In-vivo-Imaging-Methode zu unterscheiden, akuten und chronischen Entzündungen

Immunology and Infection

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Summary

Wir beschreiben ein nicht-invasives Verfahren zur Unterscheidung entzündlichen Phasen. Systemische Lieferung von Luminol zeigt Bereiche der akuten Entzündung abhängig MPO-Aktivität in neutrophilen Granulozyten. Im Gegensatz dazu ermöglicht das Einstreuen Lucigenin zur Visualisierung der chronischen Entzündung abhängig Phox Aktivität in Makrophagen.

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Tseng, J. C., Kung, A. L. In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation. J. Vis. Exp. (78), e50690, doi:10.3791/50690 (2013).

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Abstract

Die Entzündung ist ein grundlegender Aspekt der vielen menschlichen Krankheiten. In diesem Video-Bericht zeigen wir, nicht-invasive bildgebende Verfahren, die Biolumineszenz akuten und chronischen Entzündungen in Maus-Modellen zu unterscheiden. Mit Gewebeschädigung oder Erreger Invasion, sind Neutrophile die erste Linie der Verteidigung, spielen eine wichtige Rolle bei der Vermittlung der akuten Entzündungsreaktion. Da die entzündliche Reaktion fortschreitet, zirkulierenden Monocyten allmählich in der Stelle der Verletzung zu migrieren und differenzieren zu reifen Makrophagen, die chronische Entzündung zu vermitteln und zu fördern Gewebereparatur durch Entfernen Gewebedebris und Herstellung anti-inflammatorische Zytokine. Die intraperitoneale Injektion von Luminol (5-Amino-2 ,3-dihydro-1 ,4-phthalazindion, Natriumsalz) ermöglicht den Nachweis einer akuten Entzündung weitgehend von Gewebe infiltrierenden Neutrophilen vermittelte. Luminol reagiert spezifisch mit dem Superoxid innerhalb der phagosomes von Neutrophilen seit Biolumineszenz Ergebnisse aus einer Myeloperoxidase (M erzeugtPO) vermittelte Reaktion. Lucigenin (bis-N-methylacridinium Nitrat) reagiert auch mit Superoxid um Biolumineszenz zu erzeugen. Allerdings ist Lucigenin Biolumineszenz unabhängig von MPO und es verlässt sich einzig auf Phagozyten NADPH-Oxidase (Phox) in Makrophagen während der chronischen Entzündung. Zusammen ermöglichen Luminol und Lucigenin nichtinvasive Visualisierung und Längs Bewertung verschiedener Populationen Phagozyten in akuten und chronischen entzündlichen Phasen. Angesichts der wichtigen Rolle der Entzündung in einer Vielzahl von menschlichen Krankheiten, glauben wir diese nicht-invasiven bildgebenden Verfahren können die differentiellen Untersuchung Rollen von Neutrophilen und Makrophagen in einer Vielzahl von pathologischen Zuständen.

Introduction

Die Entzündung ist eine stark regulierte biologische Reaktion in einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich mikrobieller Infektion beteiligt 1, 2 Wundheilung, Diabetes 3, 4 Krebs, Herz-Kreislauf 5, 6 neurodegenerativen und Autoimmunerkrankungen 7. Entzündung im Gewebe erfordert eine sachgerechte Koordinierung der verschiedenen Immunzellen, um Erreger-Clearance, die Reparatur von Gewebe und Krankheiten Auflösung zu erreichen. Neutrophile und Makrophagen sind wichtige Immunmediatoren der Entzündung im Gewebe. In der akuten Phase der Entzündung, Neutrophile sind die ersten Responder auf verschiedene schädliche Reize und Gewebeschäden 8. Die Neutrophilen schnell extravasieren von Umlauf zu der Stelle der Verletzung, wo die Zellen eindringende Mikroben durch Loslassen antimikrobielle Granulat und Phagozytose inaktivieren. Während Phagozytose, verschlingen eindringende Mikroben Neutrophilen in phagosomes, in dem die Zellen produzieren hohe Superoxidide (O 2 · -). Phagosomes Superoxid ist die primäre Quelle von vielen nachgelagerten reaktive Sauerstoffspezies (ROS). Beispielsweise können Superoxid, Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) durch spontane Dismutation oder Superoxid-Dismutase (SOD) 9, 10 disproportionierten werden. In Neutrophilen, Myeloperoxidase (MPO) wandelt ferner Wasserstoffperoxid zu antimikrobielle hypochlorige Säure (HOCl) 11. Da die entzündlichen Reaktionen weiter, zirkulierenden Monozyten allmählich in den Ort der Verletzung zu migrieren und differenzieren zu reifen Makrophagen 2, dessen phagocytic Funktion zur Beseitigung von inaktivierten Krankheitserregern und Zelltrümmer. Darüber hinaus als wichtiger Regulator in der späteren Phase der Entzündung, fördert die Makrophagen die Reparatur von Gewebe durch die Herstellung anti-inflammatorischen Zytokinen 12 und durch die Generierung von extrazellulären ROS auf einem niedrigeren Niveau 9. Die ROS an diesem späteren Zeitpunkt generiert regulieren Gewebeumbau, Gefäßneubildung und reepitheliasierung 13.

Phagocyte NADPH-Oxidase (Phox) ist die primäre Quelle der Superoxid-Produktion in beiden Neutrophilen und Makrophagen 9. Phox ist ein Multi-Untereinheiten-Komplex, dessen Montage dicht 9 geregelt. Das Holoenzym enthält mehrere cytosolischen regulatorischen Untereinheiten (p67 phox, p47 phox, p40 phox und RAC) und eine Membran-gebundene Cytochrom b Heterodimer 558 (aus der Untereinheit CYBA und CYBB). Cytochrom b 558 ist die Reaktion Kern, in dem die CYBB Untereinheit (auch als p91 phox und NOX2 bekannt) führt die primäre Redox-Kettenreaktion 9. Interessanterweise sind die Montage zwischen verschiedenen Standorten Neutrophilen und Makrophagen. In ruhenden neutrophilen Granulozyten Cytochrom b 558 hauptsächlich in der Membran des intrazellulären Speichergranula 14. Während Phagozytose, montieren die Neutrophilen holoenzymes bei phagosomes 9, wo ein hohes Maß an MPO-Aktivität sind ebenfalls vorhanden. Die Neutrophilen Phox schnell verbraucht Sauerstoff und übt seine Macht durch mikrobizider ROS-Produktion, bezeichnet ein Phänomen, das respiratory burst 11. Im Gegensatz dazu haben Makrophagen eine niedrigere MPO Expression und Cytochrom b 558 hauptsächlich in der Plasmamembran 15, 16 vorhanden. So Neutrophilen hohe Mengen von Superoxid für eine antimikrobielle Aktivität, während Makrophagen weniger Superoxid für regulatorische Funktionen 15 zu erzeugen.

Seit Entzündung ist ein kompliziertes Verfahren in vivo, würde nicht-invasiven bildgebenden Verfahren spezifisch für verschiedene Phasen der Entzündung und damit quantitative Einschätzung der Längs-Krankheit Modellen. Mit mechanistische Studien haben wir zuvor die Verwendung von zwei chemilumineszierende Mittel, Luminol (5-Amino-2 ,3-dihydro-1 ,4-phthalazindion) und Lucigenin (bis-N-methylacridinium Nitrat) nachgewiesen, Zur nicht-invasiven Darstellung von akuten und späten (chronischen) Stadien der Entzündung bzw. 17. Luminol ermöglicht die Visualisierung der neutrophilen MPO-Aktivität in der akuten Phase der Entzündung 18-20, während Lucigenin Biolumineszenz kann verwendet werden, um Makrophagen-Aktivität in Verbindung mit der späten Phase oder chronische Entzündung 17 beurteilen. In diesem Manuskript, verwendeten wir zwei experimentelle Entzündung Modelle (sc sc PMA und LPS), um diese bildgebenden Verfahren zu demonstrieren.

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Protocol

Hinweis: Alle Tierversuche wurden im Rahmen genehmigter institutionelle Protokolle und Tierpflege Leitlinien durchgeführt.

1. Reagenzien und Lösungen

  1. PMA Lösung für sc Inokulation: Bereiten Sie eine Stammlösung von Phorbol 12-13-Acetat myristate (PMA) bei 5 mg / ml in DMSO. Bewahren Sie die Stammlösung bei -20 ° C. Vor Impfung, tauen die Stammlösung und mit Wasser auf 1 mg / ml PMA in PBS.
  2. LPS-Lösung für sc Impfung: Lösen Lipopolysaccharid (LPS aus Salmonella enterica Serotyp Enteritidis) in sterilem PBS auf 1 mg / ml vor sc Impfung.
  3. Luminol-Lösung für die akute Phase Imaging: Man löst Luminol (5-Amino-2 ,3-dihydro-1 ,4-phthalazindion, Natriumsalz) in steriler physiologischer Kochsalzlösung (0,9% NaCl) mit 10 mg / ml. Die Lösung kann bei -20 ° C vor der Verwendung gelagert werden.
  4. Lucigenin Lösung für chronische Phase Bildgebung: Lösen Lucigenin (Bis-N-methylacridinium Nitrat) in sterile Kochsalzlösungbei 2,5 mg / ml. Die Lösung kann bei -20 ° C vor der Verwendung gelagert werden.

2. Subkutane PMA Entzündung Modell

  1. Anesthetize NCr Nacktmäusen in einer Induktion Kammer mit 1-2% Isofluran. Bestätigen Vollnarkose durch Verlust der Bewegung und eine konstante Atemfrequenz. Übertragen Sie ein Tier einem Nasenkegel mit Isofluran-Gasgemisch zugeführt und halten das Tier unter Narkose.
  2. Verwenden Sie eine Isopropylalkohol abwischen zu reinigen und desinfizieren Sie die Injektionsstelle auf der linken Flanke.
  3. Mit einer sterilen Technik injizieren 50 ul der PMA Impflösung (enthaltend 50 ug PMA) in den subkutanen Raum auf der linken Flanke. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus der Injektionsstelle unter Verwendung eines Isopropylalkohol Pad. Vermeiden Sie den Gebrauch von Analgetika wie es Entzündungsreaktionen beeinflussen.
  4. Bewegen Sie das Tier wieder auf das Gehäuse Käfig und beobachten genau die Erholung von der Narkose. Um in der Genesung zu unterstützen, verwenden Sie ein Heizkissen, um das Tier warm.

3. Subkutane LPS Entzündung Modell

  1. Anesthetize C57BL/6J-Mäusen mit 1-2% Isofluran in einer Induktion Kammer. Nach Gründung Vollnarkose, ein Tier zu übertragen, um eine Nase Kegel mit Isofluran-Gas geliefert und halten das Tier unter Narkose.
  2. Verwenden Sie eine Isopropylalkohol abwischen, um die Injektionsstelle auf der linken Fußballen reinigen.
  3. Mit einer sterilen Technik injizieren 50 ul der LPS Impflösung (enthaltend 50 ug LPS) in der linken Fußsohle. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus der Injektionsstelle unter Verwendung eines Isopropylalkohol Pad. Vermeiden Sie den Gebrauch von Analgetika wie es Entzündungsreaktionen beeinflussen.
  4. Bewegen Sie das Tier wieder auf das Gehäuse Käfig und beobachten genau die Erholung von der Narkose. Verwenden Sie ein Heizkissen, das Tier warm während Erholung zu halten.

4. Biolumineszenz Imaging of Inflammation

  1. Anesthetize das Tier in einer Induktion Kammer mit 1-2% Isofluran-Gasgemisch. Confirm Vollnarkose durch Verlust der Bewegung und eine konstante Atemfrequenz.
  2. Während sich das Tier noch in der Anästhesie, intraperitoneal (ip) injiziert die Luminol-Lösung (10 mg / ml) oder die Lucigenin-Lösung (2,5 mg / ml) für die akute oder chronische Entzündung Bildgebung sind. Die letzte Dosis beträgt 100 mg / kg für Luminol und 25 mg / kg für Lucigenin. Eine niedrigere Dosis von Lucigenin (10-15 mg / kg) kann verwendet werden, um mögliche Toxizität für einige Maus-Stämme zu vermeiden. Anzeichen von Toxizität sind Kurzatmigkeit und Atemnot. Die C57BL/6J Stamm hat eine geringere Lucigenin Verträglichkeit als die NCr nackte Stamm.
  3. Übertragen Sie das Tier in der Bildgebung Kammer eines Biolumineszenz-Bildgebung System.
  4. Führen sequentielle Biolumineszenz-Bildgebung bei 1 min Intervallen. Jeder Schritt wird von bildgebenden 1 min Aufnahmezeit besteht, f / stop = 1, Binning = 16 und 0 Sekunden Verzögerung.
  5. Innerhalb der Bildaufnahme-Panel, um sequentielle mehrstufigen Bildgebung zu ermöglichen, auf der Sequenz klicken Einstellung buTton. Für ausreichenden Bildgebung Schritte in der Akquisition Profil auf maximale Lumineszenz-Ausgang (in der Regel 15 einminütigen Schritten genügt) zu bestimmen. Der 15-min Abbildungsabschnitt lässt genügend Zeit für Saugfähigkeit des Untergrundes und systemischen Kreislauf.
  6. Nehmen Sie das Tier von der Bildgebung Kammer und verschieben Sie sie in das Gehäuse zurückschieben Käfig. Um in der Genesung zu unterstützen, verwenden Sie ein Heizkissen, um das Tier warm.
  7. Während nach dem Erwerb Analyse, verwenden Sie den Imaging-Software-Paket, um Peak insgesamt Biolumineszenz-Signal durch standardisierte regions of interest (ROI) zu berechnen. Die Bilder liegen als Ausstrahlung in Photonen / sec / cm 2 / sr mit minimalen und maximalen Grenzwert angegeben. Quantitative Daten werden als gesamte Fluß in Photonen pro Sekunde und ROI vorgestellt.

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Representative Results

Wir führten Längsrichtung Biolumineszenzimaging um akute und chronische Entzündung in experimentellen Modellen Entzündung zu beurteilen. Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) ist ein potenter Proteinkinase C (PKC)-Agonisten, die für Phox Superoxidanionproduktion aktiviert und löst intensive akute Entzündungsreaktionen 21. SC Injektion von 50 mg PMA in NCr nackten Mäusen verursachte rasche Hautreizungen und akute Entzündung an der Injektionsstelle 18, 22, 23. Wir führten täglich Bildgebung für 4 Tage mit den ersten Bildern schon nach 3 Stunden nach PMA Injektion erhalten. Abbildung 1 gezeigt, die Längs-Biolumineszenz-Bildgebung mit Luminol und Lucigenin als Substrate. Am frühen Stadien der Entzündung (3 Std.), beobachteten wir signifikante Luminol Biolumineszenz anzeigt hohe Neutrophilen MPO-Aktivität an den Standorten der PMA Injektion. Keine signifikante Lucigenin Biolumineszenz wurde in diesen frühen Stadien der Entzündung beobachtet. AbTag 2, beobachteten wir Verkrustung und damit reduziert Lumineszenz-Intensität. Als Wundheilung zeigte (Abbildung 1A, Tag 3 und 4), beobachteten wir stetige Zunahme Lucigenin Biolumineszenz (Abbildung 1B). Diese Ergebnisse zeigen, dass Luminol Biolumineszenz mit der akuten Entzündung assoziiert ist, während Lucigenin Biolumineszenz ist eng mit Gewebereparatur in den späten Phasen der Entzündung.

Unabhängig davon injiziert wir sc 50 ug von Lipopolysaccharid (LPS) in den Fußballen von Wildtyp-C57BL/6J-Mäusen und durchgeführt Längs-Biolumineszenz-Bildgebung für bis zu 10 Tage (Abbildung 2A). LPS ist ein Bestandteil der Membran Gram-negativer Bakterien. SC Inokulation von LPS ist auszulösen vermag starke Entzündungsreaktionen durch TLR4-Rezeptor-Aktivierung und anschließende entzündungsfördernde Chemokin / Zytokin-Produktion 24. Im Gegensatz zu PMA, die direkt aktiviert Phox für Superoxid production, LPS benötigt eine längere Zeit, um vollständig zu aktivieren Gewebe infiltrieren Phagozyten 18. Wie Neutrophilen die frühen Responder Mikrobe Infektion sind, beobachteten wir erhöhte Luminol Biolumineszenz während der ersten 4 Tage der akuten Entzündung, die nach Tag 5 (2B) zurückgegangen. Im Gegensatz dazu Lucigenin Biolumineszenz allmählich in den späten und chronischen Phase der Entzündung (2B Tage 5-10) erhöht.

Zusammen zeigen diese Ergebnisse, die Fähigkeit, Differential Substratspezifität verwenden, um akute und chronische entzündliche Phasen unterscheiden. Wichtig ist, dass die Bildgebung durch den endogenen enzymatischen Aktivitäten des Immunsystems Zellen vermittelt, und es besteht keine Notwendigkeit für die ektopische Expression von Reportern.

Abbildung 1
1. In vivo Längsrichtung Biolumineszenzimaging von akuten und späten Phasen der Entzündung. strong> (A) Wir induziert lokale Entzündung im Gewebe durch sc Injektion von 50 ug PMA und täglich durchgeführt Luminol (100 mg / kg, ip) und Lucigenin (25 mg / kg, ip) Biolumineszenz-Bildgebung ab 3 Stunden nach PMA Injektion. Keine signifikante Hintergrund auto-Lumineszenz wurde an den Standorten der Entzündung ohne chemilumineszierende Mittel beobachtet. (B) Quantitative Darstellung von Luminol und Lucigenin Biolumineszenz an der Injektionsstelle. In der akuten Phase der Entzündung, dominiert Luminol Signale des Biolumineszenz-Ausgang (3 h). In den späteren Stadien der Entzündung hatten die Injektionsstellen höher Lucigenin Biolumineszenz gegenüber Luminol (Tag 4). Fehlerbalken stellen die Standardabweichungen der Biolumineszenz-Messungen an jedem Abbildungszeitpunkt. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

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Abbildung 2. (A) 50 ug LPS wurde sc in die Fußballen von C57BL/6J Mäusen injiziert. Longitudinal Biolumineszenz-Bildgebung mit Luminol und Lucigenin wurden täglich für 10 Tage durchgeführt. (B) Quantitative Darstellung von Luminol und Lucigenin Biolumineszenz bei LPS Injektionsstellen. Luminol Biolumineszenz erhöht während der ersten 4 Tage der akuten Entzündung. Doch in den späten / chronischen Phasen der Entzündung, Luminol Signale rapide zurückgegangen und Lucigenin Biolumineszenz schrittweise erhöht. Fehlerbalken stellen die Standardabweichungen der Biolumineszenz-Messungen an jedem Abbildungszeitpunkt. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

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Discussion

In diesem Bericht zeigen wir, eine Biolumineszenz Verfahren zur nicht-invasive Bildgebung von Entzündungen in lebenden Tieren. Unter Ausnutzung der beiden Leuchtstoffe Substrate, Luminol und Lucigenin, kann das Verfahren unterscheiden verschiedene Phasen der Entzündung. Luminol Biolumineszenz mit neutrophilen Granulozyten in der akuten Phase der Entzündung assoziiert, während Lucigenin Biolumineszenz durch Makrophagen in der chronischen Phase vermittelt wird. Relativ kleine (MG = 177,16 g / mol) und elektrisch ungeladenen, Luminol leicht durchdringen Plasma und phagosomalen Membran 25-29. Darüber hinaus ist Luminol Lumineszenz spezifisch für die intrazelluläre MPO-Aktivität der neutrophilen Granulozyten 9. Auf der anderen Seite ist Lucigenin meist undurchlässigen Membran aufgrund seiner Größe (MW = 510.5 g / mol) und zwei positiven Ladungen 25, 27-30.

Neutrophile und Makrophagen zusammenbauen Phox Holoenzyms an verschiedenen subzellulären Orten. Obwohl beide Reagenzienabhängen Phox zu Superoxidanion (O 2 · -) liefern, ermöglicht die Disparität in Zellpermeabilität und MPO-Abhängigkeit der Substrate, um entzündliche Erkrankung Fresszellen in Modelle zu unterscheiden. Neutrophile exprimieren die meisten der Phox in die Membran des intrazellulären Vesikeln (phagosomes) 14, wo hohe MPO sind ebenfalls vorhanden. Als Ergebnis wird Luminol Biolumineszenz spezifisch mit aktivierten Neutrophilen während der akuten Entzündung. Im Gegensatz dazu montieren Makrophagen Phox in der Plasmamembran als sie infiltrieren und reifen bei chronischer Entzündung 15. Undurchlässige Lucigenin direkt mit der extrazellulären Superoxid durch Makrophagen erzeugt, um chronische entzündliche Biolumineszenz erzeugen interagieren.

Die Entzündung ist ein komplizierter Prozess, der in vivo sachgerechte Koordinierung der vielen verschiedenen Zelltypen und extrazellulären Signalmolekülen erfordert. In diesem Video-Bericht zeigen wir, dassynergistische Verwendung von sowohl Luminol und Lucigenin, um akute und späte (chronische) Entzündung Phase in Tiermodellen zu überwachen. Da diese Substrate kommerziell erhältlich und relativ kostengünstig sind, glauben wir, diese relativ einfache und robuste bildgebendes Verfahren kann leicht zu in-vivo-Anwendungen in vielen Bereichen Krankheit übersetzt. Zu beachten ist, verglichen mit PET, MRT-und Nah-Infrarot (NIR) Fluoreszenz-Imaging-Techniken, ist die Chemilumineszenz Verfahren nicht ideal für tiefe Gewebe Bildgebung aufgrund blaue Emission der Substrate 'Spektren. Um Gewebepenetration zu verbessern, wurde kürzlich gezeigt, dass die blaue Chemilumineszenzemission die Zusammenarbeit verwalteten Nanopartikeln für NIR-Emission 31 übertragen werden können. Weitere Änderung ihrer chemischen Strukturen potenziell verbessern ihre Quanteneffizienz für stärkere Lichtleistung und verfeinern ihre Emissionsspektren für tiefere Eindringen in das Gewebe.

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Disclosures

Die Autoren erklären, keinen Interessenkonflikt in dieser Studie.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der Nancy Lurie Marks Foundation unterstützt. Wir danken Dr. Nancy E. Kohl für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Wir danken K. Kin Wong für seine Unterstützung bei der Vorbereitung dieses Video Bericht.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO P8139  
Lipopolysaccharide from Salmonella enterica serotype enteritidis Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO L2012  
Luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt) Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO A4685  
Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate) Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO M8010  
IVIS Spectrum imaging system with Living Imaging 4.2 software package Caliper LS/Perkin Elmer, Hopkinton, MA  

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References

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Comments

1 Comment

  1. Hi there,

    I am Hussain from Germany and working on similar research topic. Please give me a chance to watch this video, at least for one time.
    Sincerely
    Hussain

    Reply
    Posted by: Hussain A.
    September 11, 2013 - 9:07 AM

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