Mikroalglerden yağlı asit içeriği ve bileşimi analizi

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Mekanik hücre bozulması, solvent esaslı lipid ekstraksiyonu, transesterifikasyon ve miktar tayini ve gaz kromatografisi kullanılarak yağ asitlerinin tanımlanması göre mikroalg yağlı asit içeriği ve bileşimin belirlenmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Bir tripentadecanoin iç standart ekstraksiyon ve eksik transesterifikasyon esnasında muhtemel kayıpları telafi etmek için kullanılır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Breuer, G., Evers, W. A., de Vree, J. H., Kleinegris, D. M., Martens, D. E., Wijffels, R. H., Lamers, P. P. Analysis of Fatty Acid Content and Composition in Microalgae. J. Vis. Exp. (80), e50628, doi:10.3791/50628 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mikroalg içinde mevcut toplam yağ asitlerinin içerik ve bileşimin belirlenmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Yağ asitleri mikroalg biyokütle önemli bir bileşeni vardır. Bu yağ asitleri, farklı lipid açil-sınıfları içinde mevcut olabilir. Bunlar taşıma yakıtlar, dökme kimyasallar, nutrasötikler (ω-3 yağ asitleri) ve gıda maddelerinin üretimi için kullanılabilir, çünkü özellikle triaçilgliserol (TAG) olarak mevcut olan yağ asitleri, ticari ilgi çekmektedir. Ticari uygulamaları geliştirmek için, yağlı asit içeriği ve bileşimin ölçülmesi için güvenilir analitik yöntemlere ihtiyaç vardır. Mikroalg katı bir hücre duvarı ile çevrelenmiş bir hücrelerdir. Bir yağ asidi analizi yöntemi tüm asil lipidler ve kullanılan ekstraksiyon prosedürü tüm asil lipit sınıfları ayıklamak gerekir kurtarmak yeterli hücre parçalanmasından sağlamalıdır.

Burada sunulan yöntem ile mikroalg içinde mevcut bütün yağ asitlerinin kimliklerini, doğru ve tekrarlanabilir bir olabilir,tified ve zincir uzunluğu, doymamışlık derecesi veya lipit sınıfının parçası oldukları bağımsız numunenin küçük miktarlarda (5 mg) kullanılarak değerlendirilmiştir.

Bu yöntem, farklı lipid sınıfların görece bolluğu hakkında bilgi sağlamaz, ancak birbirinden lipit sınıfları ayırmak için uzatılabilir.

Yöntem, mekanik hücre bozulması, solvent bazlı lipid ekstraksiyonu, yağlı asit metil esterleri (FAME) için yağlı asitlerin esterlenmesi ve miktar tayini ve gaz kromatografisi (GC-FID) kullanılarak FAME tanımlanması bir dizi dayanmaktadır. TAG bir iç standart (tripentadecanoin) çıkarma ve eksik transesterifikasyon esnasında zararları düzeltmek için önce analitik prosedüre eklenir.

Introduction

Yağ asitleri mikroalg biyokütlenin en önemli bileşenlerinden biri olan ve tipik olarak hücre kuru ağırlığına 1-3 5-50% arasında oluşturan bulunmaktadır. Bunlar gliserolipidler şeklinde esas almaktadır. Bu da bu gliserolipidleri esas fosfolipidler, glikolipidler ve triaçilgliserol (TAG) oluşur. Bunlar taşıma yakıtlar, dökme kimyasallar, nutrasötikler (ω-3 yağ asitleri) ve gıda maddelerinin 3-6 üretimi için bir kaynak olarak kullanılabilir, çünkü özellikle TAG içinde mevcut olan yağ asitleri, ticari ilgi çekmektedir. Mikroalg, deniz suyu bazlı ekimi medya büyüyebilir karasal bitkilerin çok daha yüksek bir alansal verimlilik olabilir, ve hatta deniz, tarım için uygun olmayan yerlerde fotobiyoreaktörler ekili olabilir. Bu nedenlerden dolayı, genellikle mikroalg biyodizel ve dökme ürünler 3-6 üretimi için karasal bitkiler için umut verici bir alternatif olarak kabul edilir. Potansiyel hiçbir tarım lve veya tatlı su (kapalı fotobiyoreaktörler veya zaman içinde yetiştirilmiş deniz mikroalglanmn kullanılır) kendi üretimi için gereklidir. Bu nedenle, microalglerin türetilmiş biyoyakıt 3. nesil biyoyakıt olarak kabul edilir.

Yağ asitleri (kuru ağırlık% 'si), lipid sınıf bileşimin, hem de yağ asidi uzunluk ve doyma derecesi toplam hücre içeriği mikroalg türler arasında oldukça değişkendir. Ayrıca, bu gibi besin özellikleri, sıcaklık, pH, ve ışık yoğunluğu gibi 1,2 yetiştirme koşullarına göre değişir. Azot açlık maruz kaldığında, örneğin, mikroalg TAG büyük miktarlarda birikebilir. Optimal gelişim koşulları altında TAG genellikle kuru ağırlığının en az% 2'sini oluşturur, ancak azot açlık TAG içeriğine maruz mikroalg kuru ağırlığının 1 ile% 40 kadar artırabilir.

Mikroalg esas olarak 16 ve 18 arasında zincir uzunlukları olan yağlı asitlerin üretilmesiC-atomlu sikloalkil, ancak bazı türler uzunluğunda en çok 24 karbon atomlu yağ asitleri yapabilir. Yüksek ölçüde doymamış yağ asitleri mikroalg tarafından üretilen her iki yanı sıra, doymuş. 6 (dokosaheksaenoik asit, DHA) hiç bitkisel alternatifler 1,2,4,7 mevcut olduğu için: ve C22 5 (EPA eikosapentaenoik asit): Bu ikinci C20 gibi besin yararları (ω-3 yağ asitleri) olan yağ asitleri içerir. Yağ asidi zincir uzunluğu ve doygunluk derecesi (dağılımı) aynı zamanda yosun kaynaklı biyoyakıt ve yemeklik yağların 4,8 özelliklerini ve kalitesini belirler.

Mikroalg türetilen yağlı asitlerin ticari uygulamaları geliştirmek için, yağlı asit içeriği ve bileşimin ölçülmesi için güvenilir analitik yöntemlere ihtiyaç vardır.

Olarak da Ryckebosch ark. Tarafından 9 işaret, microalglerin yağ asitlerinin analizi (örneğin bitkisel yağ, gıda ürünleri vb hayvansal dokular) olmak başka yüzeylerde ayrılıyorneden 1) mikroalgler lipid ekstraksiyon zorlaştıran, sert hücre duvarları ile çevrili tek hücrelerdir; 2) mikroalgler lipit sınıfları geniş bir yelpazede içerir ve lipit sınıf dağılımı 7 derece değişkendir. Bu farklı lipit sınıfları, kimyasal yapısı ve bu gibi polarite özellikleri geniş bir çeşitlilik vardır. Aynı zamanda, lipid asil başka lipit sınıfları üretilmektedir, 3) mikroalg uzunluğu 12-24 karbon atomu arasında değişen ve her iki doymuş hem de yüksek ölçüde doymamış yağ asitleri ihtiva eden, yağlı asitler geniş bir yelpazede içerir. Bu nedenle, başka alt-tabakalar mikroalg yağ asitleri analiz etmek için geliştirilen yöntemler, mikroalg yağ asitleri analiz etmek için uygun olmayabilir.

Ryckebosch et al. 9 tarafından gözden olarak, yaygın olarak kullanılan lipid ekstraksiyon işlemleri arasındaki temel fark, kullanılan çözücü sistemleri bulunmaktadır. Çünkü mikroalg mevcut lipid sınıfların geniş çeşitliliği, her bir kutup arasında değişen, ekstraktlipid miktarı 10-12 kullanılan çözücülerin göre değişir. Bu durum, lipid içeriğine ve kompozisyon literatür 9,10 sunulan tutarsızlık yol açar. Kullanılan çözücü sistemine bağlı olarak, üzerinden hücre bozulma olmadan solvent ekstraksiyon işlemlerinde kullanılan yöntemler, örneğin, boncuk dayak veya ultrasonik titreşim nedeniyle bir mikroalg türlerinin 9,13 bükülmez yapının tüm lipidlerin çıkarılmasına olabilir. Eksik lipid ekstraksiyon yapılması halinde ise, farklı lipid sınıfların ekstraksiyon verimi 14 değişebilir. Yağ asidi bileşimi, lipit sınıfları 7 arasındaki değişken olduğu için bu, aynı zamanda, ölçülen yağlı asit bileşimi üzerinde bir etkisi olabilir.

Önerilen yöntem, mekanik hücre bozulması, lipid bazlı solvent ekstraksiyon, yağlı asit metil esterleri (FAME) için yağlı asitlerin esterlenmesi ve miktar ve bir alev ioniza ile bir arada gaz kromatografisini kullanarak FAME tanımlanması bir dizi dayanırtion dedektörü (GC-FID). Bir triaçilgliserol (tripentadecanoin) şeklinde bir iç standart önce analitik prosedüre eklenir. Ekstraksiyon ve eksik transesterifikasyon esnasında olası zararlar daha sonra düzeltilebilir. Bir yöntem olup, içeriğinin belirlenmesi hem de mikroalg biyokütle içinde mevcut olan yağlı asitlerin bileşim için kullanılabilir. Depolama (TAG) da dahil olmak üzere hem de membran lipitleri (glikolipitler, fosfolipitler) tespit edilir, örnek yalnızca küçük miktarda (5 mg) kullanılarak belirlendi ve bu yöntem ile, doğru ve tekrarlanabilir bir miktarı, farklı lipid açil-sınıfları içinde mevcut bütün yağ asitlerinin . Bu yöntem, farklı lipid sınıfların görece bolluğu hakkında bilgi sağlamaz. Bununla birlikte, bu yöntem birbirini 1 lipit sınıfları ayırmak için uzatılabilir. Farklı sınıfların lipid konsantrasyonu ve yağlı asit bileşimi daha sonra ayrı ayrı tespit edilebilir.

Literatürde birçok yöntem vardırmikroalg lipitlerini analiz etmek için tarif edildiği. Diğer yöntemler, toplam yağ asitleri 9,16 odaklanmak oysa Bazı yöntemler, toplam lipofilik bileşenlerin 15. odaklanmak. Bu alternatifler çıkarılan toplam lipidlerin gravimetrik belirlenmesi, kromatografisi kullanılarak miktar ile birlikte yağ asitlerinin doğrudan trans-esterleştirme ve lipofilik florasan boyalarla boyanan hücreleri içerir.

Kromatografisi ile yağ asitlerinin miktarının için genel olarak kullanılan bir alternatif, bir gravimetrik belirlenmesi 17,18 kullanılarak lipidlerin miktar olduğunu. Çünkü standart analitik donanımları (örn. Soklet) kullanılabilirliği, prosedürü kurmak kolay,, bir gravimetrik tayini Avantajları gazkromatograf'ın gibi gelişmiş ve pahalı ekipman için şartların eksikliği ve bir gravimetrik tayini daha az zaman harcayarak daha kromatografi yöntemleri göre. Oth üzerinde kromatografi dayalı yöntemler kullanmanın büyük avantajıer el Böyle bir yöntemde, sadece yağ asitleri ölçülür olmasıdır. Gravimetrik belirlenmesinde pigmentler veya steroidler gibi lipidler içeren non-yağlı asit, aynı zamanda belirlenmesi dahildir. Bu non-yağ asidi içeren lipidler toplam lipidlerin büyük bir oranda (>% 50) kadar yapabilirsiniz. On (biyodizel uygulamaları için örneğin) yağlı asit içeriğinin sadece ilgi ise, bir gravimetrik belirlenmesi kullanıldığı zaman, bu fazla tahmin edilecektir. Buna ek olarak, bir gravimetrik belirlenmesi ekstre lipidlerin tartmak için kullanılan analitik denge hassasiyeti kullanılması gereken örnek boyutunu belirler. Bu miktar genellikle kromatografisi kullanıldığında gereken miktarın çok daha fazladır. Son olarak, gravimetrik belirlenmesi üzerinde kromatografisi kullanmanın diğer bir avantajı kromatografisi yağ asidi bileşimi hakkında bilgi sağlamasıdır.

Bizim sunulan yöntemin bir başka alternatif doğrudan transesterifikasyon 16,19,20 olduğunu.Bu yöntemde FAME lipid ekstraksiyonu ve yağlı asitlerin transesterifikasyon bir aşamada birleştirilir. Bu yöntem, ayrı bir çıkarma ve transesterifikasyon aşamasından daha hızlı, ancak şu adımları birleştirme ekstre için kullanılabilir çözücüler sınırlar. Bu olumsuz ekstraksiyon verimini etkileyebilir. Ayrı bir lipid ekstraksiyonu ve transesterifikasyon aşamasından bir başka avantajı, bu adımlardan 1 arasında ek lipid sınıfı ayrılması için izin vermektedir. Doğrudan transesterifikasyon kullanıldığı zaman bu mümkün değildir.

Mikroalg lipid içeriğini belirlemek için yaygın olarak kullanılan diğer yöntemler, Nil gibi lipofilik floresan boyalar ile biyokütleyi boyama dahil kırmızı ya da BODIPY ve floresans sinyali 21,22 ölçülmesi. Bu yöntemlerin bir avantajı, diğer yöntemlere göre daha az zahmetli olmasıdır. Bu yöntemlerin bir dezavantajı, floresan tepkisi, çeşitli nedenlerle, değişkendir, belli coğrafi arasında olmasıdıres, yetiştirme koşulları, lipit sınıfları, ve analitik prosedürler. Bir örnek olarak, bu varyasyonların birkaç mikroalg ile boya alımından farklılıklardan kaynaklanır. Başka bir nicel bir yöntem kullanılarak kalibrasyon bu nedenle tercihen tüm farklı yetiştirme koşulları ve büyüme aşamaları için gerçekleştirilen gereklidir. Son olarak, bu yöntem, yağ asidi bileşimi hakkında bilgi vermek ve kromatografi göre yöntemlerden daha az hassas ve tekrarlanabilir değildir.

Sunulan yöntem Lamers et al. 23 ve Santos ve arkadaşları. 24 tarafından tarif edilen yönteme göre ve aynı zamanda diğer çeşitli yazarlar tarafından 1,25-27 uygulanmıştır. Ayrıca diğer yöntemler aynı ilkelere dayalı olduğunu mevcuttur ve benzer sonuçlar 9,28 sağlayabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Numune Hazırlama

1.1 ve 1.2 adımları gibi hazırlık dahil numune için iki alternatif protokolleri vardır. Her iki yöntem de eşit derecede uygundur ve benzer sonuçlar verir, fakat yosun kültür hacmi sınırlı bir miktarda mevcut ise, yöntem 1.1 önerilir.

NOT: Her iki protokol için, bütün protokole göre, iki ek boncuk döver tüpler hazırlamak ancak boş olarak kullanılmak üzere onlara yosun eklemeden. Bu şekilde, kullanılan malzemelerin bileşenlerin çıkması sonucu GC kromatogramda tepe noktaları belirlendi ve miktarları tayin edilebilir.

1.1. Numune Hazırlama Protokolü Seçenek 1: Önerilen zaman Yosun Kültür Sınırlı Miktarı Temin

  1. Breuer ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi, örneğin, kültür et suyu içinde yosun kuru ağırlık konsantrasyonu (g / L) belirler. 1..
  2. 5-10 mg yosun kuru ağırlığı içeren bir kültür et suyunun hacmi aktarmabir cam santrifüj tüpü. 1.1.1 adımda belirlenen biyokütle konsantrasyonu kullanılarak transfer biyokütle tam miktarını hesaplayın.
  3. 1200 x g santrifüj 5 dk.
  4. Yüzer bir kısmını atın, tüp içinde, yaklaşık 0.25 ml bırakın.
  5. Geri kalan süpernatan içinde yeniden askıya yosun yumuşak aşağı ve yukarı pipetlenerek pelet ve 200 ul, bir pipet kullanılarak boncuk dövme tüp için tam bir hücre pelletini aktarın.
  6. ± 0.15 ml MilliQ su ile santrifüj tüpü ve cam pipet yıkayın ve aynı boncuk dövme tüpüne sıvının aktarın.
  7. Hiçbir hava kabarcığı tüplerin alt kalması için en rpm'de bir dakika boyunca santrifüj tüpleri boncuk çırpıcı. Bu, -80 ° C de kapalı bir boncuk döver tüplerini muhafaza etmek mümkündür
  8. Örneği içeren boncuk dövücü tüpleri liyofilize. Bu, -80 ° C de kapalı bir boncuk dövme tüplerini muhafaza etmek mümkündür

1.2. Numune Hazırlama Protokolü 2. Seçenek

  1. Alg kültür suyu belirsiz bir hacmi Santrifüj ve süpernatant atın. Bu biyokütle konsantrasyonu belirlemek için veya kullanılan hacmini ölçmek için gerekli değildir.
  2. Ölçüm veya kültür ortamı içinde mevcut olan ana tuzlarının konsantrasyonu kullanılarak kültür ortamının ozmolaritesini hesaplar.
  3. Adım 1.2.1 kullanılan kültür ortamının ozmolaritesini yaklaşan bir amonyum format çözeltisinin, aynı hacimde hücre topağın tekrar askıda bırakılmasıyla hücre pelletini yıkayın. Bir equiosmolar amonyum format çözeltisi, hücrelerin yıkanması sırasında hücre lysis oluşumunu önler.

NOT: hücreleri yıkama kültür ortamı içinde mevcut tuzları çıkartmak için gereklidir. Bunun nedeni, bunların kültür ortamı içinde yüksek tuz konsantrasyonları deniz mikroalg yağlı asit analizi için özellikle önemlidir. Tuzlar hala mevcut olurdu, bu daha sonra t belirlenecektir hücre kuru ağırlığının miktarının overestimation neden olurOnun protokolü. Amonyum format bu Çözelti liyofilizasyon sırasında buharlaşmaya ve herhangi bir kalıntı bırakmaz çünkü hücreleri yıkamak için kullanılır.

  1. Santrifüj alg süspansiyon ve atma yüzer.
  2. Hücre pelletini liyofilize edilir.
  3. Bir kordon çırpıcı tüp içine 5-10 mg liyofilize toz mikroalg tartılır. Tam ağırlığını kaydedin.

2. Hücre Parçalanması ve Lipid Ekstraksiyon

NOT: Bu bölümde geniş bir hücre parçalama prosedürü açıklanmaktadır. Muhtemelen, hücre bozulması bazı adımlar gereksiz ve az kapsamlı hücre parçalama bazı mikroalgler türler için veya belirli yetiştirme koşullarında elde biyokütle için aynı sonuçlar olabilir. Ancak bu her özel durum için doğrulama gerekir. Bu nedenle, önerilen geniş bir bozulma protokolü bütün mikroalg malzemesi için uygun olan evrensel bir yöntem olarak tavsiye edilir.

  1. Tripentadecanoin kesin bir miktar (tr tartmakÜç C15 ihtiva eden iacylglycerol: 0 yağ asitleri) ve 04:05 (v / v) kloroform içinde bir tam olarak belli miktar ekleyin: metanol. Bu şekilde tripentadecanoin konsantrasyonu tam olarak bilinir. 50 mg / L'lik bir konsantrasyonda nişan Tripentadecanoin yağlı asit ölçümü için iç standart olarak hizmet vermektedir.
  2. Ekle 1 ml kloroform: metanol 4:05 (h / h) (reaktiflere ve donanım tablosunda belirtilen) her bir dayak tüpe tripentadecanoin ihtiva etmektedir. Beadbeater tüpün kap içinde kalan herhangi bir boncuk olup olmadığını kontrol edin, bu boruların sızıntı neden olur. Çözücülerin doğru bir sıra için bir pozitif yer değiştirme pipet kullanın.
  3. Boncuk boncuk çırpıcı tüpleri her dayaktan arasındaki iç bir 120 saniye ile 60 saniye boyunca 2,500 rpm'de her zaman 8x yendi.
  4. Teflon uç vidalı kapaklar ile temiz ısıya dayanıklı bir 15 ml santrifüj tüpüne cam boncuk dövme tüplerden çözüm aktarın. Yanı sıra boncuk çırpıcı tüpten tüm boncuklar aktarmak için emin olun.
  5. Olduğu için,h boncuk çırpıcı boru eklemek, 1 ml kloroform: metanol 04:05 (v / v) boncuk çırpıcı tüp, kap ve yakın karıştırın ve aşama 2.4 'ten aynı cam tüp, bu çözelti içine aktarmak tripentadecanoin ihtiva etmektedir. (Kloroform içinde toplam 4 ml: metanol 04:05 (v / v) ihtiva eden tripentadecanoin numune başına kullanılmıştır - Adım 2.2 'de ilave edildi, 1 ml ile 3 yıkama işlemi boyunca 3 ml) tüpü üç kez yıkayın.
  6. Vortex cam, 10 dakika boyunca bir sonikasyon banyosu içinde 5 saniye ve sonikasyon için borular.
  7. 50 mM ihtiva eden 2.5 ml MilliQ su ekleyin 2-amino-2-hidroksimetil-propan-1 ,3-diol (Tris) ve bir HCI çözeltisi kullanılarak pH 7'ye ayarlanır 1 M NaCl,. Su: Bu, kloroform ve metanol arasında bir faz ayrılmasına neden olur. 1 M NaCl kloroform fazının doğru lipidlerin dengeyi arttırmak için kullanılır.
  8. Daha sonra 5 saniye vorteksleyin ve 10 dakika boyunca ultrasonik titremeye maruz bırakılır.
  9. 1.200 x g, 5 dakika boyunca santrifüj.
  10. Bir cam Pasteur pipett kullanarak temiz bir cam tüpe tüm kloroform fazı (alt faz) aktarıne. Herhangi interfazda veya üst faz aktarmak için değil emin olun.
  11. (: Su solüsyonu metanol ihtiva eden), eski tüp için 1 ml kloroform ilave edilerek örnek ayıklamak yeniden.
  12. Daha sonra 5 saniye vorteksleyin ve 10 dakika boyunca ultrasonik titremeye maruz bırakılır.
  13. 1.200 x g, 5 dakika boyunca santrifüj.
  14. Adım 2.10 ilk kloroform fraksiyonu ile bir cam Pasteur pipet kullanılarak ve havuz kloroform fazı (alt faz) toplayın.
  15. Zorluklar önceki adımda tüm kloroform fraksiyonunun deneyimli tekrarlayın 2,11-2,14 adımları. Aksi takdirde aşama 2.16 ile devam edin.
  16. Bir azot gazı akımı içinde tüpten kloroform buharlaştırın. Bu adım, numuneler bir azot gazı atmosferi altında -20 ° C'de saklanabilir sonra.

3. Yağlı asit metil esterleri ile transesterifikasyon

  1. Kurutulmuş ekstrakt lipitleri (tüp ilk olarak kloroform fraksiyonu ihtiva eder) ihtiva eden bir tüpe% 5 ihtiva eden 3 mi metanol (v / v) sülfürik asit eklenir vetüpü sıkıca kapatın.
  2. 5 saniye için Vortex.
  3. Bir blok ısıtıcı ya da su banyosu içerisinde 70 ° C'de 3 saat boyunca inkübe edin. Periyodik (Her ± 30 dk) emin olun numuneler kaynar (bir yanlış kapağı kapalı kaynaklanan) ve vorteks tüpler değildir. Bu reaksiyon sırasında, yağ asitlerin, yağlı asit metil esterleri (FAME) için metile edilir.
  4. Soğuk, oda sıcaklığına kadar örnekler ve 3 ml MilliQ su ve 3 ml n-heksan ilave edin.
  5. 5 saniye vorteksleyin ve test tüpü rotatifine ile 15 dakika boyunca karıştırın.
  6. 1.200 x g, 5 dakika boyunca santrifüj.
  7. 2 hekzan (üst) faz ml ve bir cam Pasteur pipeti kullanarak taze cam tüp koymak toplayın.
  8. Yıkamak için toplanan heksan faza 2 ml MilliQ su ekleyin.
  9. 1.200 x g, 5 dakika boyunca 5 saniye ve santrifüj vorteksleyin. Bu adımdan sonra azot gazı atmosferi (gerekli değildir faz ayrımı) altında -20 ° C'de örnekleri saklamak mümkündür.

4. Fames U KantitasyonuSing Gaz Kromatografi

  1. , Bir cam Pasteur pipet kullanılarak heksan faz (üst faz) ile GC şişe doldurun.
  2. GC şişelerdeki kapakları yerleştirin. Flakon buharlaşmayı önlemek için, kapaklar tamamen kapatılır ve açılamaz emin olun.
  3. GC yıkama çözücüler (hekzan) doldurun, atık şişeleri boşaltın, ve oto-örnekleyici numune şişeleri koymak. GC, ilk çalıştırma GC sadece hekzan içeren 2 boşluklar üzerinde gerçek örnekleri çalıştırmadan önce.
  4. Bir Nukol kolonu (0.53 mm x 1.0 um, 30 x) ile birlikte, bir GC-FID ile ilgili örnekleri çalıştırın. 250 ° C'lik giriş sıcaklığı kullanarak ve taşıyıcı gaz, 81.7 kPa basıncı ve 0.1:1 arasında bölünmüş oranı, toplam akış hızı olarak helyum kullanın: 20 ml / dak. 40 ml / dk 'lık akış oranında 2 H, 400 ml / dak hava akış oranı ve O, 9.3 ml / dk akış oranı ile 270 ° C'lik FID detektörü sıcaklığı. 1 ul / numune enjeksiyon hacmi için ayarlayın. N-hekzan ile öncesi ve sonrası yıkama enjektör. Başlangıç ​​fırın sıcaklığı 0.5 dakika boyunca 90 ° C olarak ayarlanmış ve daha sonra wit yükseltilirh 20 ° C / dak, 200 ° C'lik bir fırın sıcaklığına kadar ulaşılır. Fırın sıcaklığı, daha sonra 39 dakika boyunca 200 ° C 'de muhafaza edilir. Toplam çalışma süresi 45 dk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu işlem ile elde edilen tipik bir kromatogramı, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Fames Kullanılan GC kolon ve protokolü ile boyut ve doyma derecesi ile ayrılır. Kısa zincirli yağ asitleri ve uzunluğu daha fazla doymuş yağlı asitler (daha az çift bağlar) daha kısa tutma süresine sahip. Kullanılan GC kolon ve protokol yağ asidi izomerleri (aynı zincir uzunluğu ve doygunluk derecesi, ancak çift bağların farklı pozisyonlar) ayırmak niyetinde değilim, ama bu farklı bir GC sütunu ve protokolü kullanılarak elde edilebilir.

Yağlı asit konsantrasyonu, ve bileşimi GC tepe alanı, iç standart konsantrasyonu (mg / L) (adım 2.1) ve örnek (mg) eklendi biyokütle miktarı (aşama 1.1.2 ya da 1.2 kullanılarak hesaplanabilir. 6, numune hazırlama protokolü) seçildi bağlı olarak hangi.

Biyokütle her bir yağ asidi (yağ asidi mg / g kuru ağırlık) içeriği b belirlenebilir y

Denklem 1
C15 Bölgesi; GC kromatogram entegrasyonu (Şekil 1) ile belirlenen bireysel FAME Metrekare: 0 FAME GC kromatogramda (Şekil 1) entegrasyonu ile saptandığı haliyle;

Denklem 2
Ile kloroform içinde tripentadecanoin konsantrasyonu, [IS]: metanol çözeltisi Adım 2.1 'de tespit edilen, MW C15: 0 FA C15 molekül ağırlığı: 0 yağlı asit (242.4 g / mol) MW C15: 0 TAG moleküler ağırlık tripentadecanoin of (765,24 g / mol);

ighres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50628/50628eq3.jpg "/>
C15 konsantrasyonu: [kalibrasyon çözeltisi içinde 0 FAME C15]: ile, örnek beklenen tüm tek tek yağlı asitlerin 0 FAME ve Fames: 0 FAME, GC kalibrasyon çözüm çalışan C15 karışımları üzerinden sağlanması ile tespit edildiği üzere Kalibrasyon çözeltisi (mg / L), [ayrı kalibrasyon çözelti içinde FAME] kalibrasyon çözeltisi (mg / L) 'de tek tek FAME konsantrasyonu ve kalibrasyon çözeltinin GC kromatogram entegrasyonu ile saptandığı haliyle alanları.

Toplam yağlı asit içeriği, tüm tek tek yağlı asitlerin toplamı olarak hesaplanabilir. Her bir yağ asidi nispi bolluk, toplam yağlı asit içeriği ile, her bir yağ asidi konsantrasyonunun bölünmesiyle hesaplanabilir.

Yağ asidi kompozisyonu ve hem de azot dolu altında Scenedesmus'u obliquus UTEX393 (Chlorophyceae) içeriği ve koşulları tüketmek olduğunuŞekil 2'de gösterilmiştir. Yağ asidi kompozisyonu ve içeriği yüksek azot açlık etkilenir. S. In obliquus, C16: 0 (palmitik asit) ve C18: 1 (oleik asit) en bol iki yağ asitleridir.

Yağlı asit kompozisyonu ve hem de azot altında dolu Phaeodactylum tricornutum UTEX640 (diatom) içeriği ve koşulları tüketen Şekil 3'te gösterilmiştir. S. benzer obliquus, yağlı asit içeriği ve bileşimi oldukça azot açlık etkilenir. P. 5 (eikosapentaenoik asit, EPA) yanı sıra, çok uzun zincirli yağ asitleri (lignoserik asit, C24: 0), bu yöntem ile tespit edilebilir tricornutum, aynı zamanda, C20 gibi yüksek ölçüde doymamış yağ asitlerinin önemli miktarda üretir.

Şekil 1 < br /> Şekil 1. Temsili GC-FID kromatogram. Scenedesmus türetilen obliquus azot açlık maruz kalan bir numune kullanıldı. Yalnızca kromatogram ilk 20 dakika gösterilmiştir. 20 dakika sonra hiçbir tepe Bu örnek tespit edilmiştir.

Şekil 2,
Şekil 2. Her iki azot yeterli (siyah çubuklar) ve azot yoksun yetiştirme koşulları (beyaz çubuklar) altında Scenedesmus Obliquus (Chlorophyceae) yağlı asit kompozisyonu (yağ asitlerinin göreli bolluk)., Toplam yağlı asit içeriği (8.6 ± 0.5 ve% 44.7 ±% 1.7 idi azot altında kuru ağırlığının%) yeterli ve azot sırasıyla, yetiştirme koşulları yoksun. Hata çubukları iki analitik çoğaltır yüksek ve en düşük değerini gösterir.

çadır "fo: keep-together.within-page =" Her zaman "> Şekil 3,
Şekil 3,. Her iki azot yeterli (siyah çubuklar) ve azot yoksun yetiştirme koşulları (beyaz çubuklar) altında Phaeodactylum tricornutum (diatom) yağlı asit kompozisyonu (yağ asitlerinin göreli bolluk). Toplam yağlı asit içeriği, sırasıyla 11.7 ±% 0.9, ve azot, yeterli ve azot yoksun yetiştirme koşulları altında 30.5 ± 1.1% (kuru ağırlığının%) idi. Hata çubukları iki analitik çoğaltır yüksek ve en düşük değerini gösterir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tarif edilen yöntem olup, içeriğinin belirlenmesi hem de mikroalg biyokütle içinde mevcut toplam yağ asitlerinin bileşim için kullanılabilir. Depolama (TAG) da dahil olmak üzere hem de membran lipitleri (fosfolipidler ve glikolipidler) tüm lipit sınıfları, elde edilen yağ asitleri, tespit edilir. Mikroalg mevcut doygunluk her yağlı asit zincir uzunlukları ve dereceleri tespit ve ayırt edilebilir. Yöntem, mekanik hücre bozulması, solvent bazlı lipid ekstraksiyonu, FAME yağlı asitlerin esterlenmesi ve bir alev iyonizasyon detektörü (GC-FID) ile kombinasyon halinde gaz kromatografisini kullanarak FAME miktarının dayanmaktadır. Bu yöntem, numune (5 mg), az miktarda gerektirir doğru ve tekrarlanabilir ve mikroalg türlerinin geniş bir yelpazede arasında kullanılabilir. Bu yöntem, analitik amaçlar için kullanılmak üzere tasarlanmıştır ve özellikle küçük numune boyutlarını kullanmak için özel olarak tasarlanmıştır. Yöntem, büyük çıkarılması için çekim ölçekli ve kullanılmak üzere tasarlanmamıştırmikroalg yağlı asitlerin miktarları. Bu yöntemin bir sınırlaması zahmetli olduğunu ve sonuçlar elde etmek prosedürü başlamadan bir kaç gün alabilir olmasıdır. Özellikle endüstriyel mikroalg yağlı asit üretimi için işlem izleme durumunda bu bir sınırlama olarak kabul edilebilir. Daha hızlı sonuç gerekli ise, bu lipofilik florasan boya ile boyama gibi diğer seçenekler daha uygun olabilir. Aşağıdaki öneriler analitik işlemi gerçekleştirmeden konusunda yapılır:

  1. Ekstraksiyon ve transesterifikasyon prosedür bir iç standart olarak bir triaçilgliserol (tripentadecanoin) kullanılarak standardize edilmiştir. Dahili bir standart kullanımı genelde gaz kromatografisini kullanarak örneklerinde FAME miktarının belirlenmesi için kullanılır, ancak genellikle bir iç standart FAME kullanılır. Bu TAG iç standart ziyade FAME iç standart kullanımı ve hücre bozulması ve solvent ekstraksiyon önce eklemeniz tavsiye edilir. Lipid extr sırasında muhtemel zararlarınbenzer kayıplar iç standart meydana beklenmektedir çünkü hareket veya eksik sonra transesterifikasyon için düzeltilebilir. Bir iç standart mikroalg ile üretilen yağlı asitler ile birlikte elute olmamasıdır kullanılmalıdır. Mikroalg sadece daha karbon sayıları ile yağlı asitlerin üretilmesi için, C-atomlu bir tek sayı olan bir yağlı asit ihtiva eden bir TAG iyi bir adaydır. GC sütunu ve protokol zincir uzunluğuna ayrı değil, aynı zamanda doymamışlık derecesine sadece için, doymuş bir tek sayılı yağ asidi olabilir teorik olarak doymamış çift sayılı bir yağ asidi ile birlikte elute. Bu kullanılan iç standart numune içinde doğal olarak mevcut olan yağlı asitler ile birlikte elute etmediğini kontrol edilmelidir. Çeşitli microalglerin ile bizim deneyim, tripentadecanoin (üç C15 içeren TAG: 0 yağ asitleri) microalglerin doğal olarak bulunan yağ asitleri ile birlikte uzaklaştırma yok.
  2. Doymuş ve doymamış yüksek oranda yağlı asitlerin (çeşitli GC-FID yanıtlar verirtepe alan) aynı konsantrasyonlarda. Bu nedenle FAME standartlarını temsil sonuçlar bölümünde tarif edildiği gibi ayrı ayrı yağlı asitlerin nispi tepki faktörlerinin kalibrasyon ve belirlenmesi için kullanılmalıdır. FAME standartları da tek tek yağlı asitlerin tutma süresini belirlemek için kullanılabilir. Seçenek olarak ise, GC-MS yağlı asit tanımlanması için de kullanılabilir.
  3. Retansiyon süresi ve tek tek yağlı asitlerin nispi yanıt faktörü Hem GC ekipman yaş ile değişecektir. Gecikme süresi ve nispi yanıt faktörü Sık sık kalibrasyon bu nedenle tavsiye edilir.
  4. Mekanik hücre parçalama Bu yöntemde önemli bir adımdır. Bu liyofilizasyon, boncuk dayak ve sonikasyon bir kombinasyonu ile gerçekleştirilmektedir. Hücre bozulması olmadan tüm lipidler 9,13 ekstre edilmiştir mümkündür. Muhtemelen, hücre bozulması bazı adımlar (örneğin kısa boncuk dayak kez) aynı yeniden verim olabilir gereksiz ve az kapsamlı hücre parçalama vardırBazı mikroalgler türler için veya belirli yetiştirme koşullarında elde biyokütle için sults. Ancak bu her özel durum için doğrulama gerekir, bu nedenle önerilen kapsamlı bozulma protokol önerilir.
  5. Analitik prosedürü sırasında kullanılan çözücüler, kullanılan plastik tüpler ve pipet uçları bileşenleri çıkarmak olabilir. Çıkartılan bu bileşenler GC-FID kullanılarak FAME tespiti ile etkileşebilir. Özellikle, boncuk dövmenin içinde uzun bir boncuk-atım süresi ve yüksek sıcaklık bileşenleri kirlenmesine neden olur. Tecrübemiz boncuk-beat tüplerden ekstre bileşenleri, GC-FID kromatogram içinde birkaç ek tepe ile sonuçlanacaktır ki, alg türetilmiş FAME (özellikle doymuş yağ asitleri) ile hangi katlamalı arasında. Önerilen yöntem olarak yürütüldüğünde, bu toplam tepe alanının% 1-2 daha fazla değildir. Boncuk dayak sırasında kordon-çırpıcı tüplerin soğutma ve örnek başına biyokütle büyük miktarları kullanılarak göreli tepe azaltacaktırbu plastik türevi tepelerin alan. Bu protokol boyunca mümkün olduğu kadar cam pipet ve cam tüpler kullanılması tavsiye edilir. Ayrıca, işlenmemiş kontrol etmek için kullanımı ve plastikten ekstre bileşenler için doğru değil, aynı zamanda kontrol etmek ve örneğin kullanılan çözücüler içinde kirlenmeden için doğru, tavsiye edilir.
  6. Boncuk dövme işlemi sırasında, boncuk çırpıcı ve kordon-çırpıcı tüpler her iki ısınır. Ne zaman çok daha uzun bir süre ya da bu yöntemde, önerilen çok daha yüksek devir için boncuk-dayak ve herhangi bir soğutma arasında uygulandığı zaman, bu çözücülerin kaynama ve tüplerin sonunda kopmalara neden olabilir. Bu numunenin bir kaybına neden olur. 6,000 rpm'de fazla 6 dakika boncuk-yenerek bizim tecrübelerimize göre, bu durum oluşur.
  7. Mikroalg oksitlenmeye eğilimli olabilir, yüksek derecede doymamış yağ asitleri üretebilir. Ryckebosch et al. 9 doymamış f oksidasyonu neden olduğu yağ asidi bileşimi herhangi bir değişiklik gözlenmiştirÇeşitli çıkarma işlemleri sırasında yağlı asitler. Bu doğal microalglerin oluşan antioksidanlar oksidasyon gelen bu doymamış yağ asitleri korumak ileri sürülmüştür. Bu oksidasyon meydana olabilir şüphelenildiğinde, bir olasılık olarak uzun bir antioksidan FAME ile birlikte elute değil gibi bütilhidroksitolüen (BHT) gibi sentetik bir antioksidantın ilave edilmesi de, ve antioksidan gibi uzun ikinci miktarı ile karışmaz olarak kromatografi 9. Uzun süreli depolama sırasında oksidasyona önlemek için, bir azot gazı atmosferi altında -80 ° C'de saklayın örnekleri önerilir.
  8. Microalglerin mevcut Lipaslar potansiyel analitik işlem sırasında lipidleri hidrolize ve dolayısıyla sonuçlarını etkileyebilir. Ryckebosch et al. 9 liyofilizasyon lipazlar inaktive olduğu bulunmuştur. Ayrıca, lipaz yağ asitleri aşağılamak değil, ama sadece Gliserolipidlerin gliserol grubundan onları ayırmak. Bu nedenle, lipaz aktivitesi sunulan yağlı ACI engel olmamalıdırd protokolü. Koenzim A yağ asidi bozunma olayına karıştığı Enzimler çıkarma sırasında yağ asitleri ve bu bozulmanın oluşumunu aktive böylece olası görünmüyor. Bununla birlikte, bu durumda, gliserolipidler yağlı asitlerin enzimatik arıza olasılığı sürece inhibitör analitik prosedüre kendisi 9 karışmaz olarak, örneğin izopropanol gibi bir lipaz inhibitörünü, eklemek olacaktır, sonuçları etkileyebilecek düşünülmektedir.

Bu yöntem, bir katı faz ekstraksiyon Aşama 2 (lipid ekstraksiyonu) arasında (SPE) ayırma aşaması ve aşama 3 (trans-esterifikasyonu ile yağlı asit bileşimi nötr lipidlerin (TAG) ve polar lipidler (fosfolipid, glikolipid) ölçmek ve tespit etmek genişletilebilir örneğin) tarafından tarif edildiği gibi Breuer et al. 1.. Wang ve Benning 28 tarafından tarif edildiği gibi alternatif olarak, bir ince tabaka kromatografisi (TLC) basamağı, örneğin, çeşitli polar lipid sınıfları ayırmak için kullanılabilir.

Bu yöntem, örneğin, kullanılacak olan uzun olabilir, bitkiler, dokular ve diğer mikro-organizmalar. Çünkü hücre bozulması üzerine vurgu, bu yöntem elde etmek için çok zor olan malzemelerin yağlı asitlerin analizi için özellikle uygundur.

Yöntemin çıkarma parçası (1 ve 2 aşama), pigmentler ve diğer lipofil bileşenler 23,25 ekstraksiyonu için kullanılabilir. Hücre parçalama prosedürü (su dahil) diğer çözücü sistemleri kullanarak, nişasta veya karbonhidrat gibi diğer bileşenlerin ekstraksiyonu için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu çalışmanın bir kısmı maddi Bilim ve Teknoloji-Stratejik Temel Araştırma (IWT-SBO) projesi Güneş ışığı ve Biosolar hücreler tarafından İnovasyon Teşvik Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. Erik Cesur ve BackKim Nguyen boncuk atan prosedürün optimizasyonu katkılarından dolayı kabul edilmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
tripentadecanoin (C15:0 TAG) Sigma Aldrich T4257 CAS Number 7370-46-9
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample Sigma Aldrich
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample Lipidox
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample Larodan
Beadbeater Bertin Technologies Precellys 24
beadbeater tubes MP Biomedicals Lysing matrix E
116914500
GC-FID Hewlett-Packer HP6871
GC column Supelco Nukol 25357
Positive displacement pipette 100-1000μl Mettler Toledo MR-1000
Positive displacement pipet tips C-1000 Mettler Toledo C-1000
Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml VWR 612-1925
glass tubes VWR SCERE5100160011G1
TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000 VWR SCERE5100160011G1
Teflon coated screw-caps VWR SCERKSSR15415BY10
STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator VWR 445-2101
Heated Evaporator/Concentrator Cole-Parmer YO-28690-25

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Breuer, G., Lamers, P. P., Martens, D. E., Draaisma, R. B., Wijffels, R. H. The impact of nitrogen starvation on the dynamics of triacylglycerol accumulation in nine microalgae strains. Bioresource Technology. 124, 217-226 (2012).
  2. Hu, Q., Sommerfeld, M., et al. Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances. The Plant Journal. 54, (4), 621-639 (2008).
  3. Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnology Advances. 25, (3), 294-306 (2007).
  4. Draaisma, R. B., Wijffels, R. H., et al. Food commodities from microalgae. Curr. Opin. Biotechnol. 24, (2), 169-177 (2012).
  5. Wijffels, R. H., Barbosa, M. J. An outlook on microalgal biofuels. Science. 329, (5993), 796-799 (2010).
  6. Wijffels, R. H., Barbosa, M. J., Eppink, M. H. M. Microalgae for the production of bulk chemicals and biofuels. Biofuels, Bioprod. Bioref. 4, (3), 287-295 (2010).
  7. Guschina, I. A., Harwood, J. L. Lipids and lipid metabolism in eukaryotic algae. Progress in Lipid Research. 45, (2), 160-186 (2006).
  8. Schenk, P. M., Thomas-Hall, S. R., et al. Second Generation Biofuels: High-Efficiency Microalgae for Biodiesel Production. BioEnergy Research. 1, (1), 20-43 (2008).
  9. Ryckebosch, E., Muylaert, K., Foubert, I. Optimization of an Analytical Procedure for Extraction of Lipids from Microalgae. Journal of the American Oil Chemists' Society. 89, (2), 189-198 (2011).
  10. Laurens, L. M. L., Dempster, T. A., et al. Algal Biomass Constituent Analysis: Method Uncertainties and Investigation of the Underlying Measuring Chemistries. Analytical Chemistry. 84, (4), 1879-1887 (2012).
  11. Iverson, S. J., Lang, S. L. C., Cooper, M. H. Comparison of the bligh and dyer and folch methods for total lipid determination in a broad range of marine tissue. Lipids. 36, (11), 1283-1287 (2001).
  12. Grima, E. M., Medina, A. R., et al. Comparison Between Extraction of Lipids and Fatty Acids from microalgal biomass. JAOCS. 71, (9), 955-959 (1994).
  13. Lee, J. Y., Yoo, C., Jun, S. Y., Ahn, C. Y., Oh, H. M. Comparison of several methods for effective lipid extraction from microalgae. Bioresour Technol. 101, Suppl 1 ement. 75-77 (2010).
  14. Guckert, J. B., Cooksey, K. E., Jackson, L. L. lipid solvent systems are not equivalent for analysis of lipid classes in the micro eukaryotic green alga. Journal of Microbiological Methods. 8, 139-149 (1988).
  15. Pruvost, J., Van Vooren, G., Cogne, G., Legrand, J. Investigation of biomass and lipids production with Neochloris oleoabundans in photobioreactor. Bioresource Technology. 100, (23), 5988-5995 (2009).
  16. Griffiths, M. J., Hille, R. P., Harrison, S. T. L. Selection of Direct Transesterification as the Preferred Method for Assay of Fatty Acid Content of Microalgae. 45, (11), 1053-1060 (2010).
  17. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol. Chem. 226, 497-509 (1956).
  18. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37, (8), 911-917 (1959).
  19. Lepage, G., Roy, C. C. Improved recovery of fatty acid through direct transesterification without prior extraction or purification. Journal of Lipid research. 25, 1391-1396 (1984).
  20. Welch, R. W. A micro-method for the estimation of oil content and composition in seed crops. J. Sci. Food Agric. 28, (7), 635-638 (1002).
  21. Chen, W., Zhang, C., Song, L., Sommerfeld, M., Hu, Q. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. Journal of Microbiological Methods. 77, (1), 41-47 (2009).
  22. Cooper, M. S., Hardin, W. R., Petersen, T. W., Cattolico, R. A. Visualizing "green oil" in live algal cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 109, (2), 198-201 (2010).
  23. Lamers, P. P., van de Laak, C. C., et al. Carotenoid and fatty acid metabolism in light-stressed Dunaliella salina. Biotechnology and Bioengineering. 106, (4), 638-648 (2010).
  24. Santos, A. M., Janssen, M., Lamers, P. P., Evers, W. A., Wijffels, R. H. Growth of oil accumulating microalga Neochloris oleoabundans under alkaline-saline conditions. Bioresour Technol. 104, 593-599 (2012).
  25. Mulders, K. J. M., Weesepoel, Y., et al. Growth and pigment accumulation in nutrient-depleted Isochrysis aff. galbana T-ISO. J. Appl. Phycol. (2012).
  26. Kliphuis, A. M., Klok, A. J., et al. Metabolic modeling of Chlamydomonas reinhardtii: energy requirements for photoautotrophic growth and maintenance. J. Appl. Phycol. 24, (2), 253-266 (2012).
  27. Lamers, P. P., Janssen, M., De Vos, R. C. H., Bino, R. J., Wijffels, R. H. Carotenoid and fatty acid metabolism in nitrogen-starved Dunaliella salina, a unicellular green microalga. Journal of Biotechnology. 162, (1), 21-27 (2012).
  28. Wang, Z., Benning, C. Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC). J. Vis. Exp. (49), e2518 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics