Procedure per l'identificazione Infettive prioni dopo il passaggio attraverso l'apparato digerente di una specie aviaria

Published 11/06/2013
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Immunology and Infection

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Summary

Spazzini hanno un potenziale di traslocare infettive trasmissibili prioni dell'encefalopatia spongiforme nelle loro feci in aree indenni. Abbiamo metodi di dettaglio utilizzati per determinare se i prioni scrapie mouse adattati rimangono contagiosi dopo il passaggio se il tratto digestivo di corvi americani (Corvus brachyrhynchos), un consumatore comune di animali morti.

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Fischer, J. W., Nichols, T. A., Phillips, G. E., VerCauteren, K. C. Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species. J. Vis. Exp. (81), e50853, doi:10.3791/50853 (2013).

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Abstract

Prionica infettiva (PrP Res) materiale è probabile che la causa della fatale, neurodegenerative l'encefalopatia spongiforme trasmissibile (TSE) malattie 1. Trasmissione di malattie TSE, quali sindrome del dimagrimento cronico (CWD), si presume essere da animale ad animale 2,3 così come da fonti ambientali 4-6. Spazzini e carnivori hanno un potenziale di traslocare il materiale PrP Res attraverso il consumo e l'escrezione di carogne CWD contaminati. Studi recenti hanno documentato il passaggio di materiale PrP Res attraverso il sistema digestivo di corvi americani (Corvus brachyrhynchos), un nordamericano tesoro comune 7.

Descriviamo procedure utilizzate per documentare il passaggio del materiale PrP Res attraverso corvi americani. Crows sono stati gavaged con RML-ceppo di topi-adattato scrapie e le loro feci sono stati raccolti 4 ore dopo sonda gastrica. Feci Crow sono stati poi riuniti e iniettato per via intraperitoneale inTopi C57BL / 6. I topi sono stati monitorati giornalmente finché non espressi segni clinici di topo scrapie e sono stati successivamente sottoposti a eutanasia. Topi asintomatici sono stati monitorati fino a 365 giorni dopo l'inoculazione. Western blot è stata condotta per confermare lo stato di malattia. I risultati hanno rivelato che i prioni rimangono contagiosi dopo aver viaggiato attraverso il sistema digestivo di corvi e sono presenti nelle feci, causando la malattia nei topi di prova.

Introduction

Encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE) sono fatali disturbi infettivi neurodegenerative che colpiscono la fauna selvatica, animali domestici, e gli esseri umani. L'agente infettivo delle malattie TSE sembra essere isoforme mal ripiegate o patogeni (PrP Res) di proteine ​​prioniche 1. Malattie TSE animale includono sindrome del dimagrimento cronico (CWD) in cervo mulo (Odocoileus hemionus), cervi dalla coda bianca (Odocoileus virginianus), alce (Cervus elaphus), e alce (Alces alces); scrapie in ovini e caprini; encefalopatia spongiforme bovina ( BSE) nel bestiame domestico; encefalopatia visone in visone d'allevamento; encefalopatia spongiforme felina nei gatti; esotico encefalopatia spongiforme ungulati in zoo esotico rumina della famiglia dei bovidi, e l'encefalopatia spongiforme nei primati non umani 8. Il singolo malattia TSE umana, malattia di Creutzfeldt-Jakob variante è rara e pensato per essere acquisita da consumare PrP Res-Contamincibo ated 9. Allo stesso modo, la BSE può infettare l'uomo se manzo contaminato è consumato 10. Di tutte le malattie TSE, scrapie e CWD sono gli unici due con epidemie autosufficienti e fonti per l'infezione si presume essere da animale ad animale 2,3,11 così come da fonti ambientali 4-6. La ricerca suggerisce che la maggior parte delle malattie EST richiedono notevoli tempi di incubazione lunghi di esposizione eventi naturali di PrP Res alla manifestazione dei segni clinici 2-4,6,8 e delle specie apparenti ostacoli minimizzano, ma non eliminano il rischio di trasmissione interspecie 12-14 .

Identificare i meccanismi per la diffusione del prione infettivo (PrP Res) materiale è estremamente importante per rispondere alle domande su come le malattie EST muovono attraverso il paesaggio. Indagini sperimentali hanno suggerito che gli insetti 15,16, pollame e suini 17, e corvi americani (Corvus brachyrhynchos) 7,18 sono vettori passivi o dispersori di materiale PrP Res. Passaggio di materiale PrP Res attraverso il sistema digestivo di corvi è stato recentemente documentato, dimostrando il ruolo che possono svolgere in dispersione delle malattie TSE 7. Questi risultati rendono plausibile che i corvi, uno spazzino, potrebbero incontrare, consumano, e trasportano materiale infetto tramite le feci deposizione, in aree indenni.

Le procedure dimostriamo qui sono stati usati per documentare il passaggio del materiale PrP Res attraverso il sistema di digestione di corvi e notevolmente facilitare l'applicazione di questi metodi per altri scavenger e modelli carnivoro specie-specifiche in ricerche future correlate. In questo studio sono stati utilizzati i metodi convenzionali per indagare su un mezzo non convenzionali di traffico di materiale PrP Res, che potrebbe contribuire alla diffusione e gravità complessiva della materia PrP Res.

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Protocol

Il nostro protocollo è adattato da quello che abbiamo già pubblicato 7. Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti (USDA), animale e vegetale servizio di ispezione sanitaria (APHIS), Wildlife Services (WS), National Wildlife Research Center (NWRC).

1. Crow Gavaging

  1. Stima tempo di passaggio di 'materiale cerebrale pseudo' attraverso il tratto alimentare di corvi americani.
    1. Mescolare 5 ml di cotte e strapazzate uovo intero con il colorante blu e sonda gastrica 1 corvo con un 2 a gavage ago (Figura 1).
    2. Controllare corvo ogni 30 minuti fino a quando / feci verde macchiato di blu non sono più escreti.
  2. Ottenere RML (ceppo Chandler)-infetti C57BL / 6 cervelli infetti e malati terminali mouse.
  3. Generare un 20% di peso / volume normale e infetto omogeneizzato mouse cervello in un omogeneizzatore proiettile frullatore con 1xtampone fosfato salino (PBS), e perle di vetro, poi centrifugare a 3000 xg per 1 minuto per rimuovere le particelle più grandi. Rimuovere il surnatante e diluire con un volume uguale di PBS 1x per generare un 10% peso / volume in PBS sterile. Congelare a -80 ° C fino al momento dell'uso.
  4. 17 ore prima del gavage rimuovere il cibo, ma non l'acqua, da penne d'aria.
  5. Casualmente destinare corvi ai gruppi di trattamento e per via orale sonda gastrica ogni corvo con 5 ml di normale o infetto omogeneizzato cervello di topo con un 2 in gavage ago.
  6. Trasferimento corvi di gabbie individuali e di raccogliere tutta feci all'interno di ogni gabbia per 4 ore dopo gavage (Figura 2).
  7. Omogeneizzare feci pool per ogni corvo in un omogeneizzatore proiettile frullatore con perle di vetro fino ad ottenere una consistenza omogenea. * Feci gallina sono più liquidi e possono essere mescolati facilmente.
  8. Per ogni corvo, diluire 500 ml di omogenato fecale in 9,5 ml di PBS 1x per un volume totale di 10 ml.
  9. Centrifugare la homogena fecaleTE per 15 min a 1400 xg ed estrarre il surnatante.
  10. Per minimizzare il rischio di una infezione microbica secondaria, trattare surnatante con 1 ml di 100 unità / ml di penicillina e 100 pg / ml streptomicina (Invitrogen, NY) per 100 ml di omogenato poi posto sotto luce UV a temperatura ambiente per 20 min per ridurre rischio di contaminazione virale e batterica. Dopo l'esposizione ai raggi UV, i campioni Sonicare in un Mp sonicatore 3000 a creare 70 per 30 secondi per distruggere la membrana di eventuali microbi rimanenti.

2. Topo inoculazione

  1. Casualmente destinare topi per i seguenti gruppi di trattamento (Tabella 1):
    1. Gruppo 1 - topi trattamento positivo inoculati per via intraperitoneale (IP) di 1 ml di omogenato fecale da corvi oralmente gavaged con 5ml infettato cervelli del mouse.
    2. Gruppo 2 - Negativo topi inoculati trattamento IP con 1 ml di omogenato fecale da corvi oralmente gavaged con 5ml normali cervelli del mouse.
    3. Diluire infected e normale omogeneizzato cervello di topo per i gruppi 3 e 4 a 1:100 w / v in PBS 1x.
    4. Gruppo 3 - topi di controllo positivi inoculato IP con 1 ml di omogenato infetto topo-cervello.
    5. Gruppo 4 - Negativo topi di controllo inoculati IP con 1 ml di omogenato normale mouse del cervello.
Gruppo di trattamento Numero di animali
Gruppo 1 Scrapie + Crow Feci 100
Gruppo 2 Scrapie - Crow Feci 25
Gruppo 3 Cervello Scrapie + mouse 10
Gruppo 4 Scrapie - cervello di topo 5

. Tabella 1 Stato Scrapie di inoculo (+ positivo, negativo -) e il numero di animali utilizzati 7.

  1. Intraperitoneale inoculare il mouse:
    1. Scruff mouse dorsale collo di pelliccia con il pollice e l'indice e delicatamente ruotare per esporre lato ventrale.
    2. Elevare estremità posteriore del mouse in modo testa è leggermente inferiore.
    3. Inserire 25 ago G 1 centimetro attraverso la pelle, 1 centimetro laterale della linea mediana, e di 1-2 cm anteriormente alla sacroiliaca usando una siringa-ago di bloccaggio.
    4. Iniettare 1 ml trapiantare lentamente nel topo cavità del corpo.

3. Monitoraggio mouse

  1. Controllo topi ogni giorno fino esprimono segni clinici di topo scrapie. I segni clinici possono includere: cifosi, atassia, coda rigida, la mancanza di governare, deperimento, e letargia.
  2. Punteggio topi per ognuno dei 6 segni clinici quando segni visibili sono evidenti, in cui 0 = nessuna visibile, 1 = moderato, e 2 = grave.
  3. Eutanasia topi quando punteggi totali giornalieri per ogni segno raggiungere ≥ 8 per 1 giorno, ≥ 6 ininterrottamente per 3 giorni, oa 365 giorni dopo l'inoculazione (dpi).
  4. Cervelli raccolto subito dopo euthanasia e conservare a -70 ° C.
  5. Per confermare una diagnosi di scrapie, digerire campioni di cervello con 3 ml di un 50 mg / ml di soluzione di proteinasi-K (PK) diluito come segue: 3.1. microlitri PK, 12.5 ml di EDTA 500 mM, pH 8, 109.39 ml di PBS 1x per 30 min a 45 ° C, poi inattivare il PK aggiungendo 8 microlitri tampone di caricamento e incubando i campioni a 95 ° C per 5 min. Campioni caricare su un 12% SDS-PAGE gel, elettroforesi e trasferimento su membrana di (PVDF) e Immobilon blocco con 5% di latte scremato in 0,2% di Tween 20 in PBS per 1 ora a temperatura ambiente. Poi sonda con Bar224 anti-PrP anticorpo monoclonale coniugato con perossidasi di rafano, diluita in Superblocco, per 1 ora a temperatura ambiente. Risciacquare membrana per 1 ora con PBS-0.2% Tween 20. Per visualizzare, incubare Western Blot 5 minuti con il substrato chemiluminescente e immagine su un sistema di documentazione gel G-box.

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Representative Results

Le procedure utilizzate dimostrano che il sistema digestivo dei corvi non elimina PrP Res infettività 4 ore dopo la sonda gastrica di omogenato cerebrale scrapie 7. Tutti i venti corvi che sono stati gavaged con materiale PrP Res successivamente trasmessi materiale PrP Res tramite le feci di topi. Topi malati sono stati identificati dalla manifestazione di segni topo-scrapie clinici e conferma malattia è stata completata da analisi Western Blot.

Investigation del tempo di ritenzione del materiale ingerito da corvi rivelato tempo passaggio nel tratto alimentari per un corvo gavaged essere 4 ore, in base alla presenza di colorante nelle feci (Figura 1). Tutti gli feci sono stati raccolti con pipette monouso e raggruppati per ogni linea (Figura 2). Tossicità acuta da feci d'aria non trattati si è verificato quando greggio surnatante fecale è stato iniettato in topi IP di test pilota. Trattando inoculare fecale con penicillina e Streptomycin, luce UV, e sonicazione abbiamo alleviato il problema.

Tutti i topi inoculati con uno scrapie-positivo cervello di topo (9/9) o feci dal corvi scrapie inoculati (66 * / 84) hanno sviluppato segni clinici e risultati positivi mediante analisi Western blot (Figura 3), che illustra che la scrapie facilmente passare attraverso l' sistema digestivo dei corvi e malattia causata. * Diciotto i topi sono morti entro 3 giorni di inoculazione, probabilmente a causa di tossicità. Tutti tranne uno (1/23) topi inoculati scrapie-negativi sono risultati negativi mediante analisi Western Blot. Noi ipotizziamo che questo mouse è stato inavvertitamente inoculato con scrapie-positivo d'aria feci invece di feci da un corvo scrapie-negativo.

Figura 1
Figura 1. Crow trattenuto manualmente e oralmente gavaged con 5 ml di uovo intero mescolato con colorante blu (A) e Blue / feci verde macchiato di 4 ore dopo gavage (B). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 2
Figura 2. Feci Crow collezione con pipetta prima di omogeneizzazione. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 3
Figura 3. . Rappresentante SDS-PAGE Western Blot di cervello di topo da biotest NBH-normale omogenato di cervello di topo, scrapie-negativo, gabbia TX 4 - cervello di un topo inoculato con le feci di un corvo scrapie-inoculato. Con (+) e without (-). PK (proteinasi K) digestione Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

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Discussion

Dimostriamo una procedura per documentare il passaggio del materiale PrP Res attraverso il sistema digestivo di corvi. Abbiamo usato metodi convenzionali per determinare se i corvi hanno la possibilità di traslocare il materiale PrP Res per aree geografiche indenni. Altri hanno valutato la resistenza di PrP Res ai ruminanti 19-21 e roditori 22,23 fluidi digestivi, entrambi i quali non è riuscito a eliminarlo. La futura applicazione di queste tecniche dovrebbe essere applicato ad altri carnivori 24 in quanto potrebbero anche potenzialmente incontrare materiale PrP Res in carogne e trasportare questo materiale attraverso il paesaggio favorendo la diffusione delle malattie da prioni.

Abbiamo aggiunto colorante alimentare blu al nostro uova strapazzate 'pseudo cervello' materiale, fornendo un modo semplice per valutare il tempo approssimativo passaggio del cervello omogeneizzato mouse attraverso il tubo digerente di corvi. Consigliamo altri considerano questa tecnica per primo insPECT colore feci esistente di animali di studio e quindi utilizzare coloranti alimentari che è più contrastanti. Ciò consentirà per una facile identificazione del colore cibo materiale colorato che ha attraversato gli animali dello studio. Abbiamo scelto di utilizzare coloranti alimentari per stimare il tempo di passaggio, ma altri sono stati utilizzati pigmenti fluorescenti 25, ossido di ferro 26, marcatori colorati di plastica 27, e scaglie metalliche colorate (cioè scintillio) 28.

Minimizzare la minaccia di una infezione microbica secondaria da feci d'aria e correttamente inoculo topi sono punti di partenza fondamentali per gli studi mouse prioni che richiedono periodi di incubazione lunghi. Se uno di queste considerazioni sono violati, la mortalità precoce mouse è suscettibile di provocare.

Un altro possibile strumento di indagine è la proteina di serie misfolding amplificazione ciclica o sPMCA per valutare campioni di feci d'aria nel corso del tempo per stabilire quanto tempo dopo corvi sonda gastrica passano materiale infetto, conla necessità di un saggio biologico mouse. I recenti progressi nella LCMP analisi delle feci di Pulford, et al. Indicano che l'amplificazione dei livelli di prioni minuti può essere rilevata nelle feci di 29 mammiferi, suggerendo LCMP potrebbe anche essere uno strumento utile per valutare le feci aviaria. Il biotest sui topi e l'approccio sPMCA potrebbero essere utilizzati per valutare l'infettività residua nelle feci di corvi gavaged con materiale CWD-infettati. Una linea di topi transgenici cervidized sarebbe necessario e intracerebrale contro inoculazione intraperitoneale darebbe risultati più rapidi.

Spazzini aviaria, come corvi, avvoltoi, aquile, potrebbero svolgere un ruolo nella diffusione di malattie TSE, cioè CWD in Nord America. Queste specie possono consumare tessuti CWD-positive dalle carcasse malate o interiora (nel caso di cervidi cacciatori-ucciso) e traslocare materiale infettivo nelle loro feci di zone di libero CWD o popolazioni di cervidi. Come la pratica della somministrazione di grano cervidi, in natura o in cattivitàimpostazioni, attira corvi che può defecare sulla fonte di cibo e di essere inavvertitamente consumati dai cervidi, è quindi una pratica ad alto rischio (Vercauteren osservazione personale). Inoltre, anche se le probabilità di animali privi di CWD incontrando materiale PrP Res attraverso le feci casuale deposizione può essere bassa, le aree in cui si concentrano corvi e quindi le loro feci, come qui di seguito i siti dormitori comunali, potrebbero diventare delle aree ad alto rischio di trasmissione di malattie dal prioni sono così persistenti nell'ambiente 30,31.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare S. Werner per fornire i corvi utilizzati in questo studio e USDA, APHIS, WS, NWRC personale cura degli animali per la cura degli animali e monitoraggio. Menzione o l'uso di un prodotto non implica l'approvazione USDA. Finanziamento per questo studio è stato fornito da USDA, APHIS, servizi veterinari.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RML Chandler strain mouse-adapted scrapie Rocky Mountain Laboratories
RC57BL/6 mice Hilltop Lab Animals
American crows wild captured
Pen/Strep Invitrogen 15140-122
Phosphate buffered Saline Invitrogen 70011-044
Sonicator Misonix
Proteinase-K solution Roche 3115887001
Loading buffer Invitrogen NP0007 and 0009
Bis-tris SDS PAGE 12% gel Invitrogen NP0342
Immobilon PVDF membrane Millipore 1SEQ00010
Tween 20 Sigma Aldrich P2287
Bullet blender homogenizer Braintree Scientific BBX24B
2.3 mm Zirconia/silica beads BioSpec Products 11079125Z
Bar224 anti-PrP monoclonal antibody Cayman Chemical 10009035
Superblock Thermo Scientific 37517
chemiluminescent substrate Millipore WBKLS0500
G-box gel documentation system Syngene

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References

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