Анализ жирных кислот содержание и состав микроводорослей

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Способ определения содержания жирных кислот и состава микроводорослей на основе механического разрушения клеток, на основе экстракции липидов растворителем, переэтерификации и количественного и идентификации жирных кислот с использованием газовой хроматографии описано. Tripentadecanoin внутренний стандарт используется для компенсации возможных потерь при добыче и неполной переэтерификации.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Breuer, G., Evers, W. A., de Vree, J. H., Kleinegris, D. M., Martens, D. E., Wijffels, R. H., Lamers, P. P. Analysis of Fatty Acid Content and Composition in Microalgae. J. Vis. Exp. (80), e50628, doi:10.3791/50628 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Способ для определения содержания и состава общего количества жирных кислот, присутствующих в микроводорослей описывается. Жирные кислоты являются основным компонентом микроводорослей биомассы. Эти жирные кислоты могут присутствовать в различных ацил-липидной классов. Особенно жирные кислоты, присутствующие в триацилглицерина (TAG) имеют коммерческий интерес, потому что они могут быть использованы для производства транспортного топлива, сыпучих химических веществ, биологически активные добавки (ω-3 жирных кислот), а также продовольственных товаров. Чтобы разрабатывать коммерческие приложения, надежные аналитические методы для количественного определения содержания кислоты жирного и состава необходимы. Микроводорослей одиночные клетки, окруженные жесткой клеточной стенки. Метод анализа жирных кислот должно обеспечить нарушение достаточное клеток, чтобы освободить все ацильные липиды и процедуры экстракции используется должны быть в состоянии извлечь все классы ацил липидные.

С метод, представленный здесь все жирные кислоты, присутствующие в микроводорослей можно точно и воспроизводимо тождающиеся и количественно, используя небольшое количество образца (5 мг) независимо от их длины цепи, степени ненасыщенности или класса липидов они являются частью.

Этот метод не дает информации о относительного обилия различных классов липидов, но может быть продлен, чтобы отделить классы липидов друг от друга.

Метод основан на последовательности механическое разрушение клеток, экстракции липидов на основе растворителя, переэтерификацией жирных кислот в метиловых эфиров жирных кислот (Fames), а также количества и идентификации МЭЖК с использованием газовой хроматографии (GC-FID). TAG внутренний стандарт (tripentadecanoin) добавляется до аналитической процедуры для коррекции потерь при добыче и неполной переэтерификации.

Introduction

Жирные кислоты являются одним из основных компонентов микроводорослей биомассы и обычно составляют от 5-50% клеточной сухого веса 1-3. Они в основном присутствуют в виде глицеролипидов. Эти глицеролипиды, в свою очередь состоят в основном из фосфолипидов, гликолипидов и триглицеридов (TAG). Особенно жирные кислоты, присутствующие в TAG имеют коммерческий интерес, потому что они могут быть использованы в качестве ресурса для производства транспортного топлива, сыпучих химических веществ, биологически активные добавки (ω-3 жирных кислот), а также продовольственных товаров 3-6. Микроводорослей может расти в морской воде на основе выращивания СМИ, может иметь гораздо более высокую поверхностную производительность, чем наземных растений, и могут быть выращены в фотобиореакторов в местах, непригодных для сельского хозяйства, возможно, даже в море. По этим причинам, микроводоросли часто считают перспективной альтернативой наземных растений для производства биодизеля и других сыпучих продуктов 3-6. не Потенциально не сельскохозяйственного ли или пресная вода (при культивировании в закрытых фотобиореакторов или когда морские водоросли используются) необходим для их производства. Таким образом, биотопливо, полученные из микроводорослей считаются 3 биотопливо й поколения.

Общий клеточный содержание жирных кислот (% от сухого веса), состав класса липидов, а также длины жирных кислот и степени насыщения сильно варьируют между микроводорослей видов. Кроме того, эти свойства меняются в зависимости от условий культивирования, такие как наличие питательных веществ, температуры, рН и интенсивности света 1,2. Например, при воздействии азотного голодания, микроводоросли могут накапливаться в больших количествах TAG. При оптимальных условиях роста TAG обычно составляет менее 2% от сухого веса, но при контакте с азотного голодания содержания TAG может увеличиться до до 40% от микроводорослей сухого веса 1.

Микроводорослей в основном производят жирные кислоты с длиной цепи от 16 до 18атомы углерода, но некоторые виды могут сделать жирных кислот вплоть до 24 атомов углерода в длину. Оба насыщенный а также ненасыщенных жирных кислот получают путем микроводорослей. К последним относятся жирные кислоты с питательной ценности (ω-3 жирных кислот), как С20: 5 (эйкозапентаеновая кислота; ЭПК) и С22: 6 (докозагексаеновая кислота; DHA), для которых нет растительные альтернативы не существуют 1,2,4,7. (Распределение) жировой длины цепи кислоты и степени насыщения также определяет свойства и качества водорослей, полученных биотоплива и пищевыми маслами 4,8.

Для разработки коммерческих приложений микроводорослей происходит жирных кислот, надежные аналитические методы для количественного определения содержания кислоты жирного и состава необходимы.

Кроме того, как указал Ryckebosch др.. 9, анализ жирных кислот в микроводорослей отличается от других субстратов (например, растительное масло, продукты питания, ткани животных и т.д.) бытьвызвать 1) микроводорослей одиночные клетки, окруженные жесткими стенками клеток, что затрудняет экстракции липидов, 2) микроводоросли содержат широкий спектр классов липидов и распределение липидов класс сильно варьирует 7. Эти различные классы липидов имеют широкий спектр по химической структуре и свойствам, таким как полярности. Кроме того, липидные классы, кроме ацильных липидов производятся; 3) микроводоросли содержат широкий спектр жирных кислот, в пределах от 12-24 атомов углерода в длину и содержит как насыщенные, так и ненасыщенных жирных кислот. Таким образом, методы, разработанные для анализа жирных кислот в других, чем микроводорослей субстратов, могут не подходить для анализа жирных кислот в микроводорослей.

Как показали в Ryckebosch др.. 9, основное различие между наиболее часто используемых процедур экстракции липидов в растворителя-систем, которые используются. Из-за большого разнообразия липидных классов, присутствующих в микроводорослей, каждый разной полярности, извлеченныйколичество липидов будет варьировать в зависимости растворителей, используемых 10-12. Это приводит к несогласованности в содержании липидов и композиции, представленные в литературе 9,10. В зависимости от системы используемого растворителя, методы, основанные на экстракции растворителем без разрушения клеток через, например, шарик избиение или ультразвуком, не могли бы извлечь все липиды из-за жесткой конструкции некоторых видов микроводорослей 9,13. В случае неполного экстракции липидов, эффективность экстракции из различных классов липидов может изменяться 14. Это также может оказывать влияние на измеренного состава жирных кислот, так как состав жирных кислот является переменной между липидными классов 7.

Наша методика основана на последовательности механическое разрушение клеток, экстракции липидов на основе растворителя, переэтерификацией жирных кислот в метиловых эфиров жирных кислот (Fames), а также количества и идентификации МЭЖК с использованием газовой хроматографии в сочетании с ионизации пламениДетектор уравнение (GC-FID). Внутреннего стандарта в виде триглицеридов (tripentadecanoin) добавляют до аналитической процедуры. Возможные потери при добыче и неполного переэтерификации затем могут быть исправлены в течение. Метод может быть использован для определения содержания а также состав жирных кислот, присутствующих в микроводорослей биомассы. Все жирные кислоты, присутствующие в различных ацил-липидной классов, включая хранение (TAG), а также мембранные липиды (фосфолипиды, гликолипиды), которые обнаружены, определенные и количественно точно и воспроизводимо этим методом, используя только небольшое количество образца (5 мг) . Этот метод не дает информации о относительного обилия различных классов липидов. Однако метод может быть расширен, чтобы отделить классы липидов друг от друга 1. Состав концентрация кислоты и жирных из различных классов липидов может быть определена индивидуально.

В литературе несколько другие методыописано для анализа липидов в микроводорослей. Некоторые методы сосредоточиться на общих липофильных компонентов 15, в то время как другие методы сосредоточиться на общего количества жирных кислот 9,16. Эти альтернативы включают весового определения общего извлеченных липидов, прямой транс-этерификации жирных кислот в сочетании с количественной использованием хроматографии, и окрашивания клеток с липофильных красителей люминесцентных.

Обычно используется альтернатива количественной оценки жирных кислот с использованием хроматографии является количественная оценка липидов с помощью весового определения 17,18. Преимущества весового определения являются отсутствие требований к передовой и дорогостоящего оборудования, как газовый хроматограф; облегчить настроить процедуру, из-за наличия стандартизированного аналитического оборудования (например Сокслета) и гравиметрические определения меньше времени, чем хроматографии на основе методов. Основное преимущество использования хроматографию, основанную на методы др.ER рука является то, что в таком способе измеряют только жирные кислоты. В весовом определении не-жирной кислоты, содержащий липиды, как пигменты или стероидов, также учитывается при определении. Эти не жирных кислот, содержащие липиды могут составить значительную долю (> 50%) общих липидов. Если заинтересован только в содержания жирных кислот (например, для применения биодизеля), он будет переоценить при использовании гравиметрических определение. Кроме того, в весовом определении точность аналитических весах используются для взвешивания извлеченные липиды определяет размер выборки, которая должна быть использована. Эта величина обычно значительно больше, чем количество, необходимое при использовании хроматографии. И, наконец, еще одно преимущество с помощью хроматографии на весового определения является то, что хроматографии дает информацию о составе жирных кислот.

Еще одной альтернативой нашей предложенного метода является прямым переэтерификации 16,19,20.В этом методе экстракции липидов и переэтерификации жирных кислот в МЭЖК объединены в одну стадию. Этот способ быстрее, чем отдельный экстракции и переэтерификации шаг, но сочетания этих шагов ограничивает растворители, которые могут быть использованы для извлечения. Это может негативно повлиять эффективность экстракции. Еще одним преимуществом отдельного экстракции липидов и переэтерификации стадии, что она позволяет для дополнительного разделения класса липидов между этими шагами 1. Это невозможно при использовании прямой переэтерификации.

Другие часто используемые методы для определения содержания липидов в микроводорослей включают окрашивания биомассы с липофильных флуоресцентных красителей, таких как Нил красный или BODIPY и измерения сигнала флуоресценции 21,22. Преимуществом этих методов является то, что они менее трудоемкий, чем альтернативные методы. Недостатком этих методов является то, что флуоресцентный ответ, по разным причинам, переменная между SPECIэс, условия культивирования, классы липидов и аналитические процедуры. В качестве примера, некоторые из этих изменений обусловлены различия в поглощения красителя в микроводорослей. Калибровка с помощью другого количественный метод Поэтому необходимо, предпочтительно выполняется для всех различных условий культивирования и стадий роста. Наконец, этот метод не дает информации о составе жирных кислот и является менее точным и воспроизводимым, чем хроматографии на основе методов.

Представленный способ основан на методике, описанной Lamers соавт. 23 и Santos соавт. 24 и также применяется в различных других авторов 1,25-27. Существуют и другие методы доступны, которые основаны на тех же принципах и может обеспечить аналогичные результаты 9,28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка образцов

Есть два альтернативных протоколов для пробоподготовки включены как шаги 1.1 и 1.2. Оба метода одинаково хорошо подходят и дают близкие результаты, но если ограниченное количество объема культуры водорослей имеется, метод 1.1 рекомендуется.

Примечание: В любом протокола, подготовить две дополнительные шарик било труб по всей протокола но без добавления к ним водоросли, которые будут использоваться в качестве бланка. Таким образом, пики в GC хроматограмме в результате экстракции компонентов из материалов, используемых могут быть идентифицированы и количественно.

1.1. Подготовка проб Протокол Вариант 1: Рекомендуемая Когда ограниченное количество водорослей культуры доступно

  1. Определить концентрацию водорослей сухой вес (г / л) в культуральном бульоне, например, как описано Breuer и соавт. 1.
  2. Передача объем культуральной жидкости, содержащий 5-10 мг сухого веса водоросли, чтобыстакан центрифуги трубки. Рассчитать точное количество биомассы, переведенные с помощью концентрации биомассы, определенной на этапе 1.1.1.
  3. Центрифуга 5 мин при 1200 х г.
  4. Отменить часть надосадочной жидкости, оставьте примерно 0,25 мл в трубке.
  5. Повторное приостановить водоросли в остальной супернатанта, осторожно пипеткой осадок вверх и вниз и передавать полный осадок клеток в шаровой колотушки трубки с помощью 200 мкл пипетки.
  6. Промыть центрифужную пробирку и стеклянную пипетку с ± 0,15 мл MilliQ воды и передавать жидкость к тому же борта колотушки трубки.
  7. Центрифуга шарик ударные трубки для одной минуты при максимальных оборотах, чтобы убедиться, что не пузырьки воздуха остаются в нижней части трубок. Можно хранить закрытые шарик било труб при температуре -80 ° С.
  8. Лиофилизацией шарик било пробирки, содержащие образец. Можно хранить закрытые шарик било труб при температуре -80 ° С.

1.2. Подготовка образцов Протокол Вариант 2

  1. Центрифуга неопределенный объем водоросли культуральной жидкости и отбросить супернатант. Это не является необходимым для определения концентрации биомассы или для измерения объема используется.
  2. Измерить или рассчитать осмолярность культуральной среды с использованием концентрации основных солей, присутствующих в культуральной среде.
  3. Промыть осадок клеток путем ресуспендирования осадок клеток в том же объеме, как используемый на стадии 1.2.1 из формиата аммония, что приблизительно соответствует осмолярности культуральной среды. Equiosmolar раствор формиата аммония предотвращает клеточные лизирует во врем промывки клеток.

Примечание: промывки клеток необходимо удалить соли, присутствующих в культуральной среде. Это особенно важно для анализа жирных кислот в морских микроводорослей из-за высоких концентрациях соли в их культуральную среду. Если соли все равно будет присутствовать, это привело бы к завышению суммы клеток сухой массы, которая будет определяться позже в тего протокол. Формиат аммония используется для мыть клетки, потому что это решение будет полностью испариться во время лиофилизации и не оставляет никаких остатков.

  1. Центрифуга водоросли подвеска и отбросить супернатант.
  2. Лиофилизуют осадок клеток.
  3. Взвесьте 5-10 мг лиофилизированного микроводорослей порошок в шаровой колотушки трубки. Запишите точный вес.

2. Разрушение клеток и Добыча липидов

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описываются обширный процедуру разрушения клеток. Возможно, некоторые из шагов, разрушения клеток являются избыточными и менее обширные разрушение клеток может дать те же результаты для некоторых видов микроводорослей или для биомассы, полученной из определенных условиях культивирования. Для этого потребуется проверки для каждой конкретной ситуации, однако. Поэтому предлагаемая обширная протокол нарушения рекомендуется в качестве универсального метода, пригодного для всех микроводорослей материала.

  1. Взвесьте точное количество tripentadecanoin (TRiacylglycerol, содержащий три C15: 0 жирных кислот) и добавить его к точно известного количества 4:05 (об / об) хлороформ: метанол. Таким образом, концентрация tripentadecanoin точно известно. Цель для концентрации 50 мг / л Tripentadecanoin служит в качестве внутреннего стандарта для количественного жирных кислот.
  2. Добавить 1 мл хлороформ: метанол 4:5 (объем / объем), содержащий tripentadecanoin в каждой трубке (размола, указанного в таблице реагентов и оборудование). Убедитесь, что нет никаких бусины остальные внутри крышки от beadbeater трубки, это приведет к утечке из трубок. Используйте положительное пипетки смещения для точного добавлением растворителей.
  3. Бусы бить шарик ударные трубки 8x на 2500 оборотов в минуту в течение 60 секунд, каждый раз с 120 с внутренней между каждым избиения.
  4. Переносят раствор из шарик ударными трубками в чистую термостойкого стекла 15 мл центрифужную пробирку с тефлоновой вставкой винтовыми крышками. Будьте уверены, чтобы передать все бусинки от бортового колотушки трубки, а также.
  5. Чтобы былоч шарик било трубки, добавляют 1 мл хлороформ: метанол 4:5 (объем / объем), содержащий tripentadecanoin в бисерной колотушки трубки, недалеко крышкой и смешивать, и передать это решение одной и той же стеклянной трубки с шагом 2,4. Промыть трубки три раза (в общей сложности 4 мл хлороформа и метанола 4:5 (объем / объем), содержащий tripentadecanoin на образец используют - 1 мл добавляют на стадии 2,2 и 3 мл в течение 3 стадий промывки).
  6. Вихревые стеклянные пробирки в течение 5 секунд и ультразвуком в ультразвуковой обработки бане в течение 10 мин.
  7. Добавить 2,5 мл MilliQ воде, содержащем 50 мМ 2-амино-2-гидроксиметил-пропан-1 ,3-диол (Трис) и 1 М NaCl, который установлен до рН 7 с помощью раствора HCl. Это приведет к фазовое разделение между хлороформом и метанол: вода. 1 М NaCl используется для повышения равновесие липидов по отношению к фазе хлороформ.
  8. Vortex в течение 5 секунд, а затем разрушать ультразвуком в течение 10 мин.
  9. Центрифуга течение 5 мин при 1200 х г.
  10. Перенесите всю фазу хлороформ (нижняя фаза) к чистой стеклянной трубки с использованием стекла Пастера pipettэ. Убедитесь в том, не передавать никакую интерфазу или верхнюю фазу.
  11. Повторно извлечения образца добавлением 1 мл хлороформа к старой трубы (содержащий метанол: водный раствор).
  12. Vortex в течение 5 секунд, а затем разрушать ультразвуком в течение 10 мин.
  13. Центрифуга течение 5 мин при 1200 х г.
  14. Соберите фазу хлороформ (нижняя фаза) с использованием стекла пипетки Пастера и бассейн с первой хлороформ фракции со стадии 2.10.
  15. Если трудности испытывают в сборе весь фракцию хлороформа в предыдущем шаге, повторите шаги 2.11-2.14. В противном случае перейдите к шагу 2.16.
  16. Упаривают хлороформ из трубки в потоке газообразного азота. После этого шага образцы можно хранить при -20 ° С в атмосфере азота.

3. Переэтерификация в метиловые эфиры жирных кислот

  1. Добавить 3 мл метанола, содержащего 5% (объем / объем) серной кислоты в пробирку, содержащую высушенные извлеченные липиды (трубка первоначально содержащие хлороформ) и фракциизакрыть трубку плотно.
  2. Vortex в течение 5 сек.
  3. Инкубируйте образцы в течение 3 часов при 70 ° С в нагревательном блоке или водяной бане. Периодически (каждые ± 30 мин) гарантировать, что образцы не кипящей (вызвано неправильно закрытой крышке) и вихревые трубки. Во время этой реакции жирных кислот, метилированный их метиловых эфиров жирных кислот (Fames).
  4. Прохладный образцы до комнатной температуры и добавляют 3 мл MilliQ воды и 3 мл н-гексана.
  5. Vortex в течение 5 сек и перемешивать в течение 15 мин с пробиркой ротатора.
  6. Центрифуга течение 5 мин при 1200 х г.
  7. Соберите 2 мл гексана (верхний) фазу и положить в пресной стеклянной трубки с использованием стекла пипетки Пастера.
  8. Добавить 2 мл MilliQ воды в собранной фазе гексан, чтобы вымыть его.
  9. Vortex в течение 5 сек и центрифуги в течение 5 мин при 1200 х г. После этого шага можно хранить образцы при -20 ° С в атмосфере газообразного азота (разделения фаз не нужно).

4. Количественная оценка Fames Uпеть газовой хроматографии

  1. Заполните GC флаконов с фазой гексан (верхняя фаза) с помощью стекла пипетки Пастера.
  2. Наведите колпачки с GC флаконах. Убедитесь, что крышки полностью герметизированы, и не может быть включен, для предотвращения испарения из флакона.
  3. Залейте в ГК мытья растворители (гексан) очищайте флаконов отходов, и поставить образцы флаконов в авто-сэмплер. Перед запуском фактические примеры на GC, первого запуска 2 заготовок, содержащие только гексан на GC.
  4. Запуск образцов на GC-FID с колонной Nukol (30 м х 0,53 мм х 1,0 мкм). Использование температуру на входе 250 ° С и использовать гелий в качестве газа-носителя, давлении 81,7 кПа и разделенного соотношении 0,1:1, общая скорость потока: 20 мл / мин. FID детектор температура 270 ° С с Н 2 скорости потока 40 мл / мин, скорости воздушного потока 400 мл / мин и скорость 9,3 мл / мин он течь. Установить объем впрыска до 1 мкл / образец. До и после мытья инжектор с н-гексана. Начальная температура печи установлен на 90 ° С в течение 0,5 мин и затем повышают умч 20 ° C / мин до тех пор температуре печи 200 ° С пока не будет достигнута. Температура термостата затем выдерживают при 200 ° С в течение 39 мин. Общее время выполнения составляет 45 мин.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Типичная хроматограмма, который получен с помощью этого процесса показана на рисунке 1. FAMEs разделены по размеру и степени насыщения на колонку для ГХ и используемого протокола. Более короткие длины цепи жирных кислот и более насыщенные жирные кислоты (меньше двойных связей) имеют более короткие времена удерживания. Используется колонка GC и протокол не намерены отделить изомеры жирных кислот (то же длины цепи и степени насыщения, но разных положениях двойных связей), но это может быть достигнуто с помощью другой столбец GC и протокол.

Концентрация жирных кислот и состав можно рассчитать, используя площадь ГХ пиков, концентрацию внутреннего стандарта (мг / л) (этап 2.1), и количество биомассы добавлен в образце (мг) (шаг 1.1.2 или 1.2. 6, в зависимости от того, какой протокол пробоподготовки была выбрана).

Содержание каждого отдельного жирной кислоты в биомассе (жирная кислота мг / г сухого веса) может быть определена б год

Уравнение 1
С Площадь индивидуального FAME, как это определено интеграции GC хроматограмме (рис. 1); Область С15: 0 известность как определяется интеграции GC хроматограмме (рис. 1);

Уравнение 2
С [IS] концентрация tripentadecanoin в смеси хлороформ: метанол решение как определено на этапе 2.1; MW C15: 0 FA молекулярная масса С15: 0 жирных кислот (242,4 г / моль); MW C15: 0 TAG молекулярная масса из tripentadecanoin (765,24 г / моль);

ighres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/50628/50628eq3.jpg "/>
Как определяется путем запуска калибровочных растворов на GC, составляя из смесей С15: 0 известность и Fames всех отдельных жирных кислот ожидаемых в образце, с [C15: 0 FAME в калибровочный раствор] концентрация С15: 0 известность в калибровочный раствор (мг / л); [индивидуальный FAME в калибровочный раствор] концентрация индивидуального FAME в калибровочного раствора (мг / л), а также районы, как это определено интеграции GC хроматограмме калибровочного раствора.

Общее содержание жирных кислот могут быть рассчитаны как сумма всех отдельных жирных кислот. Относительное содержание каждой жирной кислоты может быть рассчитана путем деления концентрации каждого отдельного жирной кислоты от общего содержания жирных кислот.

Состав жирных кислот и содержание Scenedesmus косой UTEX393 (Chlorophyceae) в рамках как изобилует азота и истощать условия являетсяпоказано на рисунке 2. Состав жирных кислот и контент, серьезно пострадавших от азотного голодания. В S. косая, С16: 0 (пальмитиновая кислота) и C18: 1 (олеиновая кислота) являются двумя наиболее распространенными жирных кислот.

Состав жирных кислот и содержание Phaeodactylum tricornutum UTEX640 (диатомовых) в рамках как изобилует азота и истощать условия показаны на рисунке 3. Подобно S. косая, содержание жирной кислоты и состав, серьезно пострадавших от азотного голодания. П. tricornutum также производит значительные количества высоко ненасыщенных жирных кислот, таких как С20: 5 (эйкозапентаеновой кислоты, EPA), а также очень длинноцепочечных жирных кислот (лигноцериновая кислота, С24: 0), которые можно обнаружить с помощью этого метода.

Рисунок 1 < бр /> Рисунок 1. Представитель хроматограмма GC-FID. Был использован образец происходит от Зсепейезтиз косая воздействию азотного голодания. Только первые 20 мин хроматограммы показаны. Через 20 мин никаких пиков не были обнаружены в этом образце.

Рисунок 2
Рисунок 2. Состав жирных кислот (относительное содержание жирных кислот) из Scenedesmus косой (Chlorophyceae) при обоих азота достаточно (черные полосы) и азота, лишенных условиях культивирования (белые столбики). Валовое содержание жирных кислот были 8,6 ± 0,5% и 44,7 ± 1,7% ( % от веса сухого) в атмосфере азота достаточно и азот лишен условий культивирования, соответственно. Столбики ошибок указывают на высокую и низкую стоимость двух аналитических повторностей.

палатка "FO: держать-together.within-страницу =" всегда "> Рисунок 3
Рисунок 3. Состав жирных кислот (относительное содержание жирных кислот) из Phaeodactylum tricornutum (диатомовых) при обоих азота достаточно (черные полосы) и азота, лишенных условиях культивирования (белые столбики). Валовое содержание жирных кислот были 11,7 ± 0,9% и 30,5 ± 1,1% (% от сухого веса) в атмосфере азота и азота, достаточных лишен условий культивирования, соответственно. Столбики ошибок указывают на высокую и низкую стоимость двух аналитических повторностей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Описанный способ может быть использован, чтобы определить содержание а также состав общего количества жирных кислот, присутствующих в микроводорослей биомассы. Жирные кислоты, полученные из всех классов липидов, включая хранение (TAG), а также мембранные липиды (фосфолипиды и гликолипиды), обнаружены. Все длины цепи жирной кислоты и степени насыщения, которые присутствуют в микроводорослей могут быть обнаружены и отличаются. Метод основан на механическое разрушение клеток, экстракции липидов на основе растворителя, переэтерификацией жирных кислот в МЭЖК, и количественной оценки МЭЖК с использованием газовой хроматографии в сочетании с пламенно-ионизационным детектором (ГХ-ПИД). Этот способ требует небольших количеств образца (5 мг), является точным и воспроизводимым и могут быть использованы среди самых разнообразных видов микроводорослей. Этот метод предназначен для использования для аналитических целей и специально приспособлены для использованием небольшого количества образца. Метод не предназначен для масштабирования вверх и используется для извлечения большойколичество микроводорослей жирных кислот. Ограничение этого метода является то, что является трудоемким и это может занять несколько дней от начала процедуры, чтобы получить результаты. Особенно в случае мониторинга процесса для промышленного производства микроводорослей жирной кислоты, это может рассматриваться как ограничение. Если более быстрые результаты необходимы, другие варианты, такие как окрашивания липофильных красителей люминесцентных может быть более подходящим. Следующие рекомендации сделаны в связи с выполнением аналитической процедуры:

  1. Добыча и процедура переэтерификации стандартизированы с помощью триглицеридов (tripentadecanoin) в качестве внутреннего стандарта. Использование внутреннего стандарта обычно используется для количественного определения МЭЖК в образцах с использованием газовой хроматографии, но чаще всего внутренний стандарт FAME используется. Рекомендуется использовать тег внутренний стандарт, а не славу внутренний стандарт и добавить его перед разрушения клеток и экстракции растворителем. Возможные потери при липидов ЕхПИдействие или неполной переэтерификации затем могут быть исправлены в течение, так как ожидается, что аналогичные потери будут происходить в внутреннего стандарта. Внутренний стандарт должен быть использован, что не со-элюат с жирными кислотами, производимых микроводорослей. Поскольку микроводорослей только производить жирных кислот с углеродными числами даже, TAG, содержащих жирную кислоту с нечетным числом атомов углерода является хорошим кандидатом. Поскольку столбец GC и протокол отделить не только от длины цепи, но и от степени ненасыщенности, насыщенным нечетные жирной кислоты может гипотетически со-элюат с ненасыщенной даже пронумерованной жирной кислоты. Это должно быть подтверждено, что использовали внутренний стандарт не со-элюат с жирными кислотами, естественно присутствующих в образце. По нашему опыту с различными микроводорослей, tripentadecanoin (TAG, содержащий три С15: 0 жирных кислот) не со-Элюируют жирных кислот, естественным образом присутствуют в микроводорослей.
  2. Насыщенный и сильно ненасыщенные жирные кислоты дают различные GC-FID ответы (пиков) при одинаковых концентрациях. Поэтому стандарты МЭЖК должны использоваться для калибровки и определения относительных коэффициентов чувствительности отдельных жирных кислот, как описано в разделе результатов репрезентативного. Стандарты МЭЖК также может быть использован, чтобы определить время удержания отдельных жирных кислот. Кроме того, ГХ-МС могут быть использованы для идентификации жирных кислот.
  3. И время удерживания и относительный коэффициент отклика отдельных жирных кислот изменится с GC оборудования возраста. Частое калибровка времени удерживания и относительной коэффициенту чувствительности Поэтому рекомендуется.
  4. Нарушение Механическая клеток является важным шагом в этом методе. Она реализуется путем сочетания лиофилизации, шарик избиения и ультразвуком. Без разрушения клеток, возможно, что не все липиды экстрагировали 9,13. Возможно, некоторые из этапов разрушения клеток являются избыточными и разрушение менее обширные клеток (например короче шарик раз избиение) может дать один и тот же повторнотаты для некоторых видов микроводорослей или для биомассы, полученной из определенных условиях культивирования. Для этого потребуется проверки для каждой конкретной ситуации, однако, поэтому предлагаемый обширная протокол нарушения рекомендуется.
  5. В аналитической процедуры, растворители, используемые может извлечь компоненты из пластмассовых трубок и наконечники пипеток, используемых. Эти извлеченные компоненты могут помешать обнаружения МЭЖК использованием GC-FID. Особенно, длительное время шарик-бить и высокая температура в течение борта избиения приведет к загрязнению компонентов. Наш опыт показывает, что компоненты, извлеченные из бисера биений труб приведет к несколько дополнительных пиков на хроматограмме GC-FID, некоторые из которых перекрывают при водорослей, полученных МЭЖК (главным образом насыщенные жирные кислоты). Когда метод выполняется в соответствии с предложением, это никогда не более 1-2% от общей площади пика. Охлаждение из бисера-ударными трубками во борта избиения и использования больших объемов биомассы на образец снизит относительную пикПлощадь этих пластиковых полученных пиков. Рекомендуется использовать стеклянные пипетки и стеклянные трубки как можно больше во всем протокола. Кроме того, использование пробелов, чтобы проверить и исправить для компонентов, извлеченных из пластмасс, но и проверить и исправить для загрязнений, например, в использованных растворителей, рекомендуется.
  6. В процессе шарик избиение, как шарик для взбивания и шарик-ударные трубки будет нагреваться. Когда шарик избиения в течение более длительного времени или много более высоких оборотах, чем предлагаемый в этом методе, а когда нет охлаждения не применяется в период, это может привести к кипению растворителей и в конечном итоге разрыва труб. Это приведет к потере образца. По нашему опыту, эта ситуация происходит, когда шарик избиение более 6 мин при 6000 оборотах в минуту.
  7. Микроводорослей может производить высоко ненасыщенных жирных кислот, которые могут быть склонны к окислению. Ryckebosch соавт. 9 не наблюдали никаких изменений в составе жирных кислот, вызванного окислением ненасыщенной еAtty кислоты во время различных процедур экстракции. Было предложено, что антиоксиданты природного происхождения в микроводорослей защитить эти ненасыщенные жирные кислоты от окисления. Если есть подозрение, что может произойти окисление, возможность можно было бы добавить синтетический антиоксидант, такой как бутилгидрокситолуол (ВНТ), пока антиоксидант не со-Элюируют МЭЖК, и при условии, что количество антиоксиданта отработанную не мешает хроматографии 9. Для предотвращения окисления во время длительного хранения, рекомендуется хранения образцов при температуре -80 ° С в атмосфере азота.
  8. Липазы присутствующие в микроводорослей может потенциально гидролиза липидов во время аналитической процедуры и, следовательно, влиять на результаты. Ryckebosch соавт. 9 установлено, что лиофилизации инактивирует липазы. Кроме того, липазы не ухудшают жирных кислот, а просто отделить их от глицерина группы глицеролипидов. Таким образом, активность липазы не должна вмешиваться в представленной жирной ацид протокол. Ферменты, участвующие в жировой акта деградации кислоты на коэнзима А активирована жирные кислоты и возникновение такой деградации в процессе добычи, таким образом, не кажется вероятным. Тем не менее, в случае, если есть подозрение, что ферментативное расщепление жирных кислот из глицеролипидов может повлиять на результаты, возможность можно было бы добавить ингибитор липазы, например, изопропанол, при условии, что ингибитор не мешает самой аналитической процедуры 9.

Этот метод может быть продлен для количественного определения и определения состава жирных кислот и нейтральных липидов (TAG) и полярные липиды (фосфолипиды, гликолипиды) с помощью твердофазной экстракции (SPE) стадии разделения между стадии 2 (экстракции липидов) и Шаг 3 (переэтерификации ), как описано, например Breuer и соавт. 1. В качестве альтернативы, тонкослойной хроматографии (ТСХ) шаг может быть использован для разделения различных классов липидов полярные, например, как описано Wang и Беннинге 28.

Этот метод может быть расширен для использования в, например, растения, ткани животных и другие микроорганизмы. Из-за акцентом на разрушения клеток, этот метод в основном подходит для анализа жирных кислот в материалах, которые очень трудно извлечь.

Извлечение часть метода (шаги 1 и 2) могут быть использованы для извлечения пигментов и других липофильных компонентов 23,25. Процедура разрушение клеток могут быть использованы для извлечения другими компонентами, такими как крахмал или углеводов с использованием других систем растворителей (включая воду).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Часть этой работы выполнена при финансовой поддержке Института содействия инновациям по науке и технике Стратегический фундаментальных исследований (ВВТ-СБО) проекта солнечного света и BioSolar клеток. Эрик Болдер и BackKim Нгуен признаны за их вклад в оптимизации процедуры избиения борта.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
tripentadecanoin (C15:0 TAG) Sigma Aldrich T4257 CAS Number 7370-46-9
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample Sigma Aldrich
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample Lipidox
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample Larodan
Beadbeater Bertin Technologies Precellys 24
beadbeater tubes MP Biomedicals Lysing matrix E
116914500
GC-FID Hewlett-Packer HP6871
GC column Supelco Nukol 25357
Positive displacement pipette 100-1000μl Mettler Toledo MR-1000
Positive displacement pipet tips C-1000 Mettler Toledo C-1000
Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml VWR 612-1925
glass tubes VWR SCERE5100160011G1
TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000 VWR SCERE5100160011G1
Teflon coated screw-caps VWR SCERKSSR15415BY10
STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator VWR 445-2101
Heated Evaporator/Concentrator Cole-Parmer YO-28690-25

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Breuer, G., Lamers, P. P., Martens, D. E., Draaisma, R. B., Wijffels, R. H. The impact of nitrogen starvation on the dynamics of triacylglycerol accumulation in nine microalgae strains. Bioresource Technology. 124, 217-226 (2012).
  2. Hu, Q., Sommerfeld, M., et al. Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances. The Plant Journal. 54, (4), 621-639 (2008).
  3. Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnology Advances. 25, (3), 294-306 (2007).
  4. Draaisma, R. B., Wijffels, R. H., et al. Food commodities from microalgae. Curr. Opin. Biotechnol. 24, (2), 169-177 (2012).
  5. Wijffels, R. H., Barbosa, M. J. An outlook on microalgal biofuels. Science. 329, (5993), 796-799 (2010).
  6. Wijffels, R. H., Barbosa, M. J., Eppink, M. H. M. Microalgae for the production of bulk chemicals and biofuels. Biofuels, Bioprod. Bioref. 4, (3), 287-295 (2010).
  7. Guschina, I. A., Harwood, J. L. Lipids and lipid metabolism in eukaryotic algae. Progress in Lipid Research. 45, (2), 160-186 (2006).
  8. Schenk, P. M., Thomas-Hall, S. R., et al. Second Generation Biofuels: High-Efficiency Microalgae for Biodiesel Production. BioEnergy Research. 1, (1), 20-43 (2008).
  9. Ryckebosch, E., Muylaert, K., Foubert, I. Optimization of an Analytical Procedure for Extraction of Lipids from Microalgae. Journal of the American Oil Chemists' Society. 89, (2), 189-198 (2011).
  10. Laurens, L. M. L., Dempster, T. A., et al. Algal Biomass Constituent Analysis: Method Uncertainties and Investigation of the Underlying Measuring Chemistries. Analytical Chemistry. 84, (4), 1879-1887 (2012).
  11. Iverson, S. J., Lang, S. L. C., Cooper, M. H. Comparison of the bligh and dyer and folch methods for total lipid determination in a broad range of marine tissue. Lipids. 36, (11), 1283-1287 (2001).
  12. Grima, E. M., Medina, A. R., et al. Comparison Between Extraction of Lipids and Fatty Acids from microalgal biomass. JAOCS. 71, (9), 955-959 (1994).
  13. Lee, J. Y., Yoo, C., Jun, S. Y., Ahn, C. Y., Oh, H. M. Comparison of several methods for effective lipid extraction from microalgae. Bioresour Technol. 101, Suppl 1 ement. 75-77 (2010).
  14. Guckert, J. B., Cooksey, K. E., Jackson, L. L. lipid solvent systems are not equivalent for analysis of lipid classes in the micro eukaryotic green alga. Journal of Microbiological Methods. 8, 139-149 (1988).
  15. Pruvost, J., Van Vooren, G., Cogne, G., Legrand, J. Investigation of biomass and lipids production with Neochloris oleoabundans in photobioreactor. Bioresource Technology. 100, (23), 5988-5995 (2009).
  16. Griffiths, M. J., Hille, R. P., Harrison, S. T. L. Selection of Direct Transesterification as the Preferred Method for Assay of Fatty Acid Content of Microalgae. 45, (11), 1053-1060 (2010).
  17. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol. Chem. 226, 497-509 (1956).
  18. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37, (8), 911-917 (1959).
  19. Lepage, G., Roy, C. C. Improved recovery of fatty acid through direct transesterification without prior extraction or purification. Journal of Lipid research. 25, 1391-1396 (1984).
  20. Welch, R. W. A micro-method for the estimation of oil content and composition in seed crops. J. Sci. Food Agric. 28, (7), 635-638 (1002).
  21. Chen, W., Zhang, C., Song, L., Sommerfeld, M., Hu, Q. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. Journal of Microbiological Methods. 77, (1), 41-47 (2009).
  22. Cooper, M. S., Hardin, W. R., Petersen, T. W., Cattolico, R. A. Visualizing "green oil" in live algal cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 109, (2), 198-201 (2010).
  23. Lamers, P. P., van de Laak, C. C., et al. Carotenoid and fatty acid metabolism in light-stressed Dunaliella salina. Biotechnology and Bioengineering. 106, (4), 638-648 (2010).
  24. Santos, A. M., Janssen, M., Lamers, P. P., Evers, W. A., Wijffels, R. H. Growth of oil accumulating microalga Neochloris oleoabundans under alkaline-saline conditions. Bioresour Technol. 104, 593-599 (2012).
  25. Mulders, K. J. M., Weesepoel, Y., et al. Growth and pigment accumulation in nutrient-depleted Isochrysis aff. galbana T-ISO. J. Appl. Phycol. (2012).
  26. Kliphuis, A. M., Klok, A. J., et al. Metabolic modeling of Chlamydomonas reinhardtii: energy requirements for photoautotrophic growth and maintenance. J. Appl. Phycol. 24, (2), 253-266 (2012).
  27. Lamers, P. P., Janssen, M., De Vos, R. C. H., Bino, R. J., Wijffels, R. H. Carotenoid and fatty acid metabolism in nitrogen-starved Dunaliella salina, a unicellular green microalga. Journal of Biotechnology. 162, (1), 21-27 (2012).
  28. Wang, Z., Benning, C. Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC). J. Vis. Exp. (49), e2518 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics