Infinium الفحص على نطاق واسع لتطبيقات SNP التنميط الجيني

Biology
 

Summary

يوصف بروتوكول يستخدم المقايسات Infinium البورشيد على أداء نطاق واسع التنميط الجيني. ويمكن لهذه المقايسات التركيب الوراثي موثوق الملايين من النيوكلوتايد عبر مئات من عينات الحمض النووي الفردية في ثلاثة أيام. مرة واحدة ولدت، هذه التراكيب الوراثية يمكن استخدامها للتحقق من الجمعيات مع مجموعة متنوعة من الأمراض المختلفة أو الظواهر.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Adler, A. J., Wiley, G. B., Gaffney, P. M. Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications. J. Vis. Exp. (81), e50683, doi:10.3791/50683 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

المتغيرات التنميط الجيني في الجينوم البشري وقد ثبت أن تكون وسيلة فعالة لتحديد الجمعيات الجينية مع الظواهر. توزيع المتغيرات داخل الأسر أو السكان يمكن أن تسهل التعرف على العوامل الوراثية للمرض. لوحة البورشيد من BeadChips التنميط الجيني يسمح المحققين إلى التركيب الوراثي الآلاف أو الملايين من تعدد الأشكال النوكليوتيدات واحد (تعدد الأشكال) أو لتحليل المتغيرات الجيني أخرى، مثل عدد النسخ، عبر عدد كبير من عينات الحمض النووي. يمكن أن تنتشر هذه النيوكلوتايد في جميع أنحاء الجينوم أو المستهدفة في مناطق محددة من أجل تحقيق أقصى قدر من اكتشاف المحتملة. وقد تم تحسين مقايسة Infinium لانتاج عالية الجودة، ونتائج دقيقة بسرعة. مع الإعداد السليم، يمكن للفني واحد معالجة من بضع مئات إلى أكثر من ألف عينات من الحمض النووي في الأسبوع، وهذا يتوقف على نوع صفيف. هذا الاختبار أدلة المستخدمين من خلال كل خطوة، بدءا من الحمض النووي الجيني وتنتهي مع المسح الضوئي للمجموعة. باستخدام اللياقة reageاليلة، وتتضخم عينات، مجزأة، عجل، معلق، المهجنة إلى الرقاقة، وسعت من خلال قاعدة واحدة، الملون، ومسحها على أي نظام التصوير الضوئي عالية الدقة iScan أو مرحبا المسح الضوئي. مطلوب خطوة واحدة بين عشية وضحاها لتضخيم الحمض النووي. الحمض النووي هو التشويه والتحريف وتضخيمها من قبل isothermally كامل الجينوم التضخيم، وبالتالي، لا يلزم PCR. يتم تهجين العينات إلى صفائف خلال خطوة الثانية بين عشية وضحاها. في اليوم الثالث، وعينات على استعداد ليتم فحصها وتحليلها. يمكن تخزينها تضخيم الحمض النووي بكميات كبيرة، مما يسمح صفائف حبة لتتم معالجة كل يوم من أيام الأسبوع، وبالتالي تحقيق أقصى قدر من الإنتاجية.

Introduction

كتابة الأشكال المتعددة للتركيبات النووية المنفردة (النيوكلوتايد) هو وسيلة أساسية لتحديد المتغيرات المخاطر المرتبطة بالمرض. تاريخيا، في نطاق التجارب التنميط الجيني قد يحد من التكنولوجيا المتاحة. أساليب التنميط الجيني استنادا الكهربائي جل محدودة في عينة وSNP-الإنتاجية [1]. يمكن تطوير هذه المقايسات غالبا ما تكون كثيفة العمالة، والاعتماد على الماكياج وبنية المنطقة المحيطة البديل الأمثل ل[1]. يمكن المقايسات TaqMan التنميط الجيني، التي وضعتها تقنيات الحياة، تشغيل عدد كبير من العينات بسرعة وبأقل قدر من تدخل فني [2]، ولكن لا تزال القيود SNP-المتنوعة للحد من عدد من المورثات إلى ما تحت المليون في اليوم الواحد [3،4 ]. منصة Sequenom في IPLEX يمكن أيضا تشغيل العديد من العينات في وقت واحد، ولكن، كما يقل عن مائة النيوكلوتايد يمكن المضاعفة معا، الإنتاجية منخفضة نسبيا بشكل عام [5]. تكنولوجيا تيار SNP بيكمان كولتر ومن الناحية النظرية يمكن أن تنتج أكثر من ثلاثة ملايين المورثات في اليوم الواحد، ولكن هذا المشروع مجموعة حدود التكنولوجيا إلى حد أقصى قدره ثماني وأربعين فقط النيوكلوتايد في رد فعل [4،6]. بينما يمكن للفحص GoldenGate معالجة ما يقرب من مائتي عينات من الحمض النووي في كل يوم على مئات أو آلاف من تعدد الأشكال لكل عينة، والثمن في التركيب الوراثي ليست تنافسية مع متقدمة، وتقنيات فائقة الإنتاجية عند كتابة اكثر من ثلاثة آلاف تعدد الأشكال في وقت واحد [4،7 ]. من أجل معالجة عدة ملايين من المورثات في اليوم الواحد، والنطاق المطلوب لدراسات كبيرة الجينوم على نطاق الرابطة، أصبحت مجموعة المقايسات التهجين الخيار الأكثر فعالية من حيث التكلفة في السوق.

خط [أفمتريإكس] من صفائف التهجين وخط البورشيد من صفائف استنادا Infinium-تسمح يحتمل مئات العينات المراد كتابتها على مئات الآلاف أو الملايين من النيوكلوتايد بالتوازي [4،8]. يمكن أن تكون منتشرة في جميع أنحاء هذه النيوكلوتايد الجينوم بأكمله، مترجمة في مناطق المصالح، مثل السابقينOMES، أو مخصصة لتفضيل المستخدم. هذه المصفوفات والاستفادة من كونها ليس فقط قادرا على التركيب الوراثي بدقة مليون النيوكلوتايد لكل عينة في وقت واحد، ولكن أيضا لقياس التباين في عدد النسخ، شذوذ الكروموسومات يحتمل الستار. Infinium الانحياز صفائف OMNI BeadChip دينا حاليا القدرة على التركيب الوراثي يصل إلى ما يقرب من خمسة ملايين علامات لكل عينة، بما في ذلك نصف مليون مواضع مخصصة، على عدد يصل إلى ما يقرب من مائة عينات كل يوم.

حيث أن معظم الأمراض يكون لها عنصر وراثي، يمكن لهذه التجارب على نطاق واسع أن يكون حاسما في إيجاد الجينات المرتبطة بالمرض. عالية الإنتاجية التنميط الجيني الوراثي يسمح لتوليد كفاءة في عينة مجموعات كبيرة بما يكفي للكشف مقنع جمعية الوراثية في انخفاض الترددات أليل طفيفة. مشاريع التنميط الجيني كامل الجينوم يمكن أن تستخدم لتحديد المناطق ذات الحالات والشواهد تردد أليل ذات دلالة إحصائية أو الاختلافات في عدد النسخ [9،10،11]. وفقا لقه البشرية الوطنيةمعهد بحوث نومي، بقيادة جمعية دراسات الجينوم على نطاق 1،490 إلى منشورات منفصلة بين 25 نوفمبر 2008 و 25 يناير 2013، انطلاقا من اكتشاف 8،283 تعدد الأشكال مع ف قيمة أقل من 1 × 10 -5 (انظر الإلكتروني http:// www.genome.gov/gwastudies/). هذه الدراسات، والتي بحثت الظروف التي تتراوح بين ارتفاع لسرطان الخصية، واستفاد من نهج واسع النطاق التي يوفرها التحليل على نطاق الجينوم. في مثل هذه الحالات، مناطق بأكملها من الفائدة قد هربوا إشعار قد نطاق الكتابة كانت مقيدة للغاية. وبالتالي، ليحلل جمعية على نطاق واسع، وهي تقنية التنميط الجيني على نطاق الجينوم هو الأسلوب في الاختيار.

إصدارات مختلفة من الفحص Infinium موجودة، كل المعدة للاستخدام مع أنواع معينة من المصفوفات. مقايسة InfiniumUltra، التي نوقشت في عمق أدناه، هو مناسبة لكثير من 12 - أو 24 عينة رقائق صفيف. هذه غالبا ما التركيب الوراثي أكثر من مائة ألف النيوكلوتايد لكل عينة الحمض النووي والتركيز على رargeted المناطق، مثل على لوحات exome أو العرف. قد تكون هناك حاجة الإصدارات مقايسة أخرى لأنواع شرائح أخرى، مثل صفائف التنميط الجيني كامل الجينوم. لكن، وكما تشترك جميع المقايسات Infinium أساس مشترك وتختلف أساسا إلا من خلال أسماء كاشف، كاشف وحدات التخزين، أو الإجراء المحدد تلطيخ كاشف، وتقنيات الكمال على نسخة فحص واحد كثيرا ما يمكن تطبيقه عالميا. المصفوفات الأخرى، مثل صفائف مثيلة، قد تستخدم بروتوكول متطابقة تقريبا، كذلك. يجب الحرص على استخدام الإصدار فقط للمقايسة المطلوبة لنوع رقاقة في الاستخدام. بعض الأنواع، مثل تلك الجينات قياس مستوى التعبير، قد تتطلب استخدام بروتوكول nonInfinium.

يجب أن تتم معالجة عينات على دفعات. على سبيل المثال، مع مقايسة InfiniumUltra، وأنابيب prehybridization كاشف تحتوي على ما يكفي لتشغيل 96 حجم العينات، والأنابيب لا يمكن أن أعيد تجميدها مرة أخرى. لذلك، يجب تشغيل العينات على دفعات من 96 عينات في وقت واحد. سوف تتضخم عينات على التنوبر اليوم. بعد ما يقرب من 1 ساعة من benchwork، يجب تسخين العينات في الفرن الحراري ل20-24 ساعة. في اليوم التالي، وسيتم إنفاق ما يقرب من 4 ساعات تفتيت، مما عجل، وإعادة التعليق العينات، وعند هذه النقطة العينات يمكن أن تكون إما مجمدة لاستخدامها في المستقبل أو المهجنة إلى الرقاقة. تحميل رقائق يأخذ ما يقرب من 2 ساعة، وبعد ذلك سيتم تهجين العينات بين عشية وضحاها ل16-24 ساعة. في اليوم الثالث، فإن الخطوة تلطيخ والإرشاد يأخذ ~ 4 ساعة. وسيتم إنفاق المزيد من ساعة والغسيل، والطلاء، وتجفيف رقائق البطاطس. أخيرا، يتم فحص صفائف، التي قد تستغرق 15-60 دقيقة / رقاقة، وهذا يتوقف على نوع استخدامها.

تطبيق سلامة المختبرات والنظافة الاحتياطات القياسية. وإن لم يكن يستند PCR-التضخيم، ومحطات العمل منفصلة عن إجراءات ما قبل وpostamplification ضرورية من أجل تقليل احتمالات التلوث. يجب أن يتم تسجيل رقم هوية كل كاشف الموفر في استخدام عدة على ورقة تتبع. Reageيجب إذابة اليلة فورا قبل الاستخدام ومقلوب عدة مرات قبل صرفها. يجب أن يكون الحمض النووي لأن تكتب عالية الجودة الحمض النووي الجيني (260/280 نسبة الامتصاصية من 1،6-2،0، 260/230 نسبة امتصاص أدناه 3.0)، معزولة بالطرق العادية وكميا مع التألق. تدهور الحمض النووي وغالبا ما يكون عاملا مساهما في نتائج الفحص منخفضة الجودة. عادة، مطلوب 200 نانوغرام من الحمض النووي، ورغم أن هذا المبلغ قد تختلف عن بعض أنواع رقاقة. A TECAN مناولة السائل الروبوت يمكن أتمتة العديد من الخطوات للبروتوكول وتقليل الخطأ البشري باعتباره عاملا.

Protocol

يوم واحد

1. إعداد

  1. الاستغناء 200 نانوغرام من الحمض النووي في، لوحة 96 عينة من الآبار العميقة. لا يقل عن 96 عينات (لوحات كاملة) يجب مطلي لضمان سوف يضيع أي كاشف. تسمية لوحة مع لاصق الباركود التي قدمتها عدة وأجهزة الطرد المركزي لذلك.
  2. من أجل تطبيع مجلدات، وترك العينات في درج أو الدخان هود بين عشية وضحاها لتتبخر السائل. تغطية لوحة فضفاضة مع غطاء أو منشفة ورقية لمنع دخول الغبار.

2. توسيع

تحذير: يجب أن لا تخضع عينات التضخيم إلا 4 ساعات وسوف تكون متاحة في اليوم التالي للخطوات تجزئة، وهطول الأمطار، وإعادة تعليق.

  1. إزالة مربع الموفر شركة أو حزمة من الأنابيب المسمى "ما قبل" من الثلاجة -20 درجة مئوية (أنبوب واحد من MA1، MA2، وMSM كافية لكل مجموعة من 96 عينات). مجموعة أنابيب من MA2 وMSM على مقاعد البدلاء لذوبان الجليد. بدوره على معايرة بشكل صحيحالفرن وتعيين إلى 37 درجة مئوية.
  2. باستخدام حوض كاشف وميكرولتر 10، 8 قنوات ماصة، الاستغناء 4 ميكرولتر من الحمض النووي العازلة إعادة تعليق في كل بئر لترطيب العينات. فإنه ليس من الضروري لتجاهل نصائح ماصة بين كل عمود إذا تم الحرص على عدم لمس السائل.
  3. مع ماصة 8 قنوات، تستغني 20 ميكرولتر من MA1 في كل بئر من لوحة. لكل كاشف جديدة، واستخدام حوض كاشف الطازجة. تغطية لوحة مع ختم قابلة لإعادة الاستخدام، نبض أجهزة الطرد المركزي، ودوامة لمدة 1 دقيقة في 1600 دورة في الدقيقة على شاكر صفيحة ميكروسكوبية.
  4. 2.4) يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل.
  5. الاستغناء 4 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 0.1 N في كل بئر من لوحة. تغطية لوحة بخاتم قابلة لإعادة الاستخدام، نبض أجهزة الطرد المركزي، ودوامة لمدة 1 دقيقة في 1600 دورة في الدقيقة.
  6. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
  7. الاستغناء 34 ميكرولتر من MA2 في كل بئر من لوحة.
  8. الاستغناء 38 ميكرولتر من مسقط إلى كل بئر من لوحة. تغطية مع لوحةختم قابلة لإعادة الاستخدام، نبض أجهزة الطرد المركزي، ودوامة لمدة 1 دقيقة في 1600 دورة في الدقيقة.
  9. وضع في الفرن لمدة 20-24 ساعة.

اليوم الثاني

3. تجزئة

  1. إزالة أنابيب من FMS "بعد 1" -20 ° C مربع (أنبوب واحد يكفي لكل مجموعة من 96 عينات). ذوبان الجليد على مقاعد البدلاء أو في حمام مائي درجة حرارة الغرفة. بعد إدخال MIDI لوحة إدراج في نظام الطاولة microsample الحضانة، بدوره على كتلة الحرارة وتعيين إلى 37 درجة مئوية.
  2. حالما يتم إذابة الأنابيب، وإزالة لوحة عينة من الفرن ونبض الطرد المركزي. الاستغناء 25 ميكرولتر من FMS في كل بئر من لوحة الحمض النووي. استبدال الغطاء، نبض أجهزة الطرد المركزي، ودوامة في 1،600 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة.
  3. احتضان لوحة في كتلة الحرارة لمدة 1 ساعة.

4. هطول

  1. إزالة أنبوب من PM1 "بعد 3" 4 ° C مربع أو حزمة والحارة إلى درجة حرارة الغرفة (أنبوب واحد يكفي لكل مجموعة من 96 عينات). إزالة لوحة من كتلة الحرارةك ونبض الطرد المركزي.
  2. الاستغناء 50 ميكرولتر من PM1 في كل بئر من لوحة. استبدال الغطاء، نبض أجهزة الطرد المركزي، ودوامة في 1،600 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة.
  3. احتضان لوحة في كتلة الحرارة لمدة 5 دقائق.
  4. إزالة لوحة من كتلة الحرارة، وإيقاف تشغيله، وتجاهل لوحة غطاء. الاستغناء 155 ميكرولتر من 100٪ الأيزوبروبانول في كل بئر من لوحة. وتغطي بإحكام مع غطاء جديد ويدويا عكس لوحة عدة مرات لخلط.
  5. وضع لوحة في 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة. تشغيل أجهزة الطرد المركزي المبردة وتعيين إلى 4 درجة مئوية لتبرد.
  6. تحقيق التوازن في لوحة وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة في 3،000 ز س.
  7. فحص الجزء السفلي من لوحة من دون عكس ذلك وتأكد من أن يتم عجلت العينات في الزرقاء بيليه. إذا لا يمكن رؤية الكريات، أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى. الحصول على مناشف ورقية.
  8. تجاهل الغطاء وبسرعة إزالة السائل بواسطة لوحة للقلب والتنصت عليه بقوة على الفوق المشمولة في مناشف ورقية. مرة واحدة لوحة هو طnverted، والحرص على عدم الرجوع في حين يبقى أي سائل. مرارا وتكرارا الاستفادة من لوحة ضد الفوق حتى تتم إزالة جميع السائل.
  9. ضبط لوحة على رف أنبوب الاختبار، مقلوب، لتجف. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.

5. إعادة تعليق

  1. إزالة RA1 من "ما بعد 2" -20 C مربع وذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة حمام الماء °. تشغيل الفرن وتعيينها إلى 48 درجة مئوية.
  2. مرة واحدة إذابة، تستغني 23 ميكرولتر من RA1 إلى كل بئر من لوحة عينة. لا صب زجاجة كاملة من RA1 في الحوض؛ انقاذ 30 مل في وقت لاحق. إذا كان سيتم تهجين العينات على صفائف في وقت لاحق من ذلك اليوم، وضع RA1 إلى 4 ° C برودة. إذا كان سيتم تشغيل العينات في وقت لاحق، تسمية زجاجة واعادة تجميد على RA1.
  3. للحرارة ختم غطاء جديد على طبق. نبض الطرد المركزي لوحة ووضعها في الفرن لمدة 1 ساعة.
  4. إزالة لوحة من الفرن ودوامة في 1،800 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة.
    يمكن أن العينات تكون ح بأمانELD في هذه المرحلة لمدة أسبوع وتصل إلى واحد. يمكن تخزينها لوحات، ويمكن تنظيم العينات للتحضير لتطبيق رقاقة حبة، إذا لزم الأمر. إذا الشروع في هذا الإجراء، ترك لوحة في درجة حرارة الغرفة وتشغيل كتلة الحرارة. خلاف ذلك، وتخزين لوحة في -20 درجة مئوية.

6. تهجين

تحذير: يجب أن لا تخضع عينات التهجين ما لم تتوفر 5.5 ساعة في اليوم التالي لتلطيخ وغسل الخطوات.

  1. بدوره على كتلة الحرارة وتعيينها إلى 95 درجة مئوية. تشغيل الفرن وتعيينها إلى 48 درجة مئوية.
  2. بمجرد استقرار درجة الحرارة، واحتضان لوحة في كتلة الحرارة لمدة 20 دقيقة.
  3. في حين أن لوحة يتم تغيير طبيعة، إزالة مربع من رقائق حبة من 4 ° C ووضعه على مقاعد البدلاء. تأخذ زجاجة من XC4 (من عدة درجة حرارة الغرفة) وإضافة 330 مل من الإيثانول بنسبة 100٪. يهز جيدا واحتضان في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. تحضير مزيج الفورماميد / EDTA (95٪ الفورماميد، 0.2٪EDTA (0.5 M)، 4.8٪ H 2 O من حيث الحجم) وتجميد منفصلة في 15 مل الزيادات. يمكن تخزينها الفورماميد الزائدة.
  4. إزالة لوحة عينة من كتلة الحرارة. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  5. في حين أن لوحة والتبريد، وإعداد غرفة HYB. وستكون هناك حاجة واحدة غرفة لكل أربعة رقائق حبة معالجتها.
    وضع حصيرة المطاط على الجزء العلوي من قاعدة غرفة HYB، محاذاة ثقب سمكا مع الجزء الأمامي من القاعدة. رمز الباركود محفورا في قاعدة ينبغي أن تكون لا تزال واضحة (انظر الشكل 2).
  6. باستخدام ماصة ميكرولتر 1،000، الاستغناء 400 ميكرولتر من PB2 في كل من الخزانات الرطوبة ثمانية منحوتة في القاعدة. PB2 يمكن العثور عليها في "بعد 3" مربع أو حزمة. وضع غطاء غرفة HYB على قاعدة وقفل طرفي طريق إغلاق اثنين من المشابك على طرفي نقيض قطريا أولا.
  7. إزالة حزم الفضة الفردية من رقائق حبة من صناديق كل منها، ولكن، من أجل تقليل المعرض رقائق 'تأكد من الهواء والضوء، لا تفتح لهم حتى الآن. مسح الباركود بعناية من رقائق وتسجيل الترتيب الذي سيتم تحميلها على ورقة تتبع، جنبا إلى جنب مع معرفات مربع التي أتوا منها. فهم شامل من حيث سيتم الاستغناء عن كل عينة الحمض النووي الفردية على رقائق حبة ضروري.
  8. إزالة حزم الفضة الفردية من رقائق حبة من صناديق كل منها، ولكن، من أجل تقليل تعرض رقائق 'للهواء والضوء، لا تفتح لهم حتى الآن. مسح الباركود بعناية من رقائق وتسجيل الترتيب الذي سيتم تحميلها على ورقة تتبع، جنبا إلى جنب مع معرفات مربع التي أتوا منها. فهم شامل من حيث سيتم الاستغناء عن كل عينة الحمض النووي الفردية على رقائق حبة ضروري.
  9. فقط قبل 30 دقيقة يبرد اكتمال، فتح الفضة حبة حزم رقاقة. إزالة رقائق من البلاستيك الأكمام واضحة لهم. دون لمس الخرز، ووضع كل رقاقة حبة على إدراج غرفة HYB، وتوجيه رقاقةالباركود مع رمز الباركود محفورا في أعلى سطح إدراج ل.
  10. تقشر وتجاهل غطاء لوحة العينة. يستغرق 15 ميكرولتر من عينة من لوحة عينة والاستغناء ببطء على مدخل إلى مجموعة (انظر الشكل 3). يجب توخي الحذر استثنائية لوضع عينة الصحيح على رقاقة حبة الصحيح في الموضع الصحيح، مطابقة النظام رقاقة حبة سجلت في وقت سابق. ماصة الأقنية التي يمكن استخدامها لالاستغناء السائل على رقائق، ولكن يجب أن تؤخذ التدبر لنضح فقط عدد العينات التي يمكن وضعها بأمان على رقاقة حبة، وعدد الصفوف على طبق من ذهب لا تتطابق دائما مع عدد من الصفوف على رقاقة.
  11. مرة واحدة وقد تم وضع كل عينة على مجموعة المقابلة لها، بصريا تفقد رقاقة لفقاعات أو المناطق التي لم المغلفة في السائل. في حالة وجود هذه المشاكل، صخرة بلطف إدراج. إذا لزم الأمر، ويمكن إضافة مزيد من السائل إلى مجموعة. رعاية لإضافة عينة من الحمض النووي الصحيح.
  12. فتح حجرة HYBد وضع إدراج أكثر من الخزانات الرطوبة. يجب وضع الباركود من خلال رقاقة الباركود محفورا في قاعدة غرفة HYB. استبدال غطاء غرفة HYB وإغلاق كافة المشابك أربعة عن طريق إغلاق المشابك على طرفي نقيض قطريا أولا.
  13. احتضان الغرفة HYB في الفرن لمدة 16-24 ساعة. والحرص على عدم إمالة الغرف عندما نقلها.
  14. إذا أكثر من لوحة واحد هو أن تتم معالجتها، والعودة إلى الخطوة 6.2. معالجة أكثر من 24 حبة رقائق في يوم واحد لا ينصح من أجل تقليل كلا من احتمال الخطأ البشري عند التعامل مع كمية كبيرة من المواد الاستهلاكية أو رقائق وتقليل مقدار الوقت المطلوب لمعالجة رقائق في الخطوات المستقبلية، كما يجب العناية يجب اتخاذها للحد من تعرضها للهواء قدر الإمكان. واحد زجاجة من XC4 يكفي لمدة تصل إلى 24 رقائق حبة.

اليوم الثالث

7. إعداد تلطيخ

  1. إزالة غرف HYB من الفرن ويحضن في غرفة الشركة المصرية للاتصالاتmperature لمدة 25 دقيقة. إذا تجهيز أكثر من مجلسين HYB، ارباك بهم مزدوج إزالة كل 10 دقيقة. من اجل الحفاظ على رقائق من الجفاف، لا تفتح حتى الآن غرف HYB.
  2. في حين أن غرف HYB والتبريد، وإزالة أنابيب من XC1، XC2، تيم، STM، وأجهزة الصراف الآلي من "ما بعد 1" -20 مربع C ° وتعيين على مقاعد البدلاء لذوبان الجليد. تأخذ زجاجة من RA1 من "ما بعد 2" مربع في -20 درجة مئوية (أو 4 درجات مئوية إذا إعادة استخدام كاشف عن اليوم السابق) وذوبان الجليد في حمام مائي درجة حرارة الغرفة. ذوبان الجليد أنبوب من 95٪ الفورماميد كذلك. سوف لمدة 8 رقائق حبة معالجتها، أنبوبين من كل كاشف، 10 مل RA1، 15 مل الفورماميد، و 150 مل XC3 (وجدت في درجة حرارة الغرفة، مربع الموفر شركة) تكون مطلوبة.
  3. لكل رقاقة معالجة، سوف تكون هناك حاجة شريحة زجاجية واحدة، من خلال تدفق البلاستيك قوس واحدة، واثنين من المشابك المعدنية، وفاصل واحد من البلاستيك. لهل بلاستيكية، استخدم فقط واضحة واحدة، وتجاهل فصل فاصل مبهمة. بالإضافة إلى ذلك، اثنين حبة الأطباق غسل رقاقة ووستكون هناك حاجة علبة شرائح حبة واحدة، جنبا إلى جنب مع واحدة محطة تجميع السائل وبار واحد تجميع البلاستيك.
  4. تنظيف الشرائح الزجاجية عن طريق الرش لهم الإيثانول ومحو لهم الجافة.
  5. بدوره على حمام الماء الساخن وهذا ما تعلق على التدفق من خلال غرفة رف وتعيينها إلى 44 درجة مئوية. يهز بلطف رف غرفة لطرد أي فقاعات.
  6. عندما تبرد الغرفة HYB لمدة 25 دقيقة، وملء طبق غسيل مع PB1 (حوالي 200 مل). PB1 يمكن العثور عليها في "ما بعد 4" غرفة مربع درجة الحرارة.
  7. فتح غرفة HYB واحدة. إزالة ختم غطاء من رقاقة حبة عن طريق استيعاب الختم في زاوية واحدة وتقشير بلطف قطريا (انظر الشكل 4). مرة واحدة تتم إزالة الختم، وضع على الفور الشريحة في علبة رقاقة حبة ويغرق في PB1 دون لمس الخرز. كرر حتى يتم ملء علبة مع رقائق حبة، مع الحرص على عدم السماح لأي رقاقة جافة.
  8. تستنهض الهمم بلطف صينية لإزالة أي فقاعات وترك رقائق المغمورة لمدة 1 دقيقة.ملء طبق غسيل الثانية مع PB1. تستنهض الهمم علبة مرة أخرى.
  9. نقل علبة من رقائق حبة في طبق غسيل الثانية. تستنهض الهمم بلطف، والسماح ينقع لمدة 1 دقيقة، ثم تستنهض الهمم مرة أخرى.
  10. في محطة تجميع السائل التدفق من خلال، وضع أربعة بلاستيكية سوداء الأقواس في التدفق من خلال الأخاديد. ملء مع محطة PB1 حتى تصل إلى ما يقرب من السائل ذروة الأقواس التجمع ثمانية (حوالي 150 مل).
  11. إزالة رقاقة حبة من علبة ووضعه في محطة التجميع على البلاستيك التدفق من خلال هدفين. الباركود رقاقة يجب أن تكون محاذاة فوق رمز الباركود محفورا في محطة التجميع. تكرار لرقائق الثلاثة الأخرى التي يمكن أن تناسب داخل محطة التجميع.
  12. وضع فاصل واضح من البلاستيك على رأس رقاقة حبة. يجب على الحواف الخارجية للمباعدة تحيط الأقواس داخل محطة التجميع. تكرار لرقائق الأخرى غارقة في PB1.
  13. وضع شريط تجميع البلاستيك في محطة التجميع تركب عليه أكثر من الأخاديد. وضع بلطف شريحة زجاجية على رأس هل بلاستيكية عن طريق دفع نهاية الجزء الخلفي من الشريحة ضد شريط التجمع وخفض الجبهة في السائل ببطء. الأخدود على الجزء العلوي من الشريحة يجب ان يواجه نزولا، مباشرة فوق الباركود من الشريحة، وترك فجوة بين رقاقة وحبة الشريحة في نهاية الباركود. تكرار لرقائق الأخرى غارقة في PB1. لتدفق من خلال تجميع كامل المخطط، انظر الشكل 5.
  14. التحقق من وجود فقاعات بين رقاقة والشرائح. إذا ظهرت فقاعات، ورفع بلطف الشريحة في نهاية الباركود وحاول مرة أخرى. فقاعات المستمرة يمكن أن تمحى من الزجاج بمنشفة ورق مختبر (Kimwipe).
  15. المفاجئة اثنين مشابك معدنية حول شريحة زجاجية، واحدة قرب نهاية الباركود واحدة باتجاه العمق. حواف مشابك ينبغي قبضة قوس التدفق من خلال البلاستيك تحت رقاقة. تكرار لكل رقاقة المغمورة في PB1.
  16. إزالة التجمعات التدفق من خلال الانتهاء ووضع أفقيا على بench. والحرص على عدم إبعاد التجمع عموديا، مما يسمح السائل تحت الشريحة الزجاجية للهروب. إذا كان أكثر رقائق ينتظرون في علبة غسيل، ويمكن تجميعها تحت نفس PB1. إذا رقائق أخرى ينتظرون في غرف HYB الأصلية، ونبذ كل السائل في مركز التجمع، وغسل الأطباق، والعودة إلى الخطوة 7.6.
  17. مرة واحدة كل حبة رقائق في التدفق من خلال الجمعيات الخاصة بهم، واتخاذ زوج من مقص جراحي وخفض طرفي الفاصل قبالة، أقرب إلى شريحة زجاجية وقت ممكن.

8. تلطيخ والإرشاد

  1. تحقق من أن التدفق من خلال غرفة رف وصلت 44 درجة مئوية في مواقف متعددة مع التحقيق في درجة الحرارة. إذا كانت درجة الحرارة خارج بأكثر من نصف درجة، وضبط درجة حرارة حمام الماء.
  2. وضع التجمع التدفق من خلال رقاقة حبة على الرف الغرفة عن طريق تحريك التجمع أسفل وتركيب دعامة في الأعلى. الجانب الخلفي من رقاقة حبة ينبغي لمس رف غرفة. زالشريحة معشوقة ينبغي أن تواجه بها، مع الأخدود في الجزء العلوي لتشكيل خزان كاشف. تكرار لكل التجمع رقاقة حبة.
  3. باستخدام ماصة 200 ميكرولتر، إضافة 150 ميكرولتر RA1to المجالس التدفق من خلال الاستغناء عن طريق السائل في الخزان الزجاجي. احتضان لمدة 30 ثانية. تكرار 5X.
  4. باستخدام ماصة ميكرولتر 1،000، إضافة 450 ميكرولتر XC1to المجالس التدفق من خلال الاستغناء عن طريق السائل في الخزان الزجاجي. احتضان لمدة 10 دقيقة.
  5. إضافة 450 ميكرولتر XC2 إلى المجالس التدفق من خلال الاستغناء عن طريق السائل في الخزان الزجاجي. احتضان لمدة 10 دقيقة.
  6. إضافة 200 ميكرولتر TEM إلى المجالس التدفق من خلال الاستغناء عن طريق السائل في الخزان الزجاجي. احتضان لمدة 15 دقيقة.
  7. إضافة 450 ميكرولتر 95٪ مزيج الفورماميد / EDTA إلى المجالس التدفق من خلال الاستغناء عن طريق السائل في الخزان الزجاجي. احتضان لمدة 1 دقيقة. كرر 1X.
  8. احتضان الجمعيات التدفق من خلال لمدة 5 دقائق.
  9. تعيين حمام الماء الساخن لدرجة حرارة لترisted على أنابيب من STM (أو 37 ° C إذا ثبت بلا). تأكد من كل أنبوب STM لديه نفس درجة الحرارة المذكورة.
  10. إضافة 450 ميكرولتر XC3 إلى المجالس التدفق من خلال. احتضان لمدة 1 دقيقة. كرر 1X.
  11. عندما وصلت درجة حرارة حمام الماء الساخن إلى درجة الحرارة المطلوبة، إضافة إلى 250 μLSTM المجالس التدفق من خلال الاستغناء عن طريق السائل في الخزان الزجاجي. احتضان لمدة 10 دقيقة.
  12. إضافة 450 ميكرولتر XC3 إلى المجالس التدفق من خلال الاستغناء عن طريق السائل في الخزان الزجاجي. احتضان لمدة 1 دقيقة. كرر 1X.
  13. احتضان الجمعيات التدفق من خلال لمدة 5 دقائق.
  14. إضافة 250 ميكرولتر الصراف الآلي لمجالس التدفق من خلال الاستغناء عن طريق السائل في الخزان الزجاجي. احتضان لمدة 10 دقيقة.
  15. إضافة 450 ميكرولتر XC3 إلى المجالس التدفق من خلال الاستغناء عن طريق السائل في الخزان الزجاجي. احتضان لمدة 1 دقيقة. كرر 1X.
  16. احتضان الجمعيات التدفق من خلال لمدة 5 دقائق.
  17. إضافة 250 ميكرولتر STM إلى التدفق من خلالالمجالس التي كتبها الاستغناء السائل في الخزان الزجاجي. احتضان لمدة 10 دقيقة.
  18. Add4 50 ميكرولتر XC3 إلى المجالس التدفق من خلال الاستغناء عن طريق السائل في الخزان الزجاجي. احتضان لمدة 1 دقيقة. كرر 1X.
  19. احتضان الجمعيات التدفق من خلال لمدة 5 دقائق.
  20. كرر الخطوات 8،14-8،19 1X.
  21. إزالة التدفق من خلال الجمعيات من رف غرفة وإيقاف حمام الماء.

9. غسل وختم

  1. ملء تلطيخ حبة طبق غسيل رقاقة مع PB1 (حوالي 315 مل). وسوف تكون هناك حاجة إلى اثنين من الأطباق غسل الرأسي وصينية رقاقة حبة واحد عمودي، جنبا إلى جنب مع واحد على الأقل مشعب فراغ.
  2. تفكيك جمعية التدفق من خلال طريق إدخال قضيب معدني رفيع بين المشابك وهدفين ثم التمحور. تخصيص شريحة زجاجية وإزالة رقاقة حبة. وضع على الفور رقاقة حبة في الدرج العمودي رقاقة حبة ويغرق في PB1. تكرار لكل التجميع تدفق من خلال، مع الحرص على مواجهة مجموعة شرق افريقياح حبة رقاقة في نفس الاتجاه والتقليل من تعرضهم للهواء.
  3. تستنهض الهمم بلطف علبة شرائح حبة لإزالة الفقاعات. احتضان رقائق حبة المغمورة في PB1 لمدة 5 دقائق. ملء الطبق غسل العمودي الثاني مع XC4 أعدت في اليوم السابق. تستنهض الهمم علبة شرائح حبة مرة أخرى.
  4. نقل علبة شرائح حبة إلى الطبق غسل مليئة XC4. تستنهض الهمم بلطف صينية لإزالة الفقاعات. احتضان لمدة 5 دقائق وتستنهض الهمم مرة أخرى.
  5. في الحركة السلسة واحد، وسحب علبة شرائح حبة من الطبق غسل ووضع على رف أنبوب الاختبار، بحيث الخرز على كل وجه رقاقة حبة صعودا. مع ملاقط الذاتي قفل، والانزلاق رقاقة حبة من الدرج ووضع على رف أنبوب الاختبار. تكرار لكل رقاقة حبة.
  6. نقل بعناية أنبوب اختبار رف من رقائق لمجفف فراغ. إغلاق وتشغيل الفراغ، وضمان ختم الصحيح. احتضان لمدة 50-55 دقيقة. إذا لزم الأمر، الاحماء الماسح الضوئي أثناء الحضانة.

10. مسح

  1. توآر قبالة الفراغ والعودة ببطء إلى الضغط الجوي. تأكد من أن رقائق حبة جافة. إذا لزم الأمر، ومسح حواف والجزء السفلي من رقاقة مع منشفة ورقية لإزالة أي السائل أو حطام.
  2. تفعيل برنامج المسح ونقل رقائق حبة لمسح صينية. تحميل ملفات فك رقاقة و(dmaps) من خلال تفعيل برنامج عميل فك شفرة الملف وإدخال الباركود رقاقة حبة المطلوب، جنبا إلى جنب مع المقابلة معرفات مربع بهم. قد تكون مخزنة بأمان رقائق حبة Unscanned في منطقة مظلمة الجافة لمدة تصل إلى 72 ساعة.
  3. مرة واحدة يجلس رقائق صحيح في علبة ويتم التعرف على الملفات فك شفرة من قبل البرنامج، وبدء المسح.

Representative Results

رقاقة حبة معالجتها بشكل صحيح يجب عرض شدة ضوء الليزر الحمراء والخضراء الزاهية ومتميزة أثناء مسح. في الشكل (6)، يعرض برنامج المسح iScan عينة الحمض النووي الجيني القياسية المهجنة بنجاح إلى لوحة مخصصة SNP التنميط الجيني مجموعة. النيوكليوتيدات المسمى التي كانت تعلق خلال فترة التمديد وتلطيخ الخطوات يتألق تحت أضواء الليزر اثنين. وهذه النيوكليوتيدات توسيع انتقائي سلسلة نيوكليوتيدات دقيقة حبة والمهجنة إلى حبلا الحمض النووي مجزأة، وكما تم تصميم سلاسل نيوكليوتيدات دقيقة لإنهاء في موقع البديل، واللون وشدة الإشارة الناتجة يمكن استخدامها لتحديد الأليلات حاضرا في موقع الحزب الوطني الاسكتلندي.

ورقة المستخدم لتوليد عينة، والذي يطابق معرفات عينة والمعلومات السريرية لchipID والموقف، والحزب الوطني الاسكتلندي واضح مجموعة محددة، الحصول عليها مباشرة من الشركة، وكلاهما ضروري من أجل استيراد هيئة السلع التموينيةملفات الإخراج nner في برامج التحليل GenomeStudio. أوراق العينة سبيل المثال يمكن الاطلاع على موقع الشركة على الانترنت. مرة واحدة تم بناء المشروع GenomeStudio، ويمكن الحصول على التراكيب الوراثية من مجموعات كثافة مما أدى إنشاؤه تلقائيا من قبل البرنامج. على الرغم من وجود خيارات عرض متعددة، طريقة العرض الافتراضية، نورم-R (قيمة كثافة تطبيع) مقابل القواعد والمعايير كما ثيتا (نسبة كثافة أليلية)، وغالبا ما يكون أسهل مؤامرة التفريق ثلاث مجموعات متميزة. يجب أن تظهر معظم النيوكلوتايد واحد أو اثنين أو ثلاث مجموعات، اعتمادا على تردد أليل طفيفة.

المجموعات الثلاث تمثل عينات مما يدل AA، AB، أو BB الأليلات (انظر الشكل 7). هذه المجموعات يمكن تعيين الأنماط الوراثية إما عن طريق استيراد قالب موقف التكتل القياسية مباشرة من الشركة، من خلال تحديد "الكتلة جميع النيوكلوتايد" من شريط الأدوات تحليل البرنامج، أو عن طريق النقر والسحب على دوائر ملونة على المؤامرات كثافة التبادل الالكتروني للبيانات يدويا ل ر المكالمات. لون العينة على المؤامرة كثافة (الأحمر والأرجواني أو الأزرق) يدل على المكالمة (AA، AB، أو BB، على التوالي)، أسود يشير إلى عدم وجود مكالمة. عن طريق التمرير من خلال تعدد الأشكال المدرجة في جزء بيانات كاملة من البرنامج، تجميع لكل SNP يمكن عرضها أو التذكير. مرة واحدة يتم تعيين مجموعات المكالمات مرضية، جزء بيانات كاملة من البرنامج يسرد التراكيب الوراثية لكل عينة على حدة في كل سيما SNP. خيار منتقي عمود فوق الجدول يمكن تبديل تنسيقات البيانات.

يمكن تصدير البيانات إما من خلال شريط الأدوات تحليل أو مباشرة من جدول بيانات كاملة عن تحليل متعمق.

الشكل 1
الشكل 1. نظرة عامة - بروتوكول الفحص Infinium.683/50683fig1highres.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 2
الشكل 2. غرفة كاملة HYB قاعدة وحصيرة، بالإضافة إلى الغطاء. [12] اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 3
الرقم 3 تحميل لBeadchip - الاستغناء العينة على المنافذ مدخل [12] اضغط هنا لمشاهدة أكبر الصورة.

الرقم 4
الشكل 4 إزالة Beadchip Coverseal - امسك ختم في الزاوية وقشر بلطف قطريا [12] اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 5
الرقم 5. الجمعية كاملة Beadchip التدفق من خلال - يتم فصل BeadChip من شريحة زجاجية مع فاصل وملزمة مع المشابك. > اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 6
الرقم 6. ناجحة BeadChip المسح الضوئي - أ) يتم فحصه وBeadChip مع كل من الليزر الأحمر والأخضر، ويعرض برنامج المسح على حد سواء في وقت واحد. سوف أقسام تمر كثافة QC تسليط الضوء الأخضر على شاشة العرض BeadChip إلى اليسار. سوف أقسام فشلها كثافة QC تسليط الضوء الأحمر على الشاشة BeadChip. B) وبمجرد اكتمال المسح الضوئي، سيقوم البرنامج تراكب يعرض الأحمر والأخضر. يتم عرض صورة مكبرة في. لون وكثافة كل حبة على حدة يشير إلى أليل الحالي. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

رقيقة الصفحة = "دائما"> الرقم 7
الرقم 7. SNP NORM-R مقابل الملامح الكتلة القواعد والمعايير THETA - A) A SNP صالحة مع ثلاث مجموعات متميزة تمثل AA، AB، وBB المورثات، باللون الأحمر والأرجواني، والأزرق B) A تتطلب تحرير SNP. تبقى الكتلة المتوسطة، التي ينبغي أن تكون متماثلة اللواقح AB، الامم المتحدة ويسمى. يسمى BB العنقودية عن طريق الخطأ AB. C) وأداء فقيرة SNP. ويمكن الحصول على أي المورثات من هذه المؤامرة كثافة، كما لا توجد مجموعات متميزة. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

Discussion

وقد استخدمت تطبيقات التنميط الجيني على نطاق واسع لفهم أفضل لآلية الوراثية الكامنة وراء العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان. اكتشاف أي متغير كبير من خلال تحليل الجينوم على نطاق الرابطة يمكن وضع علامة على المنطقة مرشحة لمزيد من الدراسة. بالإضافة إلى ذلك، بيانات التركيب الوراثي هو وسيلة جيدة لمراقبة الجودة في مشاريع التسلسل.

لتعظيم الإنتاجية العينة، لوحات عينة متعددة يمكن تضخيمها وتخزينها في، الدول معلق مجزأة بهم. قد تتسع ثمانية لوحات في يوم واحد، والجمع بين ساعة 24 الأولى من بروتوكول للدفعات متعددة، وتوفير ما يكفي من المواد ل~ 2-8 أيام من تجهيز رقاقة. إذا تم تخزينها لوحات تضخيمها من قبل، وإذا تم تهجين عينات جديدة لرقائق فورا بعد بدء المسح على المدى السابق، يمكن معالجة بشكل مستمر دون الحاجة إلى وقفة لإعداد عينة إضافية. لذلك، على الرغم من عينات سوف يستغرق ثلاثة أيام للخضوع الكاملالفحص، يمكن توليد البيانات اليومية. تتم معالجة رقائق Assuming24 كل يوم، أسبوع العمل 5 أيام يسمح لأكثر من 1،000 عينات من الحمض النووي ليتم تشغيلها على حبة رقاقة 12 عينة. إذا أي خطوة أو كاشف فشلت، ومع ذلك، دفعات متعددة قد تكون في خطر لضعف الأداء قبل أن يتم تطبيق أي تصحيح. أخطاء قد يفلت من إشعار حتى يتم فحص صفائف أو تحليلها، وبالتالي، إذا تم تكبير الإنتاجية، قد تلقى مئات العينات في مراحل مختلفة من البروتوكول بالفعل نفس المعاملة المعيبة عند الاكتشاف. كما الكواشف والبيانات المفقودة لا يمكن استردادها، يجب على المستخدم تزن ضد هذه المخاطر ضرورة لسير عمل متسارعة.

برنامج تحليل GenomeStudio هي الفرصة الأولى لقياس حقا نجاح عملية التنميط الجيني. إذا تتجمع نورم-R مقابل القواعد والمعايير كما ثيتا المؤامرات كثافة بشكل صحيح، يجب أن متوسط ​​سعر المكالمة (في المئة من إجمالي النيوكلوتايد كتبته بنجاح) من العينات تقترب من 99٪، على الرغم من هذه القيمة تتفاوت سليghtly اعتمادا على نوع صفيف. البيانات من أي عينة مع سعر المكالمة أقل من 85-90٪ ليست جديرة بالثقة، وينبغي التخلص منها. لأغراض مراقبة الجودة، وينبغي مقارنة النتائج إلى أي المورثات المعروفة سابقا كلما كان ذلك ممكنا. في حالة وجود أي من هذه البيانات، المتعمد عينة الازدواجية هو أداة مفيدة في التحقق من لوحة أو مجموعة المواضع. ينبغي أن توضع هذه الأزواج مكررة على رقائق منفصلة، ​​لوحات، دفعات، أو المشاريع؛ المورثات الخاصة بهم على فحص جيل. في حين تختلف القيود QC محددة وفقا لتفضيل المحقق، تستند القيود المشتركة SNP على نجاح الدعوة العينة، هاردي واينبرغ، التوازن، أو missingness بين الحالات والضوابط، في حين تستند القيود عينة مشتركة بشأن أسعار المكالمات، التناقضات المندلية، أو إحالات من كروموسوم X-تغاير الزيجوت إلى البيانات السريرية بين الجنسين [13].

إذا نشأ أي مشكلة، لوحة التحكم، وجدت في جناح التحليل، يمكن تقديمه إلىالشركة من أجل تحديد السبب. ويمكن لهذه الضوابط في كثير من الأحيان تضييق القضية الى المرجحة خطوة أو فشل كاشف. إذا تم العثور على أي تعدد الأشكال من الاهتمام من خلال تجربة التنميط الجيني Infinium، ينبغي أن يكون المؤامرات كثافتها المزدوج التحقق من وجود أخطاء في GenomeStudio المجموعات قبل أن يتم إجراء المزيد من البحوث.

هو على الأرجح بسبب خطأ معالجة الإنسان أو الحمض النووي مدخلات ذات نوعية رديئة تجربة التنميط الجيني Infinium فشلت. يجب أن تكون العينة الكمي صحيحة ودقيقة. للحصول على أفضل النتائج، وأضاف أي الكواشف إلى أي عينة أو يجب الاستغناء رقاقة في حجم حددها البروتوكول. ماصات يجب معايرة بشكل صحيح. يجب عدم تشغيل الكواشف بعد انتهاء وينبغي ألا أعيد تجميدها مرة أخرى إذابة مرة واحدة، باستثناء كاشف RA1. من أجل تقليل تلطيخ والإرشاد الأخطاء المحتملة، ينبغي إعداد خليط الفورماميد / EDTA جديدة كل شهر. يجب أن يتم تخزين جميع -20 ° C الكواشف في المجمدات دليل تذويب فقط. جميع معدات المختبرات المستخدمة في الحادي وaining، ينبغي أن تشطف التمديد، وغسل أجزاء من بروتوكول جيدا بالماء والمنظفات معتدل فور الترك. يجب أن تكون نقيت الخزانات الرطوبة في غرفة HYB مع فرشاة أنبوب اختبار ومعتدل المنظفات. يجب غسلها الشرائح الزجاجية مع التبييض 10٪، وفقا لتعليمات أدلة المستخدم الخاصة بهم، مرة واحدة في الأسبوع.

Disclosures

واضعو هذه المادة ليس لها المصالح المالية المتنافسة في الكشف عنها.

Acknowledgements

تم توفير التمويل لهذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة GM103456 P20، المعاهد الوطنية للصحة RC2 AR058959، والمعاهد الوطنية للصحة R56 AI063274

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumable or Equipment Manufacturer Part Number Minimum Required for 96 Samples
0.8 ml Deep Well Plate Thermo Scientific AB-0765 1
Plate Mats Thermo Scientific AB-0674 2
Reagent Basin Fisher Scientific 13-681-502 9
Heat-seal Sheets Thermo Scientific AB-0559 1
Flow-through Spacer Fisher Scientific NC9563984 6
Pipette tips - 200 μl Rainin GP-L200F 192
Pipette tips - 10 μl Rainin GP-L10F 16
Pipette tips - 1,000 μl Rainin GP-L1000F 16
DNA Suspension Buffer Teknova T0220 0.5 ml
0.1 N NaOH Fisher Scientific AC12419-0010 0.5 ml
Isopropanol (HPLC grade) Fisher Scientific A451 15 ml
Ethanol (200-proof) Sigma-Aldrich 459836 330 ml
Formamide (100%) Thomas Scientific C001K38 15 ml
EDTA (0.5 M) Amresco E177 0.2 ml
10 μl 8-channel Pipette Rainin L8-10XLS 1
200 μl 8-channel Pipette Rainin L8-200XLS 2
1,000 μl Single-channel Pipette Rainin L-1000XLS 1
Microplate Shaker VWR 13500-890 1
Refrigerated Microplate Centrifuge VWR BK369434 1
Hybridization Oven Illumina SE-901-1001 1
Hybex Microsample Incubator SciGene 1057-30-0 1
Hybex MIDI Heat Block Insert Illumina BD-60-601 1
Heat Sealer Thermo Scientific AB-0384 1
Hyb Chamber w/ Insert and Mat Illumina BD-60-402 2
Surgical Scissors Fisher Scientific 13-804-20 1
Flow Through Assembly Parts Illumina WG-10-202 8
Wash Rack and Dish Illumina BD-60-450 1
Genepaint Chamber Rack Tecan 760-800 1
Temperature Probe Illumina A1-99-109 1
Staining Rack and Dish Illumina WG-10-207 1
Self-Closing Tweezers Ted Pella, Inc 5374-NM 1
Vacuum Manifold Ted Pella, Inc 2240 1
iScan or HiScan Illumina - 1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shi, M. M. Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technologies. Clin. Chem. 47, (2), 164-172 (2001).
  2. Livak, K. J. SNP genotyping by the 5'-nuclease reaction. Methods Mol. Biol. 212, 129-148 (2003).
  3. Seeb, J. E., Pascal, C. E., Ramakrishnan, R., Seeb, L. W. SNP genotyping by the 5'-nuclease reaction: advances in high throughput genotyping with non-model organisms. Methods in Mol. Biol. 578, 277-292 (2009).
  4. Bayés, M., Gut, I. G. Overview of Genotyping. Molecular Analysis and Genome Discovery. ed, 2nd, John Wiley & Sons, Ltd. Chichester, UK. 1-23 (2011).
  5. Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. Single-Nucleotide Polymorphisms for High-Throughput Genotyping of Anopheles arabiensis in East and Southern Africa. J. Med. Entomol. 49, (2), 307-315 (2012).
  6. Liu, Z. SNP Genotyping Platforms. Next generation sequencing and whole genome selection in aquaculture. Wiley-Blackwell. 123-132 (2011).
  7. Shen, R., Fan, J. B., et al. High-throughput SNP genotyping on universal bead arrays. Mutat. Res./Fundam and Mol. Mech. of Mutagenesis. 573, (1), 70-82 (2005).
  8. Ragoussis, J. Genotyping technologies for all. Drug Discov. Today: Technol. 3, (2), 115-122 (2006).
  9. Wu, C. C., Shete, S., Jo, E. J., et al. Whole-Genome Detection of Disease-Associated Deletions or Excess Homozygosity in a Case-Control Study of Rheumatoid Arthritis. Hum. Mol. Genet. (2012).
  10. Green, E. K., Hamshere, M., Forty, L., et al. Replication of bipolar disorder susceptibility alleles and identification of two novel genome-wide significant associations in a new bipolar disorder case-control sample. Mol. Psychiatry. (2012).
  11. Shete, S., Hosking, F. J., Robertson, L. B., et al. Genome-wide association study identifies five susceptibility loci for glioma. Nat. Genet. 41, (8), 899-904 (2009).
  12. Inc Illumina. Infinium HD Ultra User Guide 11328087 RevB-1. 15-101 (2009).
  13. Turner, S., Armstrong, L. orenL., Yuki Bradford,, et al. Quality Control Procedures for Genome Wide Association Studies. Curr Protoc Hum Genet. 1-19 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics