 6 (docosahexaenoic एसिड, डीएचए) कोई सब्जी विकल्प 1,2,4,7 मौजूद है जिसके लिए:; और C22 5 (ईपीए eicosapentaenoic एसिड): बाद C20 तरह पोषण संबंधी लाभों (ω-3 फैटी एसिड) के साथ फैटी एसिड शामिल हैं. फैटी एसिड श्रृंखला लंबाई और संतृप्ति की डिग्री (के वितरण) भी शैवाल व्युत्पन्न जैव ईंधन और खाद्य तेलों 4,8 के गुण और गुणवत्ता निर्धारित करता है.

Microalgal व्युत्पन्न फैटी एसिड के व्यावसायिक अनुप्रयोगों को विकसित करने, फैटी एसिड सामग्री और संरचना की मात्रा का ठहराव के लिए विश्वसनीय विश्लेषणात्मक तरीकों की जरूरत है.

के रूप में भी Ryckebosch एट अल. 9 से बताया, microalgae में फैटी एसिड का विश्लेषण (जैसे वनस्पति तेल, खाद्य उत्पादों, आदि जानवरों के ऊतकों) हो अन्य substrates से खुद को अलगकारण 1) microalgae लिपिड निष्कर्षण उलझी, कठोर सेल दीवारों से घिरा एकल कक्षों हैं, 2) microalgae लिपिड कक्षाओं की एक विस्तृत विविधता शामिल है और लिपिड वर्ग वितरण 7 अत्यधिक चर रहा है. ये अलग लिपिड कक्षाओं रासायनिक संरचना और ऐसे ध्रुवता के रूप में संपत्ति में एक व्यापक विविधता है. इसके अलावा, एसाइल लिपिड के अलावा अन्य लिपिड कक्षाओं का उत्पादन कर रहे हैं, 3) microalgae लंबाई में 12-24 कार्बन परमाणुओं से लेकर और दोनों संतृप्त करने के साथ ही अत्यधिक असंतृप्त फैटी एसिड से युक्त, फैटी एसिड की एक विस्तृत विविधता भी है. इसलिए, microalgae के अलावा अन्य substrates में फैटी एसिड का विश्लेषण करने के लिए विकसित की विधियों, microalgae में फैटी एसिड का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है.

Ryckebosch एट अल. 9 द्वारा समीक्षा के रूप में, आमतौर पर इस्तेमाल किया लिपिड निष्कर्षण प्रक्रियाओं के बीच मुख्य अंतर यह है कि इस्तेमाल किया जाता विलायक प्रणालियों में है. क्योंकि microalgae में मौजूद लिपिड वर्गों के बड़े विभिन्न प्रकार के, प्रत्येक polarity में अलग निकालेलिपिड मात्रा 10-12 इस्तेमाल किया विलायकों के साथ अलग अलग होंगे. इस लिपिड सामग्री और रचना साहित्य 9,10 में प्रस्तुत में विसंगतियों की ओर जाता है. विलायक इस्तेमाल किया प्रणाली पर निर्भर करता है, के माध्यम से सेल व्यवधान के बिना सॉल्वेंट एक्सट्रैक्शन पर आधारित विधियों, उदाहरण के लिए, मनका पिटाई या sonication, क्योंकि कुछ microalgae प्रजातियों 9,13 के कठोर संरचना के सभी लिपिड नहीं निकाल सकता है. अधूरा लिपिड निकासी के मामले में अलग लिपिड कक्षाओं की निकासी दक्षता 14 भिन्न हो सकती हैं. फैटी एसिड संरचना लिपिड कक्षाएं 7 के बीच चर रहा है, क्योंकि यह भी मापा फैटी एसिड संरचना पर असर पड़ सकता है.

हमारे विधि यांत्रिक सेल व्यवधान, विलायक आधारित लिपिड निष्कर्षण, फैटी एसिड मिथाइल एस्टर (fames) के लिए फैटी एसिड की ट्रान्सएस्टरीफिकेशन, और मात्रा का ठहराव और एक लौ ioniza साथ संयोजन में गैस क्रोमैटोग्राफी का उपयोग fames की पहचान के एक दृश्य पर आधारित हैtion डिटेक्टर (जीसी खूंटी). एक triacylglycerol (tripentadecanoin) के रूप में एक आंतरिक मानक पूर्व विश्लेषणात्मक प्रक्रिया में जोड़ा जाता है. निष्कर्षण और अधूरा ट्रान्सएस्टरीफिकेशन दौरान संभावित नुकसान के लिए तो सुधारा जा सकता है. विधि सामग्री का निर्धारण करने के साथ ही microalgal बायोमास में मौजूद फैटी एसिड की संरचना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. भंडारण (टैग) सहित के साथ ही झिल्ली लिपिड (glycolipids, phospholipids), पता चला रहे हैं, नमूना की ही छोटी मात्रा में (5 मिलीग्राम) का उपयोग पहचान की है और इस विधि से सही और reproducibly मात्रा निर्धारित अलग एसाइल लिपिड कक्षाओं में उपस्थित सभी फैटी एसिड . इस विधि अलग लिपिड वर्गों के रिश्तेदार बहुतायत के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है. हालांकि, विधि एक दूसरे को 1 से लिपिड कक्षाएं अलग करने के लिए बढ़ाया जा सकता है. विभिन्न लिपिड कक्षाओं की एकाग्रता और फैटी एसिड संरचना तो व्यक्तिगत रूप से निर्धारित किया जा सकता है.

साहित्य में कई अन्य तरीके हैंmicroalgae में लिपिड का विश्लेषण करने का वर्णन किया. अन्य तरीकों कुल फैटी एसिड 9,16 पर ध्यान केंद्रित है, जबकि कुछ तरीकों, कुल lipophilic घटक 15 पर ध्यान केंद्रित. इन विकल्पों कुल निकाले लिपिड gravimetric दृढ़ संकल्प, क्रोमैटोग्राफी का उपयोग मात्रा का ठहराव के साथ संयुक्त फैटी एसिड का प्रत्यक्ष पार एस्टरीफिकेशन, और lipophilic फ्लोरोसेंट रंगों के साथ धुंधला कोशिकाओं में शामिल हैं.

क्रोमैटोग्राफी का उपयोग फैटी एसिड की मात्रा का ठहराव के लिए एक अधिक इस्तेमाल किया विकल्प एक gravimetric दृढ़ संकल्प 17,18 का उपयोग लिपिड की मात्रा का ठहराव है. क्योंकि मानकीकृत विश्लेषणात्मक उपकरण (जैसे Soxhlet) की उपलब्धता की, प्रक्रिया निर्धारित करने के लिए आराम; एक gravimetric दृढ़ संकल्प के लाभ एक गैस chromatograph जैसे उन्नत और महंगे उपकरण के लिए आवश्यकताओं की कमी कर रहे हैं और एक gravimetric दृढ़ संकल्प कम समय लेने वाली से है क्रोमैटोग्राफी तरीकों आधारित है. अन्य संगठनों पर क्रोमैटोग्राफी आधारित विधियों का उपयोग करने का प्रमुख लाभएर हाथ एक ऐसी विधि में केवल फैटी एसिड मापा जाता है. एक gravimetric निर्धारण में पिगमेंट या स्टेरॉयड जैसे लिपिड, जिसमें गैर फैटी एसिड, भी दृढ़ संकल्प में शामिल किए गए हैं. इन गैर फैटी एसिड युक्त लिपिड कुल लिपिड का एक बड़ा हिस्सा (50%>) कर सकते हैं. एक (बायोडीजल के अनुप्रयोगों के लिए उदाहरण के लिए) फैटी एसिड सामग्री में ही रुचि है, तो एक gravimetric दृढ़ संकल्प का इस्तेमाल किया जाता है, यह overestimated किया जाएगा. इसके अलावा, एक gravimetric निर्धारण में निकाले लिपिड वजन करने के लिए इस्तेमाल किया विश्लेषणात्मक संतुलन की सटीकता इस्तेमाल किया जा करने की जरूरत है कि नमूने का आकार निर्धारित करता है. यह मात्रा आमतौर पर क्रोमैटोग्राफी प्रयोग किया जाता है जब जरूरत की राशि की तुलना में बहुत अधिक है. अंत में, gravimetric दृढ़ संकल्प से अधिक क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करने का एक और लाभ क्रोमैटोग्राफी फैटी एसिड की संरचना के बारे में जानकारी प्रदान करता है.

हमारे प्रस्तुत विधि करने के लिए एक अन्य विकल्प प्रत्यक्ष ट्रान्सएस्टरीफिकेशन 16,19,20 है.इस विधि में fames को लिपिड निष्कर्षण और फैटी एसिड का ट्रान्सएस्टरीफिकेशन एक कदम में संयुक्त रहे हैं. इस पद्धति का एक अलग निष्कर्षण और ट्रान्सएस्टरीफिकेशन कदम की तुलना में जल्दी है, लेकिन इन कदमों का संयोजन निकासी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि विलायकों सीमा. यह नकारात्मक निकासी दक्षता प्रभावित हो सकता है. एक अलग लिपिड निष्कर्षण और ट्रान्सएस्टरीफिकेशन कदम का एक और लाभ यह है कि इन कदमों से 1 के बीच एक अतिरिक्त लिपिड वर्ग अलग होने के लिए अनुमति देता है. प्रत्यक्ष ट्रान्सएस्टरीफिकेशन प्रयोग किया जाता है जब यह संभव नहीं है.

Microalgae में लिपिड की मात्रा का निर्धारण करने के लिए अन्य अधिक इस्तेमाल किया तरीकों ऐसे नील के रूप में lipophilic फ्लोरोसेंट धब्बे के साथ बायोमास धुंधला शामिल लाल या BODIPY और प्रतिदीप्ति संकेत 21,22 मापने. इन तरीकों में से एक लाभ यह है कि वे वैकल्पिक तरीकों से भी कम श्रमसाध्य हैं. इन तरीकों में से एक नुकसान यह फ्लोरोसेंट प्रतिक्रिया विभिन्न कारणों के लिए, है, चर तकनीक और नवीनता के बीच हैतों, खेती की स्थिति, लिपिड कक्षाएं, और विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं. एक उदाहरण के रूप में, इन बदलावों के कई microalgae से डाई के तेज में मतभेद की वजह से हैं. एक और मात्रात्मक पद्धति का उपयोग कैलिब्रेशन इसलिए अधिमानतः सब अलग खेती की स्थिति और विकास के चरणों के लिए प्रदर्शन किया, की जरूरत है. अंत में, इस विधि फैटी एसिड की संरचना के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं और क्रोमैटोग्राफी आधारित विधियों की तुलना में कम सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है नहीं करता है.

प्रस्तुत विधि LAMERS एट अल. 23 और सैंटोस एट अल. 24 से वर्णित विधि पर आधारित है और यह भी विभिन्न अन्य लेखकों 1,25-27 द्वारा लागू किया गया है. इसके अलावा अन्य तरीकों एक ही सिद्धांत पर आधारित हैं कि उपलब्ध हैं और इसी तरह के परिणाम 9,28 दे सकती है.

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Protocol

1. नमूना तैयार

1.1 और 1.2 कदम के रूप में तैयारी शामिल नमूने के लिए दो वैकल्पिक प्रोटोकॉल रहे हैं. दोनों तरीकों समान रूप से उपयुक्त हैं और इसी तरह के परिणाम दे, लेकिन शैवाल संस्कृति मात्रा का एक सीमित मात्रा में उपलब्ध है, तो विधि 1.1 की सिफारिश की है.

नोट: प्रोटोकॉल या तो के लिए, पूरे प्रोटोकॉल के अनुसार दो अतिरिक्त मनका डिब्बा ट्यूबों तैयार है लेकिन एक खाली के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए उन्हें शैवाल जोड़ने के बिना. इस तरह, प्रयुक्त सामग्री से घटकों की निकासी से उत्पन्न जीसी वर्णलेख में चोटियों की पहचान की और मात्रा निर्धारित किया जा सकता है.

1.1. नमूना तैयार प्रोटोकॉल विकल्प 1: अनुशंसित जब शैवाल संस्कृति का एक सीमित मात्रा में उपलब्ध है

  1. Breuer एट अल द्वारा वर्णित के रूप में उदाहरण के लिए, संस्कृति शोरबा में शैवाल सूखी वजन एकाग्रता (छ / एल) निर्धारित करते हैं. 1.
  2. 5-10 मिलीग्राम शैवाल सूखी वजन होता है कि संस्कृति शोरबा की एक मात्रा स्थानांतरणएक गिलास अपकेंद्रित्र ट्यूब. कदम 1.1.1 में निर्धारित बायोमास एकाग्रता का उपयोग कर स्थानांतरित बायोमास की सही मात्रा की गणना.
  3. 1200 x जी पर अपकेंद्रित्र 5 मिनट.
  4. सतह पर तैरनेवाला का हिस्सा त्यागें, ट्यूब में लगभग 0.25 मिलीलीटर छोड़ दें.
  5. द्वारा शेष सतह पर तैरनेवाला में शैवाल को निलंबित पुनः कोमल ऊपर और नीचे गोली pipetting और एक 200 μl विंदुक का उपयोग कर एक मनका डिब्बा ट्यूब को पूरा सेल गोली हस्तांतरण.
  6. ± 0.15 मिलीग्राम milliQ पानी के साथ अपकेंद्रित्र ट्यूब और कांच विंदुक कुल्ला और एक ही मनका डिब्बा ट्यूब तरल हस्तांतरण.
  7. सुनिश्चित करें कि कोई हवाई बुलबुले ट्यूबों के नीचे में रहते हैं बनाने के लिए अधिकतम rpm पर एक मिनट के लिए अपकेंद्रित्र मनका डिब्बा ट्यूबों. यह -80 डिग्री सेल्सियस पर बंद मनका डिब्बा ट्यूब स्टोर करने के लिए संभव है
  8. नमूना युक्त मनका डिब्बा ट्यूब Lyophilize. यह -80 डिग्री सेल्सियस पर बंद मनका डिब्बा ट्यूब स्टोर करने के लिए संभव है

1.2. नमूना तैयार प्रोटोकॉल विकल्प 2

  1. शैवाल संस्कृति शोरबा की एक अनपेक्षित मात्रा अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. यह बायोमास एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए या इस्तेमाल की मात्रा को मापने के लिए आवश्यक नहीं है.
  2. उपाय या संस्कृति के माध्यम में उपस्थित मुख्य लवण की एकाग्रता का उपयोग संस्कृति के माध्यम से परासारिता गणना.
  3. कदम 1.2.1 में उपयोग के रूप में संस्कृति के माध्यम से परासारिता जो लगभग एक अमोनियम formate समाधान, की, उसी मात्रा में सेल गोली resuspending द्वारा सेल गोली धो लें. एक equiosmolar अमोनियम formate समाधान कोशिकाओं की धुलाई के दौरान सेल lyses रोकता है.

नोट: कोशिकाओं वॉशिंग संस्कृति के माध्यम में मौजूद लवण दूर करने के लिए आवश्यक है. इस वजह से उनकी संस्कृति के माध्यम में उच्च नमक सांद्रता के समुद्री microalgae में फैटी एसिड के विश्लेषण के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. लवण अभी भी मौजूद होगा, इस पर बाद टी में निर्धारित किया जाएगा, जो सेल सूखी वजन की राशि की overestimation कारण होगाउसके प्रोटोकॉल. अमोनियम formate इस समाधान पूरी तरह से lyophilization दौरान लुप्त हो जाना और किसी भी अवशेषों छोड़ नहीं होगा क्योंकि कोशिकाओं को धोने के लिए प्रयोग किया जाता है.

  1. अपकेंद्रित्र शैवाल निलंबन और सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  2. सेल गोली Lyophilize.
  3. एक मनका डिब्बा ट्यूब में 5-10 मिलीग्राम lyophilized microalgae पाउडर वजन. सही वजन रिकार्ड.

2. सेल व्यवधान और लिपिड निकालना

नोट: इस खंड में एक व्यापक सेल विघटन प्रक्रिया का वर्णन है. शायद, सेल व्यवधान कदम से कुछ अनावश्यक हैं और कम व्यापक सेल व्यवधान कुछ microalgae प्रजातियों के लिए या कुछ खेती की स्थिति से व्युत्पन्न बायोमास के लिए एक ही परिणाम हो सकता है. हालांकि यह एक विशिष्ट स्थिति के लिए मान्यता की आवश्यकता होगी. इसलिए प्रस्तावित व्यापक विघटन प्रोटोकॉल सभी microalgal सामग्री के लिए उपयुक्त एक सार्वभौमिक विधि के रूप में सिफारिश की है.

  1. Tripentadecanoin का एक सटीक राशि (टी.आर. वजनतीन C15 युक्त iacylglycerol: 0 फैटी एसिड) और यह 4:05 (v / v) क्लोरोफॉर्म की एक बिल्कुल ज्ञात मात्रा में जोड़ने: मेथनॉल. इस तरह tripentadecanoin की एकाग्रता वास्तव में जाना जाता है. 50 मिलीग्राम / एल की एकाग्रता के लिए निशाना लगाओ Tripentadecanoin फैटी एसिड मात्रा का ठहराव के लिए आंतरिक मानक के रूप में कार्य करता है.
  2. जोड़ें 1 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म: मेथनॉल 04:05 (v / v) (अभिकर्मकों और उपकरण तालिका में निर्दिष्ट) प्रत्येक पिटाई ट्यूब tripentadecanoin युक्त. Beadbeater ट्यूब की टोपी के अंदर शेष कोई मोती है कि वहाँ की जाँच करें, इस ट्यूब की लीक में परिणाम होगा. विलायकों की सटीक इसके लिए एक सकारात्मक विस्थापन विंदुक का प्रयोग करें.
  3. मनका मनका डिब्बा ट्यूब प्रत्येक धड़कन के बीच आंतरिक एक 120 सेकंड के साथ, 60 सेकंड के लिए 2500 rpm पर हर बार 8x हराया.
  4. Teflon डालने पेंच टोपी के साथ एक स्वच्छ गर्मी प्रतिरोधी 15 मिलीलीटर गिलास अपकेंद्रित्र ट्यूब मनका डिब्बा ट्यूब से समाधान स्थानांतरण. साथ ही मनका डिब्बा ट्यूब से सभी मोती स्थानांतरित करने के लिए सुनिश्चित करें.
  5. थाज मनका डिब्बा ट्यूब, जोड़ 1 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म: मेथनॉल 04:05 (v / v) मनका डिब्बा ट्यूब, करीब टोपी और मिश्रण है, और 2.4 कदम से एक ही ग्लास ट्यूब के लिए इस समाधान के हस्तांतरण में tripentadecanoin युक्त. (क्लोरोफॉर्म की कुल 4 मिलीलीटर में: मेथनॉल 04:05 (v / v) युक्त tripentadecanoin नमूना प्रति प्रयोग किया जाता है - कदम 2.2 में जोड़ा गया 1 मिलीलीटर और 3 धोने कदम के लिए 3 मिलीग्राम) ट्यूब तीन बार धोएं.
  6. भंवर ग्लास 10 मिनट के लिए एक sonication स्नान में 5 सेकंड और sonicate के लिए ट्यूबों.
  7. 50 मिमी, जिसमें 2.5 milliQ पानी की मिलीलीटर जोड़ें 2 अमीनो-2-hydroxymethyl-प्रोपेन-1 ,3-diol (Tris) और एक एचसीएल समाधान का उपयोग पीएच 7 पर सेट है, जो 1 एम NaCl,. पानी: यह क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल के बीच एक चरण जुदाई का कारण होगा. 1 एम NaCl क्लोरोफॉर्म चरण की ओर लिपिड का संतुलन बढ़ाने के लिए प्रयोग किया जाता है.
  8. फिर 5 सेकंड के लिए भंवर और 10 मिनट के लिए sonicate.
  9. 1200 x जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
  10. एक गिलास पाश्चर pipett का उपयोग कर एक साफ ग्लास ट्यूब को पूरे क्लोरोफॉर्म चरण (नीचे चरण) स्थानांतरणई. किसी भी अंतरावस्था या शीर्ष चरण हस्तांतरण के लिए नहीं सुनिश्चित करें.
  11. (: पानी के घोल मेथनॉल युक्त) पुराने ट्यूब 1 एमएल क्लोरोफॉर्म जोड़कर नमूना निकालने पुनः.
  12. फिर 5 सेकंड के लिए भंवर और 10 मिनट के लिए sonicate.
  13. 1200 x जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
  14. 2.10 कदम से पहले क्लोरोफॉर्म अंश के साथ एक गिलास पाश्चर पिपेट और पूल का उपयोग क्लोरोफॉर्म चरण (नीचे चरण) लीजिए.
  15. कठिनाइयों पिछले चरण में पूरे क्लोरोफॉर्म अंश एकत्र करने में अनुभव कर रहे हैं, दोहराने 2.11-2.14 कदम. अन्यथा कदम 2.16 साथ आगे बढ़ना.
  16. एक नाइट्रोजन गैस धारा में ट्यूब से क्लोरोफॉर्म लुप्त हो जाना. इस कदम के नमूने एक नाइट्रोजन गैस वातावरण के तहत -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है के बाद.

3. फैटी एसिड मिथाइल एस्टर को ट्रान्सएस्टरीफिकेशन

  1. सूखे निकाले लिपिड (ट्यूब मूल रूप से क्लोरोफॉर्म अंश युक्त) युक्त ट्यूब के लिए 5% से युक्त 3 मिलीलीटर मेथनॉल (v / v) सल्फ्यूरिक एसिड जोड़ें औरकसकर ट्यूब बंद करें.
  2. 5 सेकंड के लिए भंवर.
  3. एक ब्लॉक हीटर या नहाने के पानी में 70 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए नमूने सेते हैं. समय समय पर (हर ± 30 मिनट) सुनिश्चित है कि नमूने उबलते (एक अनुचित बंद ढक्कन के कारण) और भंवर ट्यूब नहीं कर रहे हैं. इस प्रतिक्रिया के दौरान फैटी एसिड उनके फैटी एसिड मिथाइल एस्टर (fames) को methylated रहे हैं.
  4. कूल कमरे के तापमान के नमूने और 3 मिलीलीटर milliQ पानी और 3 मिलीग्राम एन हेक्सेन जोड़ें.
  5. 5 सेकंड के लिए भंवर और एक टेस्ट ट्यूब रोटेटर के साथ 15 मिनट के लिए मिश्रण.
  6. 1200 x जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
  7. 2 हेक्सेन (ऊपर) चरण की मिलीलीटर और एक गिलास पाश्चर पिपेट का उपयोग ताजा ग्लास ट्यूब में डाल लीजिए.
  8. इसे धोने के लिए एकत्र हेक्सेन चरण के लिए 2 मिलीलीटर milliQ पानी जोड़ें.
  9. 1200 x जी पर 5 मिनट के लिए 5 सेकंड और अपकेंद्रित्र के लिए भंवर. इस कदम के बाद यह नाइट्रोजन गैस वातावरण (आवश्यक नहीं चरण जुदाई) के तहत -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूने संग्रहीत करने के लिए संभव है.

4. Fames यू की मात्रागाओ गैस क्रोमैटोग्राफी

  1. एक गिलास पाश्चर पिपेट का उपयोग हेक्सेन चरण (ऊपरी चरण) के साथ जीसी शीशियों भरें.
  2. जीसी शीशियों पर टोपी रखें. शीशी से वाष्पीकरण को रोकने के लिए, टोपी पूरी तरह से सील कर रहे हैं, और नहीं दिया जा सकता है सुनिश्चित करें.
  3. जीसी धोने विलायकों (हेक्सेन) फिर से भरना, अपशिष्ट शीशियों खाली, और ऑटो पारखी में नमूना शीशियों डाल दिया. जीसी, पहला रन जीसी पर ही हेक्सेन युक्त 2 कारतूस पर वास्तविक नमूने को चलाने से पहले.
  4. एक Nukol स्तंभ (0.53 मिमी x 1.0 माइक्रोन 30 एमएक्स) के साथ एक जीसी खूंटी पर नमूने चलाएँ. 250 डिग्री सेल्सियस के इनलेट तापमान का प्रयोग करें और वाहक गैस, 81.7 kPa के दबाव और 0.1:1 का विभाजन अनुपात, कुल प्रवाह की दर के रूप में हीलियम का उपयोग करें: 20 मिलीग्राम / मिनट. 40 मिलीग्राम / मिनट की एच 2 प्रवाह की दर, 400 मिलीग्राम / मिनट की हवा का प्रवाह दर और उन्होंने 9.3 मिलीग्राम / मिनट की दर प्रवाह के साथ 270 डिग्री सेल्सियस के खूंटी डिटेक्टर तापमान. 1 μl / नमूना के लिए सेट इंजेक्शन मात्रा. एन हेक्सेन के साथ प्री और पोस्ट धो लगानेवाला. प्रारंभिक ओवन तापमान 0.5 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर सेट किया और तब बुद्धि उठाया हैघंटे 20 डिग्री सेल्सियस / मिनट 200 डिग्री सेल्सियस के एक ओवन के तापमान तक पहुँच जाता है. ओवन का तापमान फिर 39 मिनट के लिए 200 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा है. कुल चलाते समय 45 मिनट है.

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Representative Results

इस प्रक्रिया के माध्यम से प्राप्त किया जाता है कि एक विशिष्ट वर्णलेख चित्र 1 में दिखाया गया है. Fames इस्तेमाल किया जीसी स्तंभ और प्रोटोकॉल द्वारा आकार और संतृप्ति की डिग्री से अलग होती है. छोटे श्रृंखला लंबाई फैटी एसिड और अधिक संतृप्त फैटी एसिड (कम डबल बांड) कम प्रतिधारण समय है. इस्तेमाल किया जीसी स्तंभ और प्रोटोकॉल फैटी एसिड isomers (एक ही श्रृंखला की लंबाई और संतृप्ति की डिग्री है, लेकिन डबल बांड के विभिन्न पदों) को अलग करने का इरादा नहीं है, लेकिन यह एक अलग जीसी स्तंभ और प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है.

फैटी एसिड एकाग्रता और रचना जीसी चोटियों के क्षेत्र, आंतरिक मानक एकाग्रता (एमजी / एल) (2.1 कदम), और नमूना (एमजी) में जोड़ा बायोमास की राशि (कदम 1.1.2 या 1.2 उपयोग कर की गणना की जा सकती है. 6, नमूना तैयार प्रोटोकॉल) चुना गया था निर्भर करता है जिस पर.

बायोमास में प्रत्येक व्यक्ति फैटी एसिड (एमजी फैटी एसिड / ग्राम सूखी वजन) की सामग्री ख निर्धारित किया जा सकता है Y

1 समीकरण
C15 के क्षेत्र; जीसी वर्णलेख का एकीकरण (चित्रा 1) के रूप में निर्धारित से व्यक्तिगत प्रसिद्धि के क्षेत्र के साथ: 0 प्रसिद्धि जीसी वर्णलेख (चित्रा 1) के एकीकरण के द्वारा निर्धारित है;

2 समीकरण
साथ क्लोरोफॉर्म में tripentadecanoin की एकाग्रता [है]: मेथनॉल समाधान 2.1 चरण में निर्धारित; मेगावाट C15: 0 एफए C15 की आणविक भार: 0 फैटी एसिड (242.4 छ / mol); मेगावाट C15: 0 टैग आणविक वजन tripentadecanoin की (765.24 छ / mol);

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C15 की एकाग्रता [अंशांकन समाधान में 0 प्रसिद्धि C15]: के साथ, नमूने में उम्मीद की सभी व्यक्तिगत फैटी एसिड के 0 प्रसिद्धि और fames: में 0 प्रसिद्धि, जीसी पर अंशांकन समाधान चल C15 के मिश्रण से बाहर का गठन द्वारा निर्धारित अंशांकन समाधान (एमजी / एल), [व्यक्तिगत अंशांकन समाधान में प्रसिद्धि] अंशांकन समाधान (एमजी / एल) में व्यक्तिगत प्रसिद्धि की एकाग्रता, और अंशांकन समाधान की जीसी वर्णलेख के एकीकरण के द्वारा निर्धारित रूप में क्षेत्रों.

कुल फैटी एसिड सामग्री सभी व्यक्तिगत फैटी एसिड की राशि के रूप में गणना की जा सकती. प्रत्येक फैटी एसिड के रिश्तेदार बहुतायत कुल फैटी एसिड सामग्री द्वारा प्रत्येक व्यक्ति के फैटी एसिड की एकाग्रता को विभाजित करके गणना की जा सकती.

फैटी एसिड संरचना और दोनों नाइट्रोजन परिपूर्ण तहत Scenedesmus obliquus UTEX393 (Chlorophyceae) की सामग्री और शर्तों व्यय करना हैचित्रा 2 में दिखाया गया है. फैटी एसिड संरचना और सामग्री अत्यधिक नाइट्रोजन भुखमरी से प्रभावित हैं. एस में obliquus, C16: 0 (palmitic एसिड) और C18: 1 (ओलिक एसिड) दो सबसे प्रचुर मात्रा में फैटी एसिड होते हैं.

फैटी एसिड संरचना और दोनों नाइट्रोजन परिपूर्ण तहत Phaeodactylum tricornutum UTEX640 (डायटम) की सामग्री और शर्तों खलाना 3 चित्र में दिखाया गया. एस के लिए इसी प्रकार obliquus, फैटी एसिड सामग्री और संरचना अत्यधिक नाइट्रोजन भुखमरी से प्रभावित हैं. पी. 5 (eicosapentaenoic एसिड, ईपीए) के रूप में भी बहुत लंबी श्रृंखला फैटी एसिड (lignoceric एसिड, C24: 0) इस विधि से पता लगाया जा सकता है कि tricornutum भी ऐसे C20 के रूप में अत्यधिक असंतृप्त वसीय अम्लों की पर्याप्त मात्रा में उत्पादन होता है.

चित्रा 1 < br /> चित्रा 1. प्रतिनिधि जीसी खूंटी वर्णलेख. Scenedesmus से व्युत्पन्न obliquus नाइट्रोजन भुखमरी के संपर्क में एक नमूना इस्तेमाल किया गया था. केवल वर्णलेख के पहले 20 मिनट में दिखाए जाते हैं. 20 मिनट के बाद कोई चोटियों इस नमूने में पाया गया.

चित्रा 2
चित्रा 2. दोनों नाइट्रोजन पर्याप्त (काली सलाखों) और नाइट्रोजन वंचित खेती की स्थिति (सफेद सलाखों) के तहत Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae) की संरचना फैटी एसिड (फैटी एसिड के रिश्तेदार बहुतायत). कुल फैटी एसिड सामग्री (8.6 ± 0.5% और 44.7 ± 1.7% थे नाइट्रोजन के तहत सूखी वजन का%) पर्याप्त और नाइट्रोजन क्रमश: खेती की स्थिति वंचित. त्रुटि सलाखों दो विश्लेषणात्मक replicates के उच्चतम और निम्नतम मूल्य से संकेत मिलता है.

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चित्रा 3. दोनों नाइट्रोजन पर्याप्त (काली सलाखों) और नाइट्रोजन वंचित खेती की स्थिति (सफेद सलाखों) के तहत Phaeodactylum tricornutum (डायटम) की संरचना फैटी एसिड (फैटी एसिड के रिश्तेदार बहुतायत). कुल फैटी एसिड सामग्री क्रमश: 11.7 ± 0.9% और नाइट्रोजन पर्याप्त और नाइट्रोजन वंचित खेती की शर्तों के तहत 30.5 ± 1.1% (सूखी वजन का%), थे. त्रुटि सलाखों दो विश्लेषणात्मक replicates के उच्चतम और निम्नतम मूल्य से संकेत मिलता है.

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Discussion

वर्णित विधि सामग्री का निर्धारण करने के साथ ही microalgal बायोमास में मौजूद कुल फैटी एसिड की संरचना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. भंडारण (टैग) सहित के साथ ही झिल्ली लिपिड (phospholipids और glycolipids) सभी लिपिड वर्गों से प्राप्त फैटी एसिड होता है, पता चला रहे हैं. Microalgae में मौजूद हैं कि संतृप्ति की सभी फैटी एसिड श्रृंखला लंबाई और डिग्री का पता चला और प्रतिष्ठित किया जा सकता है. विधि यांत्रिक सेल व्यवधान, विलायक आधारित लिपिड निष्कर्षण, fames के लिए फैटी एसिड की ट्रान्सएस्टरीफिकेशन, और एक लौ ionization डिटेक्टर (जीसी खूंटी) के साथ संयोजन में गैस क्रोमैटोग्राफी का उपयोग fames की मात्रा का ठहराव पर आधारित है. इस विधि, नमूना (5 मिलीग्राम) की कम मात्रा की आवश्यकता सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और microalgae प्रजातियों में से एक विस्तृत विविधता के बीच किया जा सकता है. इस विधि विश्लेषणात्मक उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा करने का इरादा है और विशेष रूप से छोटा सा नमूना आकार का उपयोग के लिए सिलवाया है. विधि बड़ी निकालने के लिए ऊपर पहुंचा और इस्तेमाल किया जा इरादा नहीं हैmicroalgal फैटी एसिड की मात्रा. इस पद्धति का एक सीमा है कि यह श्रमसाध्य है और यह परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रक्रिया शुरू करने से कुछ दिन लग सकते हैं. विशेष रूप से औद्योगिक microalgal फैटी एसिड के उत्पादन के लिए प्रक्रिया की निगरानी के मामले में यह एक सीमा माना जा सकता है. तेजी से परिणाम की आवश्यकता है, इस तरह के lipophilic फ्लोरोसेंट रंगों के साथ धुंधला के रूप में अन्य विकल्प अधिक उपयुक्त हो सकता है. निम्नलिखित सिफारिशों विश्लेषणात्मक प्रक्रिया के प्रदर्शन के संबंध में बना रहे हैं:

  1. निष्कर्षण और ट्रान्सएस्टरीफिकेशन प्रक्रिया एक आंतरिक मानक के रूप में एक triacylglycerol (tripentadecanoin) का उपयोग करके मानकीकृत कर रहे हैं. एक आंतरिक मानक का उपयोग आमतौर पर गैस क्रोमैटोग्राफी का उपयोग नमूनों में fames की मात्रा का ठहराव के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन सबसे अधिक बार एक प्रसिद्धि आंतरिक मानक प्रयोग किया जाता है. यह एक टैग आंतरिक मानक के बजाय एक प्रसिद्धि आंतरिक मानक का उपयोग करने के लिए और सेल विघटन और सॉल्वेंट एक्सट्रैक्शन से पहले यह जोड़ने की सिफारिश की है. लिपिड extr दौरान संभव नुकसानयह समान घाटे आंतरिक मानक को घटित होता है कि उम्मीद है क्योंकि कार्रवाई या अधूरा ट्रान्सएस्टरीफिकेशन तो, के लिए सुधारा जा सकता है. एक आंतरिक मानक microalgae द्वारा उत्पादित फैटी एसिड के साथ सह Elute नहीं करता है कि प्रयोग किया जाना चाहिए. Microalgae केवल भी कार्बन संख्या के साथ फैटी एसिड का उत्पादन है, क्योंकि कार्बन परमाणुओं के एक विषम संख्या के साथ एक फैटी एसिड से युक्त एक टैग एक अच्छा उम्मीदवार है. जीसी स्तंभ और प्रोटोकॉल श्रृंखला लंबाई पर अलग लेकिन यह भी unsaturation की डिग्री पर ही नहीं है, क्योंकि कोई संतृप्त अजीब गिने फैटी एसिड सकता है hypothetically एक असंतृप्त भी गिने फैटी एसिड के साथ सह Elute. यह प्रयोग किया जाता आंतरिक मानक नमूने में स्वाभाविक रूप से मौजूद फैटी एसिड के साथ सह Elute नहीं करता कि मान्य किया जाना चाहिए. विभिन्न microalgae के साथ हमारे अनुभव में, tripentadecanoin (तीन C15 युक्त टैग: 0 फैटी एसिड) microalgae में स्वाभाविक रूप से मौजूद फैटी एसिड के साथ सह Elute नहीं करता है.
  2. संतृप्त और अत्यधिक असंतृप्त वसीय अम्लों (अलग जीसी खूंटी प्रतिक्रियाएं देशिखर क्षेत्रों) समान मात्रा में. इसलिए fames के मानकों प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में वर्णित व्यक्ति के रूप में फैटी एसिड के सापेक्ष प्रतिक्रिया कारकों की जांच और दृढ़ संकल्प के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. Fames के मानक भी व्यक्ति फैटी एसिड का अवधारण समय निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, जीसी एमएस फैटी एसिड की पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  3. अवधारण समय और व्यक्ति फैटी एसिड के सापेक्ष प्रतिक्रिया कारक दोनों जीसी उपकरण उम्र के साथ बदल जाएगा. अवधारण समय और रिश्तेदार प्रतिक्रिया कारक के लगातार अंशांकन इसलिए की सिफारिश की है.
  4. यांत्रिक सेल विघटन इस विधि में एक महत्वपूर्ण कदम है. यह lyophilization, मनका पिटाई और sonication के संयोजन के द्वारा एहसास है. सेल व्यवधान के बिना यह नहीं है कि सभी लिपिड 9,13 निकाले जाते हैं कि संभव है. शायद, सेल व्यवधान कदम से कुछ (उदाहरण के लिए कम मनका पिटाई टाइम्स) एक ही फिर से उपज सकता निरर्थक और कम व्यापक सेल व्यवधान हैंकुछ microalgae प्रजातियों के लिए या कुछ खेती की स्थिति से व्युत्पन्न बायोमास के लिए sults. हालांकि यह एक विशिष्ट स्थिति के लिए मान्यता की आवश्यकता होगी, इसलिए प्रस्तावित व्यापक विघटन प्रोटोकॉल की सिफारिश की है.
  5. विश्लेषणात्मक प्रक्रिया के दौरान इस्तेमाल किया विलायकों इस्तेमाल प्लास्टिक ट्यूब और विंदुक युक्तियाँ से घटकों को निकालने सकता है. ये निकाला घटक जीसी खूंटी का उपयोग fames का पता लगाने के साथ हस्तक्षेप कर सकता है. विशेष रूप से, मनका पिटाई के दौरान लंबे मनका हरा टाइम्स और उच्च तापमान घटकों contaminating में परिणाम होगा. हमारा अनुभव मनका हरा ट्यूब से निकाली घटकों जीसी खूंटी वर्णलेख में कुछ अतिरिक्त चोटियों, पर नतीजा यह है कि कुछ शैवाल व्युत्पन्न fames (मुख्य रूप से संतृप्त फैटी एसिड) के साथ जो ओवरले की. प्रस्तावित विधि मार डाला है, यह कुल शिखर क्षेत्र के अधिक से अधिक 1-2% कभी नहीं है. मनका पिटाई के दौरान मनका डिब्बा ट्यूब का ठंडा और नमूना प्रति बायोमास की बड़ी मात्रा का उपयोग सापेक्ष शिखर कम हो जाएगाइन प्लास्टिक व्युत्पन्न चोटियों के क्षेत्र. यह प्रोटोकॉल भर में जितना संभव हो उतना गिलास pipettes और ग्लास ट्यूब का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. इसके अलावा, कारतूस के उपयोग की जांच करने के लिए और प्लास्टिक से निकाली घटकों के लिए सही है, लेकिन यह भी जाँच करने के लिए और उदाहरण के लिए इस्तेमाल किया विलायकों में संदूषण के लिए सही है, की सिफारिश की है.
  6. मनका पिटाई प्रक्रिया के दौरान, मनका डिब्बा और मनका डिब्बा ट्यूबों दोनों गर्मी होगी. जब एक बहुत लंबे समय या इस विधि में प्रस्तावित की तुलना में ज्यादा RPM के लिए मनका पिटाई, और कोई ठंडा बीच में लागू किया जाता है, जब इस विलायकों के उबलते और ट्यूबों के अंत में टूटना में परिणाम कर सकते हैं. इस नमूने का एक नुकसान होगा. 6,000 rpm पर अधिक से अधिक 6 मिनट के लिए मनका पिटाई जब हमारे अनुभव में, इस स्थिति उत्पन्न होती है.
  7. सूक्ष्म शैवाल ऑक्सीकरण होने का खतरा हो सकता है, जो अत्यधिक असंतृप्त वसीय अम्लों का उत्पादन कर सकते हैं. Ryckebosch एट अल. 9 असंतृप्त च के ऑक्सीकरण की वजह से फैटी एसिड की संरचना में कोई परिवर्तन नहीं मनायाविभिन्न निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान Atty एसिड. यह स्वाभाविक रूप से microalgae में होने वाली एंटीऑक्सीडेंट ऑक्सीकरण से इन असंतृप्त वसीय अम्लों की रक्षा है कि प्रस्तावित किया गया था. यह ऑक्सीकरण हो सकता है कि संदिग्ध है, एक संभावना के रूप में लंबे समय एंटीऑक्सीडेंट fames साथ सह Elute नहीं करता है जैसे butylhydroxytoluene (BHT) के रूप में एक कृत्रिम एंटीऑक्सीडेंट जोड़ने के लिए होगा, और जब तक कि एंटीऑक्सीडेंट खेतों की राशि के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है के रूप में क्रोमैटोग्राफी 9. लंबी अवधि के भंडारण के दौरान ऑक्सीकरण रोकने के लिए, यह एक नाइट्रोजन गैस वातावरण के तहत -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर नमूनों की सिफारिश की है.
  8. Microalgae में मौजूद Lipases संभावित विश्लेषणात्मक प्रक्रिया के दौरान लिपिड hydrolyze और इसलिए परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं. Ryckebosch एट अल. 9 lyophilization lipases inactivates पाया. इसके अलावा, lipases फैटी एसिड नीचा नहीं है, लेकिन सिर्फ glycerolipids की ग्लिसरॉल समूह से उन्हें अलग. इसलिए, lipase गतिविधि प्रस्तुत फैटी ACI के साथ हस्तक्षेप नहीं करना चाहिएडी प्रोटोकॉल. Coenzyme एक पर फैटी एसिड गिरावट अधिनियम में शामिल एंजाइमों निष्कर्षण के दौरान फैटी एसिड होता है और इस तरह की गिरावट की घटना को सक्रिय इस प्रकार की संभावना नहीं लगती. फिर भी, इस मामले में यह glycerolipids से फैटी एसिड के enzymatic टूटने एक संभावना के रूप में लंबे समय तक अवरोध करनेवाला विश्लेषणात्मक प्रक्रिया ही 9 के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है, के रूप में इस तरह के isopropanol के रूप में एक lipase अवरोध करनेवाला, जोड़ने के लिए किया जाएगा, परिणाम प्रभावित हो सकता है कि संदेह है.

इस पद्धति का एक ठोस चरण निष्कर्षण चरण 2 (लिपिड निष्कर्षण) के बीच (एसपीई) जुदाई कदम और चरण 3 (ट्रान्सएस्टरीफिकेशन का उपयोग करके फैटी एसिड तटस्थ लिपिड की रचना (टैग) और ध्रुवीय लिपिड (phospholipids, glycolipids) यों और निर्धारित करने के लिए बढ़ाया जा सकता है उदाहरण के लिए) के रूप में वर्णित Breuer एट अल. 1. वांग और Benning 28 द्वारा वर्णित के रूप में वैकल्पिक रूप से, एक पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) कदम उदाहरण के लिए, विभिन्न ध्रुवीय लिपिड कक्षाएं अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

इस विधि उदाहरण के लिए, में इस्तेमाल किया जा के लिए बढ़ाया जा सकता है, पौधों, जानवरों के ऊतकों और अन्य सूक्ष्म जीवों. क्योंकि सेल व्यवधान पर जोर से, इस विधि को निकालने के लिए बहुत मुश्किल हो जाता है कि सामग्री में फैटी एसिड के विश्लेषण के लिए मुख्य रूप से उपयुक्त है.

विधि की निकासी भाग (1 और 2 दोहराएँ) पिगमेंट और अन्य lipophilic घटकों 23,25 की निकासी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सेल विघटन प्रक्रिया (पानी सहित) अन्य विलायक प्रणाली का उपयोग करके ऐसे स्टार्च या कार्बोहाइड्रेट के रूप में अन्य घटकों की निकासी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम का एक हिस्सा आर्थिक रूप से विज्ञान और प्रौद्योगिकी के सामरिक बेसिक रिसर्च (आई डब्लू टी-SBO) परियोजना धूप और BioSolar कोशिकाओं द्वारा अभिनव संवर्धन संस्थान द्वारा समर्थित किया गया. एरिक bolder और BackKim गुयेन मनका पिटाई प्रक्रिया का अनुकूलन करने के लिए उनके योगदान के लिए स्वीकार कर रहे हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
tripentadecanoin (C15:0 TAG) Sigma Aldrich T4257 CAS Number 7370-46-9
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample Sigma Aldrich
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample Lipidox
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample Larodan
Beadbeater Bertin Technologies Precellys 24
beadbeater tubes MP Biomedicals Lysing matrix E
116914500
GC-FID Hewlett-Packer HP6871
GC column Supelco Nukol 25357
Positive displacement pipette 100-1000μl Mettler Toledo MR-1000
Positive displacement pipet tips C-1000 Mettler Toledo C-1000
Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml VWR 612-1925
glass tubes VWR SCERE5100160011G1
TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000 VWR SCERE5100160011G1
Teflon coated screw-caps VWR SCERKSSR15415BY10
STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator VWR 445-2101
Heated Evaporator/Concentrator Cole-Parmer YO-28690-25

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References

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