Büyük ölçekli SNP Genotiplendirme Uygulamaları için infinium Tahlili

Biology
 

Summary

Bir protokol büyük ölçekli genotipleme gerçekleştirmek için Illumina'nın Infinium tahlilleri kullandığı açıklanmaktadır. Bu deneyler, güvenilir bir şekilde üç gün sonra tek tek DNA numunelerinin yüz üzerinde SNP milyonlarca genotip olabilir. Bir kere üretilen, bu genotipleri farklı hastalıklar veya fenotipleri çeşitli dernekler kontrol etmek için kullanılabilir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Adler, A. J., Wiley, G. B., Gaffney, P. M. Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications. J. Vis. Exp. (81), e50683, doi:10.3791/50683 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Insan genomundaki genotipleme varyantları fenotipleri ile genetik ilişkileri belirlemek için etkin bir yöntem olduğu kanıtlanmıştır. Ailelerin veya nüfus içindeki varyantın dağılımı hastalığın genetik faktörlerin belirlenmesini kolaylaştırabilir. Genotiplemesi BeadChips bir Illumina'nın paneli araştırmacılar binlerce veya tek nükleotid polimorfizmlerinin milyonlarca (SNP) genotip veya DNA örneklerinin çok sayıda genelinde bu tür kopya sayısı gibi diğer genomik varyantlar, analiz etmeyi sağlar. Bu SNP genom boyunca yayılmış veya potansiyel keşif maksimize etmek için belirli bölgelerde hedeflenebilir. Infinium deneyi hızlı, yüksek kaliteli, doğru sonuçlar elde etmek için optimize edilmiştir. Doğru kurulum ile, tek bir teknisyen dizinin tipine bağlı olarak, haftada binden fazla DNA örnekleri için birkaç yüz işleyebilir. Bu deney, genomik DNA ile başlayan ve dizinin tarama ile biten her adımda kullanıcılara yol gösterir. Yerindelik Reage kullanmaNTS, örnekler güçlendirilir, parçalanmış, çöktürülmüş yeniden süspanse, lekeli tek bir baz tarafından genişletilmiş çip, hibritlenmiş ve bir iScan veya Hi Tarama, yüksek çözünürlüklü optik görüntüleme sistemi ya taranır. Bir gece boyunca adım DNA'yı yükseltmek için gereklidir. DNA denatüre ve izotermal olarak bütün genom amplifikasyonu ile büyütülmüş, bu nedenle, hiçbir PCR gereklidir. Numuneler, bir gece boyunca, ikinci aşama sırasında diziler hibridize edilir. Üçüncü gün, numuneler taranmış ve incelenmiştir hazırdır. Çoğaltılan DNA, boncuk dizileri, böylece verim maksimize, haftanın her günü işlenecek sağlayan, büyük miktarlarda depolanmış olabilir.

Introduction

Tek nükleotid polimorfizm (SNP) yazma hastalığı ile bağlantılı risk varyantlarını tanımlayan önemli bir yöntemdir. Tarihsel olarak, genotipleme deneyler kapsamı mevcut teknoloji ile sınırlı kalmıştır. Jel elektroforez tabanlı genotiplendirme yöntemleri örnek ve SNP-throughput sınırlıdır [1]. Bu tahliller geliştirmek genellikle optimizasyonu için varyant çevreleyen bölgenin makyaj ve yapısına dayanarak, emek-yoğun olabilir [1]. Life Technologies tarafından geliştirilen TaqMan genotipleme deneyler, hızlı bir şekilde ve en az teknisyen tutulumu olan örnekler çok sayıda çalışabilir [2], fakat SNP-çoklama sınırlamaları günde de altında bir milyon [3,4 genotip için toplam sayısını sınırlamak için devam ]. Az yüz SNP birlikte çoğaltılmış olabilir gibi Sequenom en iPlex platformu ayrıca, aynı anda birçok örnekleri çalıştırmak, ancak, verimlilik genel olarak nispeten düşüktür [5]. Beckman Coulter SNP stream teknolojisiteorik olarak günde üç milyon genotipleri üretmek, ama olabilir reaksiyon başına sadece kırk sekiz SNP maksimum bu teknolojinin sınırları proje aralığı [4,6]. GoldenGate deney numune başına SNP yüzlerce veya binlerce her gün yaklaşık iki yüz DNA örnekleri işleyebilir iken bir kez [4,7 anda üç bin SNP yazarken, genotip başına fiyat gelişmiş, ultra-yüksek verimli teknikleri ile rekabet değil ]. Günde birkaç milyon genotipleri işlemek için büyük genom dernek çalışmaları için gerekli ölçek, dizi-hibridizasyon deneyleri piyasadaki en uygun maliyetli bir seçenek haline gelmiştir.

Melezleme dizilerin affymetrix hattı ve Infinium tabanlı dizileri Illumina'nın hat örneklerinin potansiyel yüzlerce paralel [4,8] içinde SNP binlerce veya milyonlarca yüzlerce yazılmasına izin. Bu SNP gibi eski gibi ilgi bölgelerde, lokalize, tüm genom çapında dağınık olabiliromes, ya da kullanıcının tercihlerine göre kişiselleştirilebiliyor. Bu diziler doğru seferde numune başına bir milyon SNP genotiplemesi için değil, aynı zamanda, potansiyel olarak açıklanması kromozom anormallikleri kopya sayısı varyasyonu ölçmek mümkün değil, sadece yarar var. Infinium hizalanmış OMNI BeadChip dizileri şu anda her gün yaklaşık yüz kadar örnek üzerinde, yarım milyon özel loci dahil numune başına yaklaşık beş milyon belirteçleri, kadar genotiplemesi için yeteneği var.

Çoğu hastalıklar genetik bir bileşeni var gibi, bu büyük ölçekli deneyler hastalığı ile ilişkili genleri bulmakta önemli olabilir. Yüksek verim genotipleme örneğinde etkili genotip üretimine olanak ikna edici bir alt ufak alel frekanslarda genetik ilişkiyi tespit etmek için yeterince büyük ayarlar. Tüm genom genotip projeler istatistiksel olarak anlamlı bir vaka-kontrol alel frekansı veya kopya sayısı farklılıkları bölgeleri bulmak için kullanılabilmektedir [9,10,11]. Ulusal İnsan Ge görenome Araştırma Enstitüsü, genom-geniş dernek çalışmaları bir p-değeri en az 1 x 10 -5 ile 8283 SNP keşfinden kaynaklanan, 25 Kasım 2008 ve 25 Ocak 2013 tarihleri ​​arasında 1.490 ayrı yayın yol açtı (http:// bakın yükseklikten bir genom analizi ile sağladığı geniş yaklaşımdan yararlanmıştır testis kanseri kadar değişen koşulları araştırılmış www.genome.gov/gwastudies/). Bu çalışmalar,. Yazarak kapsamı çok kısıtlayıcı olmuştu bu gibi durumlarda, ilgilenilen tüm bölgeleri fark kaçmış olabilir. Büyük ölçekli dernek analizleri için Böylece, bir genom genotiplemesi tekniği tercih tekniktir.

Infinium deneyi farklı versiyonları her dizilerin belirli türleri ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır, var. Veya 24 örnek dizisi chips - Aşağıdaki ayrıntılı olarak tartışılan InfiniumUltra deneyi, bir çok 12 için uygundur. Bunlar genellikle DNA numune başına yüz bin yılı aşkın bir SNP genotip ve t odaklanmakBöyle exome veya özel paneller gibi argeted bölgeler. Diğer deney versiyonları gibi bütün genom genotipleme dizileri gibi diğer çip türleri için gerekli olabilir. Tüm deneyler, Infinium ortak bir temeli vardır ve ağırlıklı olarak sadece reaktif isimler, ayıraç hacimli ya da tam reaktif boyama işlemi ile farklılık olarak, ancak, bir deney versiyonuna mükemmel teknikleri genellikle evrensel olarak uygulanabilir. Gibi metilasyon diziler gibi diğer diziler, yanı, neredeyse özdeş protokolünü kullanabilirsiniz. Bakım çip tipi kullanım için gerekli testin sürümünü kullanmak sadece alınmalıdır. Bu tür gen ekspresyonu seviyesini ölçmek için olanlar gibi bazı türleri, bir nonInfinium protokolünün kullanılmasını gerektirebilir.

Örnekler toplu olarak işlenmelidir. Örneğin, InfiniumUltra yöntemi ile, reaktif melezleştirme borular 96 örnekleri çalıştırmak için yeterli hacim içeren ve tüpler refrozen edilemez. Bu nedenle, örnek bir seferde 96 örneklerinin gruplar halinde çalıştırılmalıdır. Numuneler köknar üzerinde amplifiye edilecektirt gün. Benchwork Yaklaşık 1 saat sonra, numuneler, 20-24 saat boyunca bir konveksiyon fırınında ısıtılmalıdır. Ertesi gün, yaklaşık 4 saat çökeltilmesi ve örnekler ileride kullanılmak üzere dondurulabilir ya da çip hibridize olabilir ya da bu noktada numune, tekrar askıda bırakılması, parçalanan harcanacak. Fiş yükleme numuneler, 16-24 saat boyunca bir gece boyunca hibridize olacak sonra, yaklaşık 2 saat sürer. Üçüncü gün, boyama ve uzatma adım ~ 4 saat sürer. Bir başka saat yıkama, kaplama ve cips kurutulması harcanacak. Son olarak, diziler kullanılan türüne bağlı olarak, 15-60 dakika / çipinden sürebilir, taranır.

Standart laboratuvar güvenliği ve temizlik önlemleri uygulayın. Amplifikasyon PCR bazlı olmasa da, ön ve postamplification işlemleri için ayrı iş istasyonları kontaminasyon olasılığını en aza indirmek için gereklidir. Kullanılan her kit sağlanan ayıracı kimlik numarası izleme kağıda giriş yapmalısınız. ReageNTS dağıtma önce birkaç kez kullanımdan hemen önce çözülmüş ve ters olmalıdır. Yazılmaları için DNA, standart yöntemlerle izole edilir ve bir florometre ile nicelleştirilmiştir yüksek kaliteli bir genomik DNA (260/280 1,6-2,0 arasında emme oranı, 3.0 'ın altına ve 260/230 emme oranı) olması gerekir. DNA bozulması genellikle düşük kaliteli deney sonuçlarında katkıda bulunan bir faktördür. Bu miktar bir yonga tipleri için değişebilir ama tipik olarak, 200 ng of DNA gereklidir. A Tecan sıvı-yü protokolün birçok adımları otomatik ve bir faktör olarak insan hatası en aza indirebilirsiniz.

Protocol

Day One

1.. Hazırlık

  1. Derin oyuklu, 96 numune plakasına DNA 200 ng dağıtın. En az 96 numune (tam plakalar) hiçbir reaktif boşa olacaktır sağlamak için kaplama olmalıdır. Kit tarafından verilen bir barkod etiket ile plaka Etiket ve santrifüj.
  2. , Hacimleri normalize bir çekmecede örnekleri bırakın veya sıvı buharlaşmaya kaput gecede duman için. Tozdan korumak için bir kapak veya kağıt havlu ile gevşek kapak plakası.

2. Amplifikasyon

UYARI: 4 saat parçalanma, yağış ve resüspansiyon adımlar için aşağıdaki gününde hazır olacaktır sürece örnekleri amplifikasyon tabi olmamalıdır.

  1. -20 ° C derin dondurucuda (MA1, ma2 ve MSM bir tüp 96 numunelerin her set için yeterlidir) gelen "Pre" etiketli tüplerin şirket verilen kutu veya paketini çıkarın. Çözülme bankta ma2 ve MSM tüpleri ayarlayın. Düzgün kalibre açınfırın ve 37 ° C'ye ayarlanır
  2. Bir reaktif lavabo ve 10 ul, 8-kanallı bir pipet kullanılarak, örneklerin rehidrasyonu, her kuyuya DNA süspansiyon tamponu 4 ul dağıtmak. Bakım sıvı dokunmamaya alınırsa her sütunun arasına pipet ipuçları atmak için gerekli değildir.
  3. 8 kanallı pipet ile, plakanın her oyuğuna MA1 20 ul dağıtmak. Her yeni ayıraç için, taze bir reaktif havzası kullanın. Bir mikro çalkalayıcı içinde 1600 rpm'de 1 dakika için tekrar kullanılabilir bir conta, darbe-santrifüj, ve vorteks ile plaka örtün.
  4. 2.4), en az 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  5. , Plakanın her oyuğuna 0.1 N NaOH 4 ul koyun. 1600 rpm'de 1 dakika için yeniden mühür, darbe-santrifüj, ve vorteks ile plaka örtün.
  6. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  7. , Plakanın her oyuğuna MA2 34 ul koyun.
  8. , Plakanın her oyuğuna MSM 38 ul koyun. Ile kapak plakasıyeniden mühür, darbe santrifüj ve 1600 rpm'de 1 dakika boyunca vorteks.
  9. 20-24 saat boyunca fırında yerleştirin.

Gün İki

3. Parçalanma

  1. "Post-1" FMS tüpleri çıkarın -20 ° C kutusu (tek tüp 96 numunelerin her set için yeterlidir). Bankta ya da oda sıcaklığındaki su banyosunda eritin. Bir masa microsample kuluçka sistemi içine MIDI-plaka insert yerleştirdikten sonra, ısı bloğu açmak ve 37 ° C'ye set
  2. Tüpler çözülmüş sonra, fırın ve darbe-santrifüj örnek plakasını çıkarın. DNA plakanın her oyuğuna FMS 25 ul koyun. 1 dakika boyunca 1600 rpm'de kapağı, darbe santrifüj ve girdap değiştirin.
  3. 1 saat boyunca ısıtma bloğu içinde plaka inkübe edin.

4. Yağış

  1. 4 ° C kutusu "Post-3" den PM1 boru kaldırma veya paketi ve oda sıcaklığına kadar ılıması (bir boru 96 numunelerin her set için yeterlidir). Isı bloku plakasını çıkarınk ve darbe santrifüj.
  2. , Plakanın her oyuğuna PM1 50 ul koyun. 1 dakika boyunca 1600 rpm'de kapağı, darbe santrifüj ve girdap değiştirin.
  3. 5 dakika boyunca ısı bloğu plaka inkübe edin.
  4. , Isı bloğu plakasını çıkarın kapatın ve plaka kapağı atmak. , Plakanın her oyuğuna 100% izopropanol, 155 ul koyun. Yeni bir kapak ile sıkıca örtün ve elle karıştırmak için plaka birden çok kez ters çevirin.
  5. 30 dakika içinde en az 4 ° C olarak plaka koyun. Soğutmalı santrifüj açın ve soğumaya 4 ° C olarak ayarlanır.
  6. 3000 x g 'de 20 dakika boyunca 4 ° C'de ve plaka santrifüj dengeleyin.
  7. Ters çevrilerek olmadan plakanın alt kontrol ve numuneler, mavi bir pelet içinde çökeltilir teyit etmektedir. No topaklar tekrar santrifüj görülebilir edin. Kağıt havlu alın.
  8. Kapağı atın ve hızlı bir şekilde plakayı baş ve kağıt havlu kaplı benchtop zorla dokunarak sıvı çıkarın. Plaka i sonraherhangi bir sıvı kalır nverted, onu geri dönmek için özen. Tüm sıvı kaldırılır kadar art arda benchtop karşı plakasını dokunun.
  9. Kuruması için, ters bir test tüpü raf üzerinde plakasını ayarlayın. 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin.

5. Resüspansiyon

  1. "Post-2" adlı RA1 kaldırma kutusu ve -20 ° C, oda sıcaklığındaki bir su banyosu içinde çözülme °. Fırın açmak ve 48 ° C'ye ayarlayın
  2. Bir kere çözülmüş, numune plakasının her oyuğuna RA1 23 ul dağıtmak. Havza içine RA1 tüm şişeyi dökün etmeyin, daha sonra 30 ml kaydedebilirsiniz. Numuneler daha sonra o gün diziler üzerine melezleşmiştir olacak, 4 ° C soğutucu içine RA1 yerleştirin. Örnekleri daha sonraki bir tarihte çalışacak olursa, şişe etiket ve RA1 dondurursam.
  3. Plaka üzerine yeni bir kapak ısı mühür. Plakayı-santrifüj Darbe ve 1 saat boyunca fırında yerleştirin.
  4. 1 dakika boyunca 1800 rpm'de fırın ve girdap ikinci plaka çıkarın.
    Numuneler, güvenli bir şekilde, H olabilir,Bir haftaya kadar bu aşamada eld. Tabaklar stoklanmış olabilir ve gerekirse örnekleri, boncuk çip uygulaması için hazırlanmak için yeniden organize edilebilir. Prosedürü ile devam ederse, oda sıcaklığında bırakın ve plaka ısı blok açın. Aksi takdirde, -20 ° C'de saklayın plaka

6. Melezleme

UYARI: Numuneler 5.5 saat boyanması için aşağıdaki gününde hazır olmadıkça melezleştirilmesine geçmesi ve adımları yıkamak gerekir.

  1. Isı bloğu açmak ve 95 ° C'ye ayarlayın Fırın açmak ve 48 ° C'ye ayarlayın
  2. Isı stabilize edildikten sonra, 20 dakika boyunca ısıtma bloğu üzerinde inkübe edin.
  3. Plaka denatüre edilirken, 4 ° C boncuk cips kutusunu kaldırmak ve bankta ayarlayın. (Oda sıcaklığı kiti) XC4 bir şişe alın ve% 100 etanol 330 ml ekleyin. Iyice çalkalanır ve gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Formamid / EDTA karışımı (% 95 formamid,% 0.2 hazırlamaEDTA (0.5 M), hacimce% 4.8 'H 2 O) ve ayrı 15 ml artışlarla dondurma. Aşırı formamiddir depolanmış olabilir.
  4. Isı bloğundan örnek plakasını sökün. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  5. Plaka soğurken, hyb odası hazırlar. Bir bölme işlenmiş her dört boncuk yongaları için gerekli olacaktır.
    Tabanın ön kalın delik hizalayarak hyb oda tabanının üstünde bir kauçuk mat yerleştirin. Tabanına kazınmış barkod sembolü hala (bkz. Şekil 2) görünür olmalıdır.
  6. 1000 ul pipet kullanarak, tabanına oyulmuş sekiz nemlendirici rezervuar her birine PB2 400 ul dağıtmak. PB2 "Post-3" kutusu veya paketi bulunabilir. Baz HYB odası kapak yerleştirin ve ilk çapraz ters tarafta iki tokalar kapatarak iki ucunu toka.
  7. Cips 'expo en aza indirmek amacıyla, kendi kutuları boncuk cips bireysel gümüş paketlerini çıkarın, ancakhava ve ışık için emin, henüz bunları açmayın. Dikkatli cips barkod tarama ve onlar geldikleri kutu kimlikleri ile birlikte bir izleme kağıda yüklenecek sırayı kaydedin. Her DNA örneği boncuk yongaları üzerinde dağıtılacak nerede bir anlayışa gereklidir.
  8. Kendi kutuları boncuk cips bireysel gümüş paketlerini çıkarın, ancak, hava ve ışık cips 'maruziyeti en aza indirmek için, henüz bunları açmayın. Dikkatli cips barkod tarama ve onlar geldikleri kutu kimlikleri ile birlikte bir izleme kağıda yüklenecek sırayı kaydedin. Her DNA örneği boncuk yongaları üzerinde dağıtılacak nerede bir anlayışa gereklidir.
  9. 30 dakika soğumasını önce sadece gümüş boncuk çip paketlerini açmak, tamamladı. Onların açık plastik kovanlara gelen cips çıkarın. Boncuk dokunmadan, çip yönlendirilmesi, bir HYB odası uç her boncuk çip yerleştirmekUcun üst yüzeyine kazınmış barkod sembolü ile barkod.
  10. Soyulabilir ve numune plaka kapağı atmak. Numune plakasından örnek 15 ul alın ve yavaş yavaş diziye girişine tevzi (bkz. Şekil 3). Olağanüstü bakımı daha önce kaydedilmiş olan topuk kısmı çip düzenine uygun, doğru konumda doğru boncuk çip üzerinde doğru numuneyi alınmalıdır. Bir çok kanallı pipet yongaları üzerinde sıvıyı dağıtmak için kullanılan olabilir, ama sağduyu bir plaka üzerinde satır sayısı her zaman sayısını uymuyor gibi güvenle boncuk çip yerleştirilebilir sadece örneklerinin sayısını, aspire alınmalıdır Bir çip üzerinde satırları.
  11. Bir kere her numune karşılık gelen dizide konulmuş, görsel sıvı kaplı değil kabarcıkları veya bölgeler için çip inceleyin. Bu sorunlar varsa, yavaşça ekleme sallayın. Eğer gerekli ise, daha çok sıvı dizisine ilave edilebilir. Doğru DNA örneği eklemek için özen gösterin.
  12. HYB odası bir açıkNemlendirme rezervuar üzerine ekler yerleştirin d. Çipin barkod HYB odasının tabanına kazınmış barkod üzerine konulmalıdır. HYB bölmesi kapağını yerine takın ve ilk çaprazındaki tarafta tokalar kapatarak dört tokalar kapatın.
  13. , 16-24 saat boyunca fırında hyb odası inkübe edin. Taşırken odaları yatırmak için özen gösterin.
  14. Birden fazla sayıda plaka işlenecek ise, 6.2 adıma geri dönün. Bir günde 24'den fazla boncuk fiş işleme bakımı gibi, sarf veya cips büyük miktarda kullanımı sırasında insan hata olasılığını en aza indirmek için hem de gelecek adımda cips işlemek için gereken süreyi en aza indirmek için tavsiye edilmez gerekir mümkün olduğunca havaya maruz kaldıkları sınırlamak için alınacak. XC4 Bir şişe kadar 24 boncuk yongaları için yeterlidir.

Gün Üç

7. Boyama Hazırlık

  1. Fırından HYB odaları çıkarın ve oda te inkübe25 dakika boyunca mperature. İkiden fazla hyb bölmeyi işleme, bunların çift kaldırma her 10 dakikada bir sersemleme. Kurutma gelen fiş tutmak amacıyla, henüz hyb odalarını açık değildir.
  2. HYB odaları, soğutma iken, C kutusuna ° -20 "Post-1" den XC1, XC2, TEM, STM ve ATM tüpleri kaldırmak ve çözülme için bankta ayarlayın. -20 ° C'de "Post-2" kutusundan RA1 bir şişe alın ve oda sıcaklığında su banyosunda çözülme (veya 4 ° C önceki gün ayıracı yeniden varsa). Hem de% 95 formamid bir tüp çözülme. , Her iki tepkin tüpler, 10 mi RA1, 15 ml formamit, ve (a oda sıcaklığı, şirket tarafından sağlanan kutuda bulunan) 150 mi XC3 işleme 8 boncuk yongaları için gerekli olacaktır.
  3. Işlenmiş, her çip için, bir cam slayt, bir plastik akan ateli, iki metal tokalar, ve bir plastik ayırıcı gerekli olacaktır. Plastik ara için, sadece açık birini kullanın; opak boşluk ayırın ve atın. Buna ek olarak, iki boncuk yonga yıkama yemekler vebir boncuk çip tepsi bir sıvı montaj istasyonu ve bir adet plastik montaj çubuğu ile birlikte, gerekli olacaktır.
  4. Etanol ile püskürterek ve onlara kuru silerek cam slaytlar temizleyin.
  5. Akış odası rafa iliştirilmiş sıcak su banyosu açın ve 44 ° C'ye ayarlayın Yavaşça herhangi bir kabarcıklarını çıkarmak için bölme raf sallayın.
  6. Hyb odası 25 dakika boyunca soğuduğunda, PB1 (yaklaşık 200 mi) ile bir yıkama çanak doldurun. PB1 "Post-4" oda sıcaklığı kutusunda bulunabilir.
  7. Bir HYB odasını açın. (Bkz. Şekil 4) bir köşesinde mühür tutup hafifçe çapraz soyulması ile bir boncuk çip kapak contasını çıkartın. Mühür kaldırılır sonra, hemen bir boncuk çip tepsiye çip yerleştirmek ve boncuk dokunmadan PB1 daldırın. Tepsi herhangi bir çip kuruması için özen, boncuk cips ile dolana kadar tekrarlayın.
  8. Yavaşça herhangi kabarcıkları ve 1 dakika boyunca batık fiş terk tepsiyi ajitasyon.PB1 ile ikinci bir yıkama çanak doldurun. Tekrar tepsiyi çalkalayın.
  9. Ikinci yıkama çanak içine boncuk cips tepsisini taşıyın. Yavaşça sonra tekrar ajitasyon, ajitasyon ve 1 dakika boyunca ıslatın.
  10. Sıvı-akış montaj istasyonunda, oluklarından dört siyah plastik-akış parantez yerleştirin. Sıvı yaklaşık sekiz montaj braketleri (yaklaşık 150 mi) arasında yüksekliğe ulaşana kadar PB1 istasyonu ile doldurun.
  11. Tepsiden bir boncuk çipini çıkarın ve bir plastik akış ayraç üzerinde montaj istasyonu içine yerleştirin. Çip barkod montaj istasyonuna kazınmış barkod sembolü üzerinde aynı hizada olmalıdır. Montaj istasyonu içinde sığabilecek diğer üç yongaları için tekrarlayın.
  12. Bir boncuk çip üstünde bir şeffaf plastik ayırıcı yerleştirin. Ara parçasının dış kenarları montaj istasyonuna parantez içindeki çevreleyen gerekir. PB1 batık diğer yongaları için tekrarlayın.
  13. Olukların üzerine takarak montaj istasyonu plastik montaj çubuğunu yerleştirin. Yavaşça montaj çubuğuna karşı sürgünün arka ucu itme ve yavaş yavaş sıvının içine doğru ön düşürerek plastik ara parçasının üstüne bir cam slayt yerleştirin. Sürgünün üst oluk köşe çip ve barkod ucunda sürgü arasında bir boşluk bırakarak, doğrudan çipin barkod üzerinde, aşağı doğru olmalıdır. PB1 batık diğer yongaları için tekrarlayın. Tam bir akış montaj şeması için bkz Şekil 5.
  14. Çip ve slayt arasındaki kabarcıkları kontrol. Kabarcıklar görünüyorsa, yavaşça barkod sonunda slayt yükseltmek ve tekrar deneyin. Kalıcı kabarcıklar bir kağıt havlu laboratuvar (Kimwipe'dan) ile camından silinebilir.
  15. Cam slayt etrafında iki metal tokalar, barkod sonuna doğru bir ve arkaya doğru birini oturtun. Tokalar kenarları gerektiğini kavrama çip altında plastik akış brace. PB1 batık her çip için tekrarlayın.
  16. Tamamlanan akış aksamlarını çıkarın ve b yatay yerleştirmekench. Cam slayt altında sıvı kaçmasına izin dikey aksamını dikkat çekmek. Daha fazla fiş yıkama tepsisinde bekleyen varsa, bunlar aynı PB1 altına monte edilebilir. Diğer cips orijinal HYB odalarına bekleyen varsa, montaj istasyonu tüm sıvıyı atmak ve bulaşıkları yıkamak, ve 7.6 adıma geri dönün.
  17. Bir kez tüm boncuk cips mümkün olduğunca cam slayt yakın, cerrahi bir makas alır ve kapalı ayırıcı iki ucunu kesip, onların akan meclisleri vardır.

8. Boyama ve Uzatma

  1. Akış odası raf bir sıcaklık probu ile birden pozisyonlarda 44 ° C ulaştığını doğrulayın. Sıcaklık daha yarım derecede kapalıysa, su banyosunun sıcaklığı ayarlamak.
  2. Aşağı derleme kayar ve üst kuşak çengel tarafından odası raf üzerinde boncuk çip akış aksamını yerleştirin. Boncuk çipin arka tarafı odası raf dokunmadan olmalıdır. Glass slayt Reaktif kabını oluşturmak için üst oluk ile, dışarı bakmalıdır. Her boncuk çip montaj için tekrarlayın.
  3. 200 ul bir pipet kullanarak, cam hazne içine sıvı dağıtma ile-akış tertibatları RA1to 150 ul ekle. 30 saniye boyunca inkübe edin. 5x tekrarlayın.
  4. 1000 ul pipet kullanarak, cam hazne içine sıvı dağıtma ile-akış tertibatları XC1to 450 ul ekleyin. 10 dakika boyunca inkübe edin.
  5. Cam hazne içine sıvı dağıtma ile akış-through derlemeler için 450 ul XC2 ekleyin. 10 dakika boyunca inkübe edin.
  6. Cam hazne içine sıvı dağıtma ile akış-through derlemeler için 200 ul TEM ekleyin. 15 dakika boyunca inkübe edin.
  7. Cam hazne içine sıvı dağıtma ile akış-through derlemeler için 450 ul% 95 formamid / EDTA karışımını ekleyin. 1 dakika boyunca inkübe edin. 1x tekrarlayın.
  8. 5 dakika için, akış-through derlemeleri inkübe edin.
  9. Sıcaklık l sıcak su banyosu SetIsted STM tüplerde (37 ° C veya yok gösterilir ise). Her STM tüp listelenen aynı sıcaklığa sahip olduğundan emin olun.
  10. Akış meclislere 450 ul XC3 ekleyin. 1 dakika boyunca inkübe edin. 1x tekrarlayın.
  11. Sıcak su banyo sıcaklığı istenilen sıcaklığa ulaştığı zaman, cam hazne içine sıvı dağıtma ile akış-through derlemeler için 250 μLSTM ekleyin. 10 dakika boyunca inkübe edin.
  12. Cam hazne içine sıvı dağıtma ile akış-through derlemeler için 450 ul XC3 ekleyin. 1 dakika boyunca inkübe edin. 1x tekrarlayın.
  13. 5 dakika için, akış-through derlemeleri inkübe edin.
  14. Cam hazne içine sıvı dağıtma ile akış-through derlemeler için 250 ul ATM ekleyin. 10 dakika boyunca inkübe edin.
  15. Cam hazne içine sıvı dağıtma ile akış-through derlemeler için 450 ul XC3 ekleyin. 1 dakika boyunca inkübe edin. 1x tekrarlayın.
  16. 5 dakika için, akış-through derlemeleri inkübe edin.
  17. Flow-through için 250 ul STM ekleCam hazne içine sıvı dağıtma ile birleşimleri. 10 dakika boyunca inkübe edin.
  18. Cam hazne içine sıvı dağıtma ile akış-through derlemeler için Add4 50 ul XC3. 1 dakika boyunca inkübe edin. 1x tekrarlayın.
  19. 5 dakika için, akış-through derlemeleri inkübe edin.
  20. Tekrar 8,14-8,19 1x adımları.
  21. Odası raftan akış derlemeler çıkarın ve su banyosu kapatın.

9. Yıkama ve Sızdırmazlık

  1. PB1 (yaklaşık 315 ml) ile bir boyama boncuk çip yıkama çanak doldurun. İki dikey yıkama yemekleri ve bir dikey boncuk talaş teknesi, en az bir vakum manifoldu ile birlikte, gerekli olacaktır.
  2. Tokalı ve destek arasındaki ince bir metal çubuğu taktıktan sonra çevirerek bir akış tertibatını sökün. Kenara cam slayt ayarlayın ve boncuk çipi çıkartın. Hemen dikey boncuk çip tepsiye boncuk çip yerleştirmek ve PB1 daldırın. EAC yüz bakımı, her akış montaj için tekrarlayınh boncuk aynı yönde yonga ve havaya maruz kalma en aza indirir.
  3. Yavaşça kabarcıklarını çıkarmak için boncuk çip tepsisini ajitasyon. 5 dakika boyunca PB1 olarak batık boncuk fiş inkübe edin. XC4 ile ikinci dikey yıkama çanak doldurun önceki gün hazırladı. Yine boncuk çip tepsisini çalkalayın.
  4. XC4 ile dolu yıkama çanak boncuk çip tepsisini taşıyın. Yavaşça kabarcıklarını çıkarmak için tepsiyi ajitasyon. 5 dakika boyunca inkübe edin ve daha çalkalayın.
  5. Böylece her boncuk yonga yüzünde boncuk yukarı, tek bir hareketle, yıkama çanak boncuk çip tepsisini çekin ve bir test tüpü raf üzerinde ayarlayın. Kendinden kilitlemeli cımbız ile, tepsinin dışında bir boncuk çip slayt ve bir test tüpü raf üzerine yerleştirin. Her boncuk çip için tekrarlayın.
  6. Dikkatlice bir vakum desikatöre cips tüp raf aktarın. Kapatın ve uygun bir sızdırmazlık sağlayarak, vakum açın. 50-55 dakika boyunca inkübe edin. Gerekirse, inkübasyon sırasında tarayıcıyı ısınmak.

10. Tarama

  1. TuVakum kapalı rn ve yavaşça atmosferik basıncın geri döner. Boncuk cips kuru olduğundan emin olun. Gerekirse, herhangi bir sıvı veya enkaz kaldırmak için kenarları ve bir kağıt havlu ile çip alt silin.
  2. Tarama yazılımı etkinleştirin ve tarama tepsiye boncuk fiş taşımak. Decode Dosya istemci yazılımını aktive ve bunlara karşılık gelen kutusu kimlikleri ile birlikte, istenen boncuk çip barkod girerek yonganın kod çözme dosyalarını (dmaps) indirin. Taranmamış boncuk cips güvenle kadar 72 saat boyunca kuru, karanlık bir alanda saklanabilir.
  3. Cips tepsiye düzgün oturmuş ve kod çözme dosyaları yazılım tarafından tanınan bir kez taramayı başlatın.

Representative Results

Tararken A düzgün işlenmiş boncuk çip parlak ve belirgin kırmızı ve yeşil lazer ışık şiddetleri göstermesi gerekir. Şekil 6'da, iScan tarama yazılım başarılı bir şekilde özel bir panel SNP genotipleme dizisine hibridize standart bir genomik DNA örneği gösterir. Uzantı ve boyama aşamaları esnasında bağlanmıştır etiketli nükleotidler, iki lazer ışıkları altında floresan. Bu nükleotidler, seçici olarak parçalanmış DNA sarmalına hibridize boncuk oligonükleotid zinciri uzanır ve oligonükleotid zinciri varyantın yerinde sona erdirmek için tasarlanmış olarak, elde edilen sinyalin renk ve yoğunluğu mevcut allel belirlemek için kullanılabilir gibi SNP sitesi.

Şirketin doğrudan elde chipID ve pozisyona örnek kimlikleri ve klinik bilgilerini eşleşen bir kullanıcı tarafından oluşturulan örnek levha, ve bir dizi özel SNP tezahür, SCA ithal etmek için her ikisi de gereklidirnner çıktı dosyaları GenomeStudio analiz yazılımı. Örnek örnek sayfaları şirketin web sitesinde bulunabilir. GenomeStudio Proje oluşturulduktan sonra, genotip otomatik yazılım tarafından oluşturulan sonuçtaki yoğunluğu kümelerden elde edilebilir. Birden fazla ekran seçenekleri mevcut olmasına rağmen, varsayılan görünüm, Norm-Teta (bir alel yoğunluğu oranı) vs Norm-R (bir normalize yoğunluk değeri), genellikle üç ayrı kümeleri ayırt etmek kolay komplo olduğunu. En küçük SNP aleli frekansına bağlı olarak, bir, iki ya da üç kümeleri göstermelidir.

Üç küme AA, AB, BB veya alellerini (bkz. Şekil 7) gösteren örnekleri temsil eder. Bu kümeler, yazılım analizi araç çubuğundan "Tüm SNP Küme" seçerek, şirketin doğrudan bir standart kümeleme pozisyon şablon alarak, ya da tıklayarak ve elle edi yoğunluğu araziler üzerinde renkli daireler sürükleyerek ya genotipleri atanabilir t çağırır. (Kırmızı, mor veya mavi) yoğunluğu arsa üzerinde numunenin rengi çağrısı (AA, AB, BB veya sırasıyla) belirtir; siyah hiçbir çağrıyı gösterir. Yazılımın Tam Veri bölmesinde listelenen SNP gezinerek, her SNP için kümeleme görüntülenebilir veya geri çağırılabilir. Kümeler tatmin edici aramaları atanır sonra, yazılımın Tam Veri bölmesi her özel SNP'de her numune için genotipleri listeler. Yukarıdaki tabloda Sütun Seçici seçenek veri formatları arasında geçiş yapabilirsiniz.

Veri derinlemesine analizi için analiz araç çubuğu üzerinden veya doğrudan Tam Veri tablosundan ya ihraç edilebilir.

Şekil 1
Şekil 1. Genel Bakış - Infinium Deney Protokolü.683/50683fig1highres.jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Şekil 2,
Şekil 2. Komple HYB Odası tabanı ve mat, artı kapak. [12] Daha büyük resmi görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,
Şekil 3 Beadchip Yükleme -.. Giriş portları üzerindeki örnek dağıtın [12] büyük görmek için buraya tıklayın görüntü.

Şekil 4,
Şekil 4 Beadchip Coverseal Çıkarma -.. Köşesinde mühür tutun ve yavaşça çapraz soyup [12] Daha büyük resmi görmek için buraya tıklayın .

Şekil 5,
Şekil 5,. Komple Beadchip Flow-through Meclisi - BeadChip bir ayırıcı ile bir cam slayt ayrılır ve tokalar ile bağlıdır.> Daha büyük resmi görmek için buraya tıklayın.

Şekil 6,
Şekil 6,. Başarılı BeadChip Tarama - A) BeadChip hem kırmızı ve yeşil lazer ile taranır; tarama yazılımı görüntüler hem de aynı anda. Yoğunluk QC geçen Bölümler sola BeadChip ekranda yeşil vurgular. Yoğunluk QC başarısız Bölümler BeadChip ekranda kırmızı vurgulamak olacaktır. B) tarama tamamlandıktan sonra, yazılım, kırmızı ve yeşil görüntüler kaplayacaktır. A büyütüldüğünde görüntü gösterilir. Her boncuğun rengi ve yoğunluğu alel mevcut gösterir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .


Şekil 7. NORM-THETA Küme Profiller vs SNP NORM-R -. AA, AB ve BB genotipleri, kırmızı, mor ve mavi renkli B) A SNP gerektiren düzenlemeyi temsil eden üç ayrı kümeler A) geçerli bir SNP. Homozigot AB olmalı orta küme, un-denir bırakılır. BB küme yanlışlıkla AB. C) Bir kötü performans SNP denir. Hiçbir farklı kümeleri var gibi hiçbir genotipleri, bu yoğunluk arsa elde edilebilir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Discussion

Büyük ölçekli genotiplendirme uygulamaların daha çok insan hastalıklarının altında yatan genetik mekanizmasını anlamak için kullanılmıştır. Bir genom ilişki analizi yoluyla önemli bir varyantı keşif daha fazla çalışma için bir aday bölgeyi bayrak olabilir. Buna ek olarak, genotip veri dizileme projeleri üzerinde kalite kontrol için iyi bir araçtır.

Numune hacmini en üst düzeye çıkarmak için, birden çok numune levhalar büyütülmüş ve parçalanmış, yeniden süspansiyon haline getirilmiş eyalette saklanabilir. Sekiz plakalar birden çok toplu için protokolün ilk 24 saat birleştirerek ve chip-işleme ~ 2-8 gün için yeterince malzeme sağlayan, tek bir gün içinde güçlendirilebilir. Güçlendirilmiş plakaları önceden stoklanmış, ve yeni örnekleri taramalı önceki çalışması başlar hemen sonra cips melezleşmiştir ise, işleme ek numune hazırlama için duraklama gerek olmadan sürekli çalıştırabilirsiniz. Bu nedenle olsa örnekler tam geçmesi için üç gün sürertahlil, veriler günlük oluşturulabilir. Assuming24 cips her gün işlenen, 5 günlük bir çalışma haftası 12 numune boncuk çip üzerinde çalıştırmak üzere 1000 yılı aşkın bir DNA örneklerinin sağlar. Herhangi bir adım veya reaktif başarısız olursa herhangi bir düzeltme uygulanabilir önce, ancak, birden fazla toplu kötü performans için risk altında olabilir. Diziler taranmış veya analiz edilinceye kadar hataları fark kaçış olabilir; verim maksimize bu nedenle, protokol çeşitli aşamalarında numunelerin şimdiden yüzlerce keşif üzerine aynı kusurlu tedavi almış olabilir. Kayıp reaktifler ve veri geri alınamaz gibi, kullanıcı hızlandırılmış bir iş akışı için ihtiyaç karşı bu riskleri tartmak gerekir.

GenomeStudio analiz yazılımı gerçekten genotiplendirme sürecinin başarısını ölçmek için ilk fırsattır. Norm-Teta yoğunluk araziler vs Norm-R düzgün kümelenmiş ise bu değer sli göstermekle beraber, numunelerin ortalama çağrı sayısı (toplam SNP yüzde başarıyla yazdığınız),% 99 yaklaşım gerekirghtly dizi türüne bağlı. % 85-90 daha düşük bir çağrı oranı ile herhangi bir örnek veriler güvenilir değildir ve atılmalıdır. Kalite kontrolü amacıyla, sonuçlar, daha önce mümkün olan her zaman bilinen bir genotip ile karşılaştırılmalıdır. Böyle bir veri varsa, kasıtlı örnek çoğaltılması plaka ya da dizi yerleşimleri doğrulayarak bir araçtır. Bu yinelenen çiftleri ayrı cips, levhalar, gruplar, ya da projeler üzerinde konulmalıdır; onların genotipleri üretimi üzerine kontrol etti. Belirli QC kısıtlamaları araştırmacının tercihine göre değişmekle birlikte, ortak SNP kısıtlamalar örnek çağrı başarı, Hardy-Weinberg denge, ya da vakalar ve kontroller arasındaki missingness, dayalı ortak örnek kısıtlamaları arama oranları, Mendel tutarsızlıklar veya çapraz referanslara dayalı iken Klinik cinsiyet verilerine X-kromozom heterozigosite [13].

Herhangi bir sorun ortaya çıkarsa, analiz takımında bulunan Denetimler Dashboard, teslim edilebilirnedenini belirlemek amacıyla şirket. Bu kontroller genellikle muhtemel adıma veya reaktif başarısızlık sorunu daraltmak. Ilgi herhangi bir SNP Infinium genotiplendirme deney yoluyla bulunursa, bunların yoğunluk araziler çift kontrol daha fazla araştırma yapılır önce kümeleme hataları GenomeStudio olmalıdır.

Başarısız Infinium genotiplendirme deney nedeniyle insan işleme hatası veya düşük kaliteli giriş DNA muhtemeldir. Örnek ölçümü doğru ve kesin olmalıdır. En iyi sonuçları elde etmek için, herhangi bir reaktif bir örneğe ilave veya yonga protokolü tarafından belirlenen ses seviyesinde tevzi gerekir. Pipetler düzgün kalibre edilmelidir. Reaktifler bitiminden sonra koşmak olmamalı ve bir kez eritilip tekrar dondurulmamalıdır, RA1 reaktif için kaydedin. Mümkün boyama ve uzatma hataları en aza indirmek amacıyla, formamid / EDTA kanşımı her ay yeni hazırlanmalıdır. Tüm reaktifler, -20 ° C, sadece el ile defrost dondurucu saklanmalıdır. St kullanılan tüm laboratuvarAining, protokol uzantısı ve yıkama bölümleri hemen terketmek üzerine su ve yumuşak bir deterjan ile iyice durulanmalıdır. HYB odasında nemlendirme rezervuarlar bir test tüpü fırça ve hafif bir deterjanla temizlendi olmalıdır. Haftada bir kez, kendi kullanıcı kılavuzları tarafından talimat olarak cam slaytlar,% 10 çamaşır suyu ile yıkanmalıdır.

Disclosures

Bu makalenin yazarları ifşa etmek hiçbir rakip mali çıkarları var.

Acknowledgements

Bu iş için finansman NIH P20 GM103456, NIH RC2 AR058959 ve NIH R56 AI063274 tarafından sağlanmıştır

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumable or Equipment Manufacturer Part Number Minimum Required for 96 Samples
0.8 ml Deep Well Plate Thermo Scientific AB-0765 1
Plate Mats Thermo Scientific AB-0674 2
Reagent Basin Fisher Scientific 13-681-502 9
Heat-seal Sheets Thermo Scientific AB-0559 1
Flow-through Spacer Fisher Scientific NC9563984 6
Pipette tips - 200 μl Rainin GP-L200F 192
Pipette tips - 10 μl Rainin GP-L10F 16
Pipette tips - 1,000 μl Rainin GP-L1000F 16
DNA Suspension Buffer Teknova T0220 0.5 ml
0.1 N NaOH Fisher Scientific AC12419-0010 0.5 ml
Isopropanol (HPLC grade) Fisher Scientific A451 15 ml
Ethanol (200-proof) Sigma-Aldrich 459836 330 ml
Formamide (100%) Thomas Scientific C001K38 15 ml
EDTA (0.5 M) Amresco E177 0.2 ml
10 μl 8-channel Pipette Rainin L8-10XLS 1
200 μl 8-channel Pipette Rainin L8-200XLS 2
1,000 μl Single-channel Pipette Rainin L-1000XLS 1
Microplate Shaker VWR 13500-890 1
Refrigerated Microplate Centrifuge VWR BK369434 1
Hybridization Oven Illumina SE-901-1001 1
Hybex Microsample Incubator SciGene 1057-30-0 1
Hybex MIDI Heat Block Insert Illumina BD-60-601 1
Heat Sealer Thermo Scientific AB-0384 1
Hyb Chamber w/ Insert and Mat Illumina BD-60-402 2
Surgical Scissors Fisher Scientific 13-804-20 1
Flow Through Assembly Parts Illumina WG-10-202 8
Wash Rack and Dish Illumina BD-60-450 1
Genepaint Chamber Rack Tecan 760-800 1
Temperature Probe Illumina A1-99-109 1
Staining Rack and Dish Illumina WG-10-207 1
Self-Closing Tweezers Ted Pella, Inc 5374-NM 1
Vacuum Manifold Ted Pella, Inc 2240 1
iScan or HiScan Illumina - 1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shi, M. M. Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technologies. Clin. Chem. 47, (2), 164-172 (2001).
  2. Livak, K. J. SNP genotyping by the 5'-nuclease reaction. Methods Mol. Biol. 212, 129-148 (2003).
  3. Seeb, J. E., Pascal, C. E., Ramakrishnan, R., Seeb, L. W. SNP genotyping by the 5'-nuclease reaction: advances in high throughput genotyping with non-model organisms. Methods in Mol. Biol. 578, 277-292 (2009).
  4. Bayés, M., Gut, I. G. Overview of Genotyping. Molecular Analysis and Genome Discovery. ed, 2nd, John Wiley & Sons, Ltd. Chichester, UK. 1-23 (2011).
  5. Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. Single-Nucleotide Polymorphisms for High-Throughput Genotyping of Anopheles arabiensis in East and Southern Africa. J. Med. Entomol. 49, (2), 307-315 (2012).
  6. Liu, Z. SNP Genotyping Platforms. Next generation sequencing and whole genome selection in aquaculture. Wiley-Blackwell. 123-132 (2011).
  7. Shen, R., Fan, J. B., et al. High-throughput SNP genotyping on universal bead arrays. Mutat. Res./Fundam and Mol. Mech. of Mutagenesis. 573, (1), 70-82 (2005).
  8. Ragoussis, J. Genotyping technologies for all. Drug Discov. Today: Technol. 3, (2), 115-122 (2006).
  9. Wu, C. C., Shete, S., Jo, E. J., et al. Whole-Genome Detection of Disease-Associated Deletions or Excess Homozygosity in a Case-Control Study of Rheumatoid Arthritis. Hum. Mol. Genet. (2012).
  10. Green, E. K., Hamshere, M., Forty, L., et al. Replication of bipolar disorder susceptibility alleles and identification of two novel genome-wide significant associations in a new bipolar disorder case-control sample. Mol. Psychiatry. (2012).
  11. Shete, S., Hosking, F. J., Robertson, L. B., et al. Genome-wide association study identifies five susceptibility loci for glioma. Nat. Genet. 41, (8), 899-904 (2009).
  12. Inc Illumina. Infinium HD Ultra User Guide 11328087 RevB-1. 15-101 (2009).
  13. Turner, S., Armstrong, L. orenL., Yuki Bradford,, et al. Quality Control Procedures for Genome Wide Association Studies. Curr Protoc Hum Genet. 1-19 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics