Procédures d'identification des prions infectieux Après passage dans le système digestif d'une espèce aviaire

Published 11/06/2013
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Immunology and Infection

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Summary

Les charognards ont le potentiel de translocation infectieuses transmissibles prions de l'encéphalopathie spongiforme dans leurs excréments dans les zones exemptes de la maladie. Nous détail les méthodes utilisées pour déterminer si prions de la tremblante adaptée à la souris restent infectieux après le passage à travers le tractus digestif des corneilles d'Amérique (Corvus brachyrhynchos), une consommation courante des animaux morts.

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Fischer, J. W., Nichols, T. A., Phillips, G. E., VerCauteren, K. C. Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species. J. Vis. Exp. (81), e50853, doi:10.3791/50853 (2013).

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Abstract

Prion infectieux (PrP Res) matériau est probablement la cause d'accidents mortels, neurodégénérative encéphalopathie spongiforme transmissible (EST) maladies 1. Transmission de maladies de l'EST, telles que la maladie du dépérissement chronique (MDC), est présumé être d'un animal à 2,3 ainsi que de sources environnementales 4-6. Charognards et carnivores ont un potentiel de translocation matériau PrP Res par la consommation et l'excrétion de charogne CWD contaminés. Des travaux récents ont documenté le passage du matériau PrP Res par le système digestif des corneilles d'Amérique (Corvus brachyrhynchos), un trésor commun nord-américain 7.

Nous décrivons les procédures utilisées pour documenter le passage du matériau PrP Res par des corneilles d'Amérique. Crows ont été gavés avec RML-souche de tremblante adaptée à la souris et leurs excréments ont été recueillis 4 h après gavage. excréments de corneille ont ensuite été regroupées et injectées par voie intrapéritonéale àSouris C57BL / 6. Les souris ont été suivies quotidiennement jusqu'à ce qu'ils ont exprimé des signes cliniques de la tremblante de la souris et ont ensuite été euthanasiés. Souris asymptomatiques ont été suivis pendant 365 jours après inoculation. Western blot a été effectuée pour confirmer le statut de la maladie. Les résultats ont révélé que les prions infectieux restent après avoir traversé le système digestif des corbeaux et sont présents dans les fèces, ce qui provoque la maladie chez des souris d'essai.

Introduction

Les encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST) sont des maladies infectieuses mortelles neurodégénératives qui affectent la faune, les animaux domestiques et les humains. L'agent infectieux des EST de maladies semble être mal repliées ou isoformes PrP pathogènes (RES) des protéines prions 1. Les EST animales comprennent la maladie du dépérissement chronique (MDC) dans le cerf mulet (Odocoileus hemionus), le cerf de Virginie (Odocoileus virginianus), le wapiti (Cervus elaphus), et de l'orignal (Alces alces); la tremblante chez les ovins et les caprins; l'encéphalopathie spongiforme bovine ( ESB) chez les bovins domestiques; transmissible encéphalopathie du vison en vison d'élevage, l'encéphalopathie spongiforme féline chez les chats; exotique ongulés encéphalopathie spongiforme dans le zoo exotique rumine de la famille des bovidés et l'encéphalopathie spongiforme bovine chez les primates non humains 8. La maladie EST humaine unique, variant de la maladie de Creutzfeldt-Jakob, est rare et la pensée d'être acquis par la consommation de la PrP Res-contaminalimentaire ATED 9. De même, l'ESB peut infecter les humains si bœuf contaminé est consommé 10. De toutes les maladies de l'EST, tremblante et la MDC sont les deux seuls les épidémies et les sources d'infection autonomes sont présumés être d'un animal à 2,3,11 ainsi que de sources environnementales 4-6. La recherche suggère que la plupart des maladies de l'EST nécessitent des périodes d'incubation prolongées notables d'événements d'exposition naturelles de matières PrP Res à la manifestation de signes cliniques 2-4,6,8 et les barrières d'espèces apparentes minimiser, mais n'éliminent pas le risque de transmission inter-espèces 12-14 .

Identification des mécanismes de propagation des prions infectieux (PrP Res) de matériau est extrêmement important pour répondre à des questions sur la façon dont les EST se déplacent à travers le paysage. Des études expérimentales ont suggéré que les insectes 15,16, la volaille et les porcs 17, et la corneille d'Amérique (Corvus brachyrhynchos) 7,18 sont des porteurs passifs ou disperseurs de matériel PrP Res. Passage de matériel PrP Res par le système digestif des corneilles a été récemment documentée, ce qui démontre le rôle qu'ils peuvent jouer dans la dispersion des maladies de l'EST 7. Ces résultats rendent plausible que les corneilles, un trésor, pourraient rencontrer, consomment, et le transport du matériel infectieux par les fèces dépôt, dans les zones exemptes de la maladie.

Les procédures que nous démontrons ici ont été utilisés pour documenter le passage du matériau PrP Res par le système de digestion des corbeaux et facilitera grandement l'application de ces méthodes à un autre fixateur et modèles carnivore espèces spécifiques dans la recherche de futurs correspondants. Dans cette étude, les méthodes classiques ont été utilisés pour étudier des moyens non conventionnels de la traite matériau PrP Res, qui pourrait contribuer à la propagation et l'impact global de la matière PrP Res.

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Protocol

Notre protocole est adapté de celui que nous avons déjà publié 7. Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'United States Department of Agriculture (USDA), Animal et Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services (WS), Centre national de la recherche faunique (CNRF).

Une. Corneille gavage

  1. Estimer le temps de passage de la «matière cérébrale pseudo 'à travers le tube digestif des corneilles d'Amérique.
    1. Mélangez 5 ml de cuit et des œufs brouillés ensemble avec un colorant bleu et gavage 1 vol en utilisant un 2 en aiguille de gavage (Figure 1).
    2. Vérifiez vol toutes les 30 min jusqu'à ce que les matières fécales bleu / vert teinté ne sont plus excrétée.
  2. Obtenir C57BL / 6 cerveaux de souris RML (souche Chandler) infectés non infectées et malades en phase terminale.
  3. Générer un 20% en poids / volume normal et infecté souris homogénat de cerveau dans un homogénéisateur balle de mélangeur avec 1xtampon phosphate salin (PBS) et des perles de verre, puis centrifuger à 3000 g pendant 1 min pour éliminer plus grand de particules. Retirer le surnageant et diluer avec un volume égal de PBS 1x à générer un poids / volume à 10% dans du PBS stérile. Congeler à -80 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
  4. 17 heures avant de gavage enlever les aliments, mais pas l'eau, des stylos d'oiseau.
  5. Allouer au hasard corbeaux à des groupes de traitement et de gavage par voie orale chaque vol avec 5 ml d'homogénat de cerveau de souris normales ou infecté en utilisant un 2 en aiguille de gavage.
  6. Transfert chante dans des cages individuelles et de collecter et mutualiser toutes les matières fécales dans chaque cage pour 4 heures après gavage (Figure 2).
  7. Homogénéiser les fèces regroupés pour chaque vol dans un homogénéisateur balle de mélangeur avec des perles de verre jusqu'à obtenir une texture uniforme. * Excréments Corneille sont pour la plupart de liquide et peuvent être mélangées facilement.
  8. Pour chaque vol, diluer 500 pi d'homogénat fécale dans 9,5 ml 1x PBS pour un volume total de 10 ml.
  9. Centrifuger le homogena fécalete pendant 15 min à 1400 x g et le surnageant extrait.
  10. Pour réduire au minimum le risque d'une infection microbienne secondaire, traiter surnageant avec 1 ul de 100 unités / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine (Invitrogen, NY) par 100 ul d'homogénat puis placer sous une lumière UV à température ambiante pendant 20 minutes pour réduire risque de contamination virale et bactérienne. Après l'exposition aux UV, les échantillons soniquer dans un appareil à ultrasons Mp 3000 à la mise en 70 pour 30 secondes de perturber la membrane de tous les microbes restants.

2. Souris inoculation

  1. Répartir au hasard les souris à des groupes de traitement suivants (Tableau 1):
    1. Groupe 1 - souris positifs du traitement par voie intrapéritonéale inoculés (IP) avec 1 ml d'homogénat fécale de corbeaux gavage par voie orale avec 5ml infectés cerveaux de souris.
    2. Groupe 2 - Négatif souris inoculées de traitement IP avec 1 ml d'homogénat fécale de corbeaux gavage par voie orale avec des cerveaux de souris normales 5ml.
    3. Diluer infected et normale homogénat de cerveau de souris pour les groupes 3 et 4 à 1:100 p / v dans du PBS 1x.
    4. Groupe 3 - souris témoins positifs IP inoculé avec 1 ml de la souris infectée-homogénat de cerveau.
    5. Groupe 4 - Négatif souris témoins inoculées ip avec 1 ml de la normale homogénat de cerveau de souris.
Groupe Traitement Nombre d'animaux
Groupe 1 Tremblante + Corneille matières fécales 100
Groupe 2 Tremblante - Corneille matières fécales 25
Groupe 3 Cerveau tremblante + souris 10
Groupe 4 Tremblante - cerveau de souris 5

. Tableau 1 État de la tremblante inoculum (+ positif, négatif -) et le nombre d'animaux utilisés 7.

  1. Intrapéritonéale inoculer la souris:
    1. Scruff souris par dorsale cou fourrure avec le pouce et l'index et faire tourner doucement pour exposer la face ventrale.
    2. Élever extrémité postérieure de la souris si la tête est légèrement inférieure.
    3. Insérez l'aiguille 25 G 1 cm à travers la peau, 1 cm de la ligne médiane latérale, et 1-2 cm en avant de l'articulation sacro-iliaque en utilisant une seringue sans aiguille de verrouillage.
    4. Injecter 1 ml inoculer lentement dans la cavité du corps de la souris.

3. Surveillance de souris

  1. Surveillance de souris quotidienne jusqu'à ce qu'ils expriment des signes cliniques de la tremblante de la souris. Les signes cliniques peuvent inclure: cyphose, l'ataxie, la queue raide, absence de toilettage, une émaciation, et la léthargie.
  2. Score des souris pour chacun des signes cliniques 6 lorsque les signes visibles sont évidents, où 0 = aucun visible, 1 = modérée, et 2 = sévère.
  3. Euthanasier les souris quand scores totaux quotidiens pour chaque signe atteindre ≥ 8 pour 1 jour, ≥ 6 en continu pendant 3 jours, ou à 365 jours après l'inoculation (dpi).
  4. Cerveaux récolte euthan immédiatement aprèsasie et conserver à -70 ° C.
  5. Pour confirmer un diagnostic de la tremblante, digérer des échantillons de cerveau avec 3 pi d'un 50 pg / ml de solution de protéinase K (PK) dilué comme suit: 3.1. PK ul, 12,5 ul d'EDTA 500 mM, pH 8, 109,39 ul de 1 x PBS pendant 30 min à 45 ° C, puis inactiver la PK en ajoutant 8 pi de tampon de chargement et l'incubation des échantillons à 95 ° C pendant 5 min. Charger les échantillons sur un gel SDS-PAGE à 12%, électrophorèse et transfert sur membrane (PVDF) Immobilon bloc et avec 5% de lait écrémé dans 0,2% de Tween 20 dans du PBS pendant 1 heure à température ambiante. Ensuite, la sonde avec un anticorps monoclonal anti-PrP BAR224 conjugué à la peroxydase de raifort, dilué dans Superblock, pendant 1 h à température ambiante. Rincer la membrane pendant 1 h avec du PBS-Tween 20 0,2%. Pour visualiser, incuber Western blot 5 min avec un substrat chimioluminescent et une image sur un système de documentation de gel G-box.

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Representative Results

Les procédures utilisées démontrent que le système digestif des corbeaux n'élimine pas PrP Res infectivité 4 h après gavage oral de la tremblante homogénat de cerveau 7. Tous les vingt corbeaux qui ont été gavés avec du matériel PrP Res été transmises matériau PrP Res par les fèces de souris. Souris malades ont été identifiés par la manifestation de signes cliniques de la tremblante à la souris et la confirmation de la maladie a été complétée par une analyse Western blot.

Etude de la durée de rétention de matière ingérée par les corbeaux révélé le temps de passage dans le tube digestif d'un vol d'être gavées 4 heures, sur la base de la présence du colorant dans les matières fécales (figure 1). Toutes les matières fécales ont été prélevés avec des pipettes jetables et regroupés pour chaque vol (figure 2). Toxicité aiguë à partir des fèces d'oiseau non traités s'est produite lors de surnageant fécale brute a été injecté à des souris IP de test pilotes. En traitant inoculate fécale avec de la pénicilline et streptomycin, la lumière UV, et sonication nous atténuées ce problème.

Toutes les souris inoculées avec soit le cerveau de la tremblante positif souris (9/9) ou les matières fécales des corbeaux de la tremblante inoculées (66 * / 84) ont développé des signes cliniques et ont été testés positifs par analyse Western blot (Figure 3), ce qui montre que la tremblante facilement traversé la système digestif des corneilles et les maladies causés. * Dix-huit souris sont mortes dans les 3 jours suivant l'inoculation, probablement en raison de la toxicité. Tous sauf un (1/23) des souris inoculées tremblante négatif étaient négatifs par Western blot. Nous émettons l'hypothèse que cette souris a été par inadvertance inoculé avec des excréments d'oiseau tremblante positif au lieu de matières fécales d'un vol de la tremblante négatif.

Figure 1
Figure 1. Corneille retenu manuellement et gavés par voie orale avec 5 ml d'oeuf entier mélangé avec un colorant bleu (A) et blue / excréments vert teinté 4 h après gavage (B). Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 2
Figure 2. Fèces oiseau collection avec pipette avant l'homogénéisation. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 3
Figure 3. . Représentant SDS-PAGE Western blot de cerveau de souris essai biologique BNH normale homogénat de cerveau de souris, tremblante négatif, TX cage 4 - cerveau d'une souris inoculées avec des excréments d'un vol de la tremblante inoculées. Avec (+) et without (-). PK (protéinase K) digestion Cliquez ici pour agrandir l'image .

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Discussion

Nous démontrons une procédure pour documenter le passage du matériau PrP Res par le système digestif des corneilles. Nous avons utilisé des méthodes conventionnelles pour déterminer si les corbeaux ont la capacité de translocation matériau PrP Res à des zones géographiques indemnes de la maladie. D'autres ont évalué la résistance de la PrP Res de ruminants et de rongeurs 19-21 22,23 sucs digestifs, les deux qui n'ont pas réussi à éliminer. Les futures applications de ces techniques devrait être appliquée à d'autres carnivores 24 car ils pourraient aussi potentiellement confronté à un contenu PrP Res dans la charogne et transporter ce matériel à travers le paysage de faciliter la propagation des maladies à prions.

Nous avons ajouté du colorant alimentaire bleu à notre œufs brouillés «pseudo cerveau» de la matière, offrant un moyen simple pour évaluer le temps de passage d'environ cerveau de souris homogénéisé par le tube digestif des corneilles. Nous vous conseillons d'autres envisagent cette technique aux premières inspect couleur des excréments d'animaux existant de l'étude, puis utiliser du colorant alimentaire qui est la plus contrastée. Cela permettra de faciliter l'identification de la couleur de la nourriture matérielle teinté qui a traversé les animaux de l'étude. Nous avons choisi d'utiliser du colorant alimentaire pour estimer le temps de passage, mais d'autres ont utilisé un pigment fluorescent 25, oxyde de fer 26, les marqueurs colorés en plastique 27, et des paillettes métalliques de couleur (c.-à-glitter) 28.

Souris en minimisant la menace d'une infection microbienne secondaire à partir des fèces d'oiseau et d'ensemencement sont correctement principaux points de départ pour des études souris prions qui nécessitent longues périodes d'incubation. Si l'un de ces considérations sont violés, la mortalité de la souris précoce est susceptible d'entraîner.

Un autre outil possible pour l'enquête est la protéine série repliement amplification cyclique ou sPMCA à évaluer les échantillons fécaux oiseau le temps d'établir combien de temps après corbeaux de gavage passent matériel infectieux, avecla nécessité d'un dosage biologique de la souris. Les progrès récents dans l'analyse des fèces PMCA par Pulford, et al. Indiquent que l'amplification des niveaux de minutes de prions peut être détecté dans les selles de mammifères 29, suggérant PMCA pourrait également être un outil utile pour évaluer les excréments d'oiseaux. Le bio-essai sur souris et approche sPMCA pourraient être utilisés pour évaluer l'infectiosité résiduelle dans les matières fécales de corbeaux gavés avec du matériel de CWD infectées. Une lignée de souris transgéniques cervidized serait nécessaire et intracérébrale contre l'inoculation intrapéritonéale donnerait des résultats plus rapides.

Oiseaux charognards, comme les corneilles, les vautours et les aigles, pourraient jouer un rôle dans la propagation de maladies de l'EST, à savoir l'encéphalopathie des cervidés en Amérique du Nord. Ces espèces pourraient consommer tissu MDC-positif de carcasses malades ou entrailles (dans le cas des cervidés tués par des chasseurs) et la translocation de matériel infectieux dans leurs excréments à des zones ou populations de cervidés libre CWD. Comme la pratique de donner du grain à cervidés, à l'état sauvage ou en captivitéparamètres, attire les corbeaux qui peuvent déféquer sur la source de nourriture et être consommés par inadvertance par les cervidés, est donc une pratique à haut risque (Vercauteren observation personnelle). En outre, si les chances d'animaux gratuit MDC-rencontrant matériau PrP Res par les excréments aléatoire dépôt peuvent être faibles, les zones où les corbeaux et donc leurs excréments sont concentrés, comme ci-dessous les sites de repos commun, pourraient devenir des zones à haut risque pour la transmission de la maladie depuis prions sont si persistants dans l'environnement 30,31.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier S. Werner pour fournir les corbeaux utilisées dans cette étude et l'USDA, APHIS, WS, CNRF personnel de soins aux animaux pour les soins et la surveillance des animaux. La mention ou utilisation d'un produit n'implique pas l'approbation de l'USDA. Le financement de cette étude a été fourni par l'USDA, APHIS, les Services vétérinaires.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RML Chandler strain mouse-adapted scrapie Rocky Mountain Laboratories
RC57BL/6 mice Hilltop Lab Animals
American crows wild captured
Pen/Strep Invitrogen 15140-122
Phosphate buffered Saline Invitrogen 70011-044
Sonicator Misonix
Proteinase-K solution Roche 3115887001
Loading buffer Invitrogen NP0007 and 0009
Bis-tris SDS PAGE 12% gel Invitrogen NP0342
Immobilon PVDF membrane Millipore 1SEQ00010
Tween 20 Sigma Aldrich P2287
Bullet blender homogenizer Braintree Scientific BBX24B
2.3 mm Zirconia/silica beads BioSpec Products 11079125Z
Bar224 anti-PrP monoclonal antibody Cayman Chemical 10009035
Superblock Thermo Scientific 37517
chemiluminescent substrate Millipore WBKLS0500
G-box gel documentation system Syngene

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References

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