Verfahren zur Identifizierung von Infektions Prionen Nach Passage durch das Verdauungssystem von eine Vogelart

Published 11/06/2013
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Immunology and Infection

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Summary

Aasfresser haben Potenzial, infektiöse Prionen übertragbaren spongiformen Enzephalopathie in ihren Kot zu krankheitsfreien Gebieten transloziert. Wir detailliert Methoden verwendet werden, um festzustellen, ob der Maus-adaptierten Scrapie-Prionen bleiben nach dem Durchgang aber den Verdauungstrakt der amerikanischen Krähen (Corvus brachyrhynchos), einer gemeinsamen Verbraucher toter Tiere ansteckend.

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Fischer, J. W., Nichols, T. A., Phillips, G. E., VerCauteren, K. C. Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species. J. Vis. Exp. (81), e50853, doi:10.3791/50853 (2013).

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Abstract

Infektiöse Prionen (PrP Res) Material ist wahrscheinlich die Ursache der tödlichen, neurodegenerative übertragbare spongiforme Enzephalopathie (TSE) Krankheiten ein. Übertragung von TSE-Erkrankungen wie Chronic Wasting Disease (CWD), wird vermutet, von Tier zu Tier 2,3 sowie aus Umweltquellen 4-6 sein. Reiniger und Fleischfresser haben Potenzial, PrP Res Material durch Konsum und die Ausscheidung von CWD-kontaminierten Aas transloziert. Neuere Arbeiten haben Gang von PrP Res Material durch das Verdauungssystem der amerikanischen Krähen (Corvus brachyrhynchos), einer gemeinsamen nordamerikanischen Schnitzel 7 dokumentiert.

Wir beschreiben Verfahren verwendet werden, um Durchgang von PrP Res Material durch amerikanische Krähen zu dokumentieren. Krähen wurden mit RML-Dehnungs-Maus-adaptierten Scrapie zwangsernährt und ihren Kot gesammelt wurden 4 Stunden nach der Magensonde. Crow Kot wurden dann gesammelt und in intraperitonealC57BL / 6 Mäusen. Die Mäuse wurden täglich überwacht, bis sie ausgedrückt klinischen Zeichen der Maus Scrapie und wurden danach getötet. Asymptomatische Mäuse wurden bis zu 365 Tage nach der Impfung überwacht. Western-Blot-Analyse wurde durchgeführt, um Krankheitsstatus zu bestätigen. Ergebnisse zeigten, dass Prionen infektiös bleiben nach einer Reise durch das Verdauungssystem von Krähen und im Kot vorhanden sind, was zu Krankheit in Versuchsmäusen.

Introduction

Übertragbare spongiforme Enzephalopathien (TSE) sind tödliche Infektions neurodegenerative Erkrankungen, die Tierwelt auswirken, Haustieren und Menschen. Der Erreger der TSE-Erkrankungen scheint falsch gefaltete oder pathogenen Isoformen (PrP Res) von Prion-Proteinen 1 sein. Tier TSE-Erkrankungen gehören Chronic Wasting Disease (CWD) in Maultierhirsch (Odocoileus hemionus), Weißwedelhirsche (Odocoileus virginianus), Elch (Cervus elaphus) und Elch (Alces alces), Scrapie bei Schafen und Ziegen, die bovine spongiforme Enzephalopathie ( BSE) in Hausrinder; tragbare Nerz Enzephalopathie bei Zucht Nerz, Feline Spongiforme Enzephalopathie bei Katzen, exotische Huftiere spongiforme Enzephalopathie in exotischen Zoo sinniert der Familie Hornträger und spongiforme Enzephalopathie in nicht-menschlichen Primaten 8. Der einzelne Mensch TSE-Erkrankung, Variante der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit ist selten und vermutlich durch den Verzehr von PrP Res-Contamin erworben werdenATED Essen 9. Ebenso BSE Menschen infizieren können, wenn verseuchtes Rindfleisch verbraucht 10. Von all den TSE-Erkrankungen, Scrapie und CWD sind nur zwei mit sich selbst erhaltende Epidemien und Quellen für die Infektion sind vermutlich von Tier zu Tier 2,3,11 sowie aus Umweltquellen 4-6 sein. Forschung schlägt vor, dass die meisten TSE-Erkrankungen erfordern bemerkenswerte längere Inkubationszeiten aus natürlichen Belichtung Ereignisse des PrP Res Material zur Manifestation klinischer Symptome 2-4,6,8 und Scheinspeziesbarrieren zu minimieren, aber nicht das Potenzial für die, Übertragung zwischen 12-14 beseitigen .

Identifizieren Mechanismen für die Ausbreitung von Infektions Prionen (PrP Res) Material ist für die Beantwortung von Fragen, wie TSE-Erkrankungen durch die Landschaft bewegen extrem wichtig. Experimentelle Untersuchungen haben ergeben, dass 15,16, Geflügel und Schweine 17, und amerikanische Krähen (Corvus brac Insektenhyrhynchos) 7,18 passive Träger oder Dispergatoren von PrP Res Material. Passage von PrP Res Material durch das Verdauungssystem von Krähen hat kürzlich dokumentiert, was die Rolle, die sie in Ausbreitung von TSE-Erkrankungen 7 zu spielen. Diese Ergebnisse machen es plausibel, dass Krähen, ein Aasfresser, auftreten können, zu konsumieren und zu transportieren infektiösem Material über Kot Abscheidung, um seuchenfreie Gebiete.

Die Verfahren, die wir hier zeigen, wurden verwendet, um den Durchgang von PrP Res Material durch das Verdauungssystem von Krähen zu dokumentieren und die Anwendung dieser Methoden auf andere Fänger und Raubtierarten spezifische Modelle in verwandten zukünftige Forschung erheblich erleichtern. In dieser Studie wurden konventionelle Methoden verwendet werden, um eine unkonventionelle Mittel des Menschenhandels PrP Res Material, das für die Verbreitung und der Gesamtbelastung von PrP Res Material beitragen könnten, zu untersuchen.

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Protocol

Unser Protokoll wird von einem zuvor veröffentlichten wir 7 angepasst. Alle Verfahren, die Tiere wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss des United States Department of Agriculture (USDA), Tier-und Pflanzengesundheit Kontrolle Service (APHIS), Wildlife Services (WS), National Wildlife Research Center (NWRC) zugelassen.

1. Crow Gavaging

  1. Schätzen Durchlaufzeit "Pseudo Hirnmaterial" durch den Verdauungstrakt der amerikanischen Krähen.
    1. Mix 5 ml gekocht und Rührei ganzes Ei mit blauen Farbstoff und eine Magensonde ein Krähe mit einer 2 in der Schlundsonde Nadel (Abbildung 1).
    2. Überprüfen Krähe alle 30 min bis blau / grün-gefärbten Kot werden nicht mehr ausgeschieden.
  2. Erhalten infizierten und unheilbar krank RML (Chandler Stamm)-infizierten C57BL / 6 Maus Gehirne.
  3. Generieren Sie einen 20% wt / vol normal und infizierten Maus-Hirn-Homogenat in einer Kugel Mixer Homogenisator mit 1xPhosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) und Glasperlen, dann Zentrifugieren bei 3.000 × g für 1 min, um größere Partikel zu entfernen. Überstand entfernen und verdünnt mit einem gleichen Volumen an 1 × PBS, um eine 10% w / v in steriler PBS zu erzeugen. Einfrieren bei -80 ° C, bis sie benötigt.
  4. 17 Stunden vor der Magensonde zu entfernen Essen, aber nicht Wasser, von Luftfedern.
  5. Zufällig zuordnen Krähen Behandlungsgruppen und der Schlundsonde oral jede Krähe mit 5 ml entweder normal oder infizierten Mausgehirnhomogenat mit einer 2 in der Schlundsonde Nadel.
  6. Über kräht auf einzelne Käfige und sammeln und bündeln alle Kot in jedem Käfig für 4 Stunden nach der Magensonde (Abbildung 2).
  7. Homogenisieren gepoolten Fäkalien für jede Krähe in einem Kugel-Homogenisator Mixer mit Glasperlen, bis eine gleichmäßige Struktur erzielt wird. * Crow Kot sind meist flüssig und kann leicht gemischt werden.
  8. Für jede Krähe, verdünnte 500 ul der fäkalen Homogenat in 9,5 ml 1x PBS für ein Gesamtvolumen von 10 ml.
  9. Zentrifugieren Sie die fäkale homogenate für 15 min bei 1.400 xg und extrahieren Sie den Überstand.
  10. Um der Gefahr eines sekundären mikrobiellen Infektion zu minimieren, behandeln Stand mit 1 ul von 100 Einheiten / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin (Invitrogen, NY) pro 100 ul Homogenat dann unter UV-Licht bei Raumtemperatur für 20 min reduzieren Risiko viraler und bakterieller Kontamination. Nach der UV-Belichtung, beschallen Proben in einem Beschallungsgerät 3000 Mp bei Einstellung 70 für 30 Sekunden, um die Membran der verbleibenden Mikroorganismen stören.

2. Maus-Impfung

  1. Zufällig Mäuse zuweisen, um die folgenden Behandlungsgruppen (Tabelle 1):
    1. Gruppe 1 - Positive Behandlung Mäusen intraperitoneal geimpft (IP) mit 1 ml der fäkalen Homogenat von Krähen oral mit 5ml infizierten Mäusehirnen zwangsernährt.
    2. Gruppe 2 - Negative Behandlung Mäuse geimpft IP mit 1 ml der fäkalen Homogenat von Krähen oral mit 5ml normalen Gehirn der Maus zwangsernährt.
    3. Verdünnen infected und Normal Mausgehirnhomogenat für Gruppen 3 und 4 bis 1:100 w / v in 1x PBS.
    4. Gruppe 3 - Positive Kontrollmäusen eingeimpft IP mit 1 ml der infizierten Maus-Hirn-Homogenat.
    5. Gruppe 4 - Negative Kontrollmäusen eingeimpft IP mit 1 ml normalen Maus-Hirn-Homogenat.
Treatment Group Anzahl der Tiere
Gruppe 1 Scrapie + Crow Kot 100
Gruppe 2 Scrapie - Krähen-Kot 25
Gruppe 3 Scrapie + Maus Gehirn 10
Gruppe 4 Scrapie - Maus Gehirn 5

. Tabelle 1 Scrapie Status des Inokulums (positive + negative -) und Anzahl der verwendeten Tiere 7.

  1. Intraperitoneal impfen Maus:
    1. Scruff Maus durch dorsalen Nackenfell mit Daumen und Zeigefinger und sanft drehen, um Bauchseite aus.
    2. Elevate hinteren Ende der Maus, so Kopf ist etwas niedriger.
    3. Legen Sie 25 G-Nadel 1 cm durch die Haut, 1 cm lateral der Mittellinie, und 1-2 cm vor dem Iliosakralgelenk mit einer Nadel sichernde Spritze.
    4. Spritzen 1 ml langsam in Maus impfen Körperhöhle.

3. Maus-Überwachung

  1. Überwachung der Mäuse täglich, bis sie klinische Zeichen der Maus Scrapie auszudrücken. Klinische Symptome können sein: Kyphose, Ataxie, steifen Schwanz, mangelnde Pflege, Abmagerung und Lethargie.
  2. Ergebnis Mäuse für jede der sechs klinischen Zeichen, wenn sichtbare Anzeichen sind offensichtlich, wobei 0 = keine sichtbar, 1 = mäßig, und 2 = schwere.
  3. Euthanize Mäuse, wenn die gesamte tägliche Punktzahl für jedes Zeichen zu erreichen ≥ 8 für 1 Tag, ≥ 6 kontinuierlich für 3 Tage, oder bei 365 Tage nach der Inokulation (dpi).
  4. Ernte Gehirn unmittelbar nach euthanasien und bei -70 ° C
  5. Scrapie, eine Diagnose zu bestätigen, Digest Gehirnproben mit 3 ul einer 50 ug / ml Proteinase-K-Lösung (PK) wie folgt verdünnt: 3,1. PK ul, 12,5 ul 500 mM EDTA, pH 8, 109,39 ul 1x PBS für 30 min bei 45 ° C, dann inaktivieren PK durch Zugabe von 8 &mgr; l Ladepuffer und Inkubation Proben bei 95 ° C für 5 min. Last Proben auf ein 12% SDS-PAGE-Gel Elektrophorese und Übertragung auf Immobilon-PVDF-Membran und Block mit 5% fettfreier Milch in 0,2% Tween 20 in PBS für 1 h bei Raumtemperatur. Sonde dann mit BAR224 anti-PrP monoklonaler Antikörper, der mit Meerrettich-Peroxidase, verdünnt in Superblock, für 1 Stunde bei Raumtemperatur konjugiert. Spülen Membran für 1 Stunde mit PBS-Tween 20 0,2%. Um zu visualisieren, Inkubation Western-Blot 5 min mit Chemilumineszenzsubstrat und Bild auf einem G-Feld-Gel-Dokumentationssystem.

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Representative Results

Die angewendeten Verfahren zeigen, dass das Verdauungssystem von Krähen nicht PrP Res Infektiosität 4 Stunden nach orale Gabe von Scrapie Hirnhomogenat 7 zu beseitigen. Alle zwanzig Krähen, die mit PrP Res Material zwangsernährt wurden anschließend PrP Res Material, um Mäuse übertragen über Kot. Kranke Mäuse wurden durch klinische Manifestation der Maus-Scrapie-Krankheit Anzeichen und Bestätigung wurde durch Western-Blot-Analyse abgeschlossen identifiziert.

Untersuchung der Retentionszeit des Materials durch Krähen Einnahme zeigte Durchgangszeit durch den Verdauungstrakt eine Sonde für einen Luft bis 4 h, basierend auf der Anwesenheit des Farbstoffs im Stuhl (Fig. 1). Alle Rückstände wurden mit Einwegpipetten erfassen und für jeden Luft (Fig. 2) vereinigt. Akute Toxizität von unbehandelten Luft Kot aufgetreten, wenn roh Stuhlüberstand wurde in IP-Pilotversuch Mäusen injiziert. Durch die Behandlung mit Penicillin Stuhl impfen und streptomycin, UV-Licht, Beschallung und wir dieses Problem gemildert.

Alle Mäuse, die entweder mit Scrapie-positiven Mäusehirn (9/9) oder Fäkalien von Scrapie-inokulierten Krähen impft (66 * / 84), entwickelten klinische Anzeichen und positiv getestet durch Western-Blot-Analyse (Fig. 3), zeigt, dass Scrapie leicht durch die übergebene Verdauungssystem von Krähen und verursachte Krankheit. * Achtzehn Mäuse starben innerhalb von 3 Tagen nach der Impfung, wahrscheinlich aufgrund der Toxizität. Alle bis auf einen (1/23) Scrapie-negativen Mäuse geimpft waren negativ durch Western-Blot-Analyse. Wir vermuten, dass diese Maus wurde versehentlich mit Scrapie-positiven Luft Kot statt Kot von einem Scrapie-negativen Luft geimpft.

Figur 1
Fig. 1 ist. Crow manuell zurückhaltend und mit 5 ml Voll Ei mit blauen Farbstoff (A) und b gemischt oral zwangsernährtlue / grün-gefärbten Kot 4 Stunden nach der Magensonde (B). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Figur 2
2. Crow Kot Sammlung mit Pipette vor der Homogenisierung. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Fig. 3
3. . Vertreter SDS-Page-Western-Blot von Gehirn der Maus-Bioassay von NBH-normal Mausgehirnhomogenat, Scrapie-negativen, TX Käfig 4 - Hirn aus einer Maus mit Kot von einem Scrapie-Krähe geimpft geimpft. Mit (+) und ohnt (-). PK (Proteinase K) Verdauung Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

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Discussion

Wir zeigen ein Verfahren um den Durchgang von PrP Res Material durch das Verdauungssystem von Krähen zu dokumentieren. Wir verwendeten konventionellen Methoden, um festzustellen, ob Krähen haben die Fähigkeit, PrP Res Material, um die krankheitsfreie geografischen Gebieten transloziert. Andere Widerstand von PrP Res ausgewertet 19-21 und Nagetier 22,23 Verdauungsflüssigkeiten, die beide nicht zu beseitigen Wiederkäuer. Die künftige Anwendung dieser Techniken auf andere Fleischfresser 24 angewendet werden, wie sie auch potenziell PrP Res Material stoßen in Aas und dieses Material zu transportieren, über die Landschaft, die Ausbreitung von Prionen-Krankheiten erleichtern.

Wir haben blaue Lebensmittelfarbe, um unsere Rührei 'Pseudo Gehirn "Material und bietet eine einfache Möglichkeit, ungefähre Durchgangszeit von homogenisierten Gehirn der Maus durch den Verdauungstrakt der Krähen zu beurteilen. Wir beraten andere erwägen, diese Technik zum ersten InsPECT vorhandenen Kot Farbe der Studientiere und dann mit Lebensmittelfarbe, die die meisten kontras ist. Dies wird für die einfache Identifizierung von Lebensmittelfarbe gefärbte Material, das durch Studientiere durchlaufen hat lassen. Wir entschieden uns, Lebensmittelfarbe zu verwenden, um Durchlaufzeit zu schätzen, aber andere haben fluoreszierende Pigment 25, Eisenoxid 26, farbigen Kunststoff-Marker 27, und farbigen Metallplättchen (dh Glitter) 28 verwendet.

Die Minimierung der Gefahr einer mikrobiellen Infektion von Sekundärluft Kot und richtig Impfen Mäuse sind wichtige Ausgangspunkte für die Maus-Prion-Studien, die langen Inkubationszeiten erfordern. Wenn eine dieser Überlegungen verletzt werden, ist eine frühzeitige Sterblichkeit Maus wahrscheinlich führen.

Eine weitere mögliche Werkzeug für die Untersuchung ist die Serienproteinfehlfaltung zyklische Verstärkung oder sPMCA krähen Stuhlproben über die Zeit zu bewerten, um festzustellen, wie lange nach der Schlundsonde Krähen passieren infektiösem Material, mitaus der Notwendigkeit einer Maus-Bioassay. Jüngste Fortschritte in der PMCA Stuhlanalyse durch Pulford, et al. Zeigen, dass Verstärkung von Minuten Levels von Prionen in 29 Säugetier Kot nachgewiesen werden, was darauf hindeutet PMCA könnte auch ein nützliches Instrument für die Bewertung der Aviären Kot sein. Der Maus-Bioassay und sPMCA Ansatz könnte verwendet werden, um Rest Infektiosität im Kot der Krähen mit CWD-infizierten Materials zwangsernährt zu bewerten. Ein cervidized transgene Mauslinie erforderlich und intrazerebrale gegen intraperitoneale Inokulation werden würde, wäre eine schnellere Ergebnisse.

Avian Fänger wie Krähen, Geier und Adler, könnte eine Rolle bei der Verbreitung von TSE-Erkrankungen spielen, nämlich CWD in Nordamerika. Diese Spezies konnte CWD-positiven Gewebe von erkrankten Schlachtkörper oder Eingeweide (im Fall der Jäger-und getötet Hirschartigen) konsumieren und translozieren infektiösem Material in ihren Kot zu CWD-freie Zonen oder Populationen von Hirschartigen. Da die Praxis der Fütterung von Getreide nach Hirschartigen, wild oder in GefangenschaftEinstellungen, zieht Krähen, die auf der Nahrungsquelle verrichten kann und versehentlich von Hirschartigen konsumiert werden, ist somit ein Hochrisiko-Praxis (Vercauteren persönliche Beobachtung). Weitere, wenn auch die Chancen von CWD freien Tieren begegnen PrP Res Material durch Zufalls Kot Abscheidung kann gering sein, Bereiche, in denen Krähen und somit ihren Kot konzentriert sind, wie unten Gemeinschaftsrastplätze, könnte von Gebieten mit hohem Risiko für die Übertragung von Krankheiten, da Prionen werden sind in der Umwelt persistent 30,31 so.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgements

Wir möchten S. Werner für die Bereitstellung der in dieser Studie verwendet und USDA Krähen danken, APHIS, WS, NWRC Tierpfleger für Tierpflege und-überwachung. Erwähnen oder die Verwendung eines Produkts nicht USDA Billigung. Die Finanzierung für diese Studie wurde von USDA APHIS, Veterinary Services zur Verfügung gestellt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RML Chandler strain mouse-adapted scrapie Rocky Mountain Laboratories
RC57BL/6 mice Hilltop Lab Animals
American crows wild captured
Pen/Strep Invitrogen 15140-122
Phosphate buffered Saline Invitrogen 70011-044
Sonicator Misonix
Proteinase-K solution Roche 3115887001
Loading buffer Invitrogen NP0007 and 0009
Bis-tris SDS PAGE 12% gel Invitrogen NP0342
Immobilon PVDF membrane Millipore 1SEQ00010
Tween 20 Sigma Aldrich P2287
Bullet blender homogenizer Braintree Scientific BBX24B
2.3 mm Zirconia/silica beads BioSpec Products 11079125Z
Bar224 anti-PrP monoclonal antibody Cayman Chemical 10009035
Superblock Thermo Scientific 37517
chemiluminescent substrate Millipore WBKLS0500
G-box gel documentation system Syngene

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