Мембранный потенциал Краска Визуализация вентромедиального Hypothalamus нейроны от взрослых мышей по изучению глюкозы Sensing

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Деятельность отдельных нейронов мышей взрослых возраста можно изучать с помощью диссоциации нейроны от конкретных областях мозга и использованием изображений потенциальную красителя люминесцентные мембраны. По тестирования реакциям на изменения глюкозы, этот метод может быть использован для изучения чувствительности к глюкозе взрослых вентромедиальных нейронов гипоталамуса.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Vazirani, R. P., Fioramonti, X., Routh, V. H. Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing. J. Vis. Exp. (81), e50861, doi:10.3791/50861 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Исследования активности нейронов часто выполняются с использованием нейроны от грызунов менее 2-месячного возраста в связи с техническими трудностями, связанными с увеличением соединительной ткани и снижение нейронов жизнеспособность, которые происходят с возрастом. Здесь мы описываем методологию для диссоциации здоровых нейронов гипоталамуса мышей взрослых возраста. Способность к обучению нейроны от взрослого возраста мышей позволяет использовать моделей заболеваний, которые проявляются в более позднем возрасте и может быть более умственно точным для некоторых исследований. Флуоресценции визуализации диссоциированных нейронов могут быть использованы для изучения деятельности населением нейронов, в отличие от использования электрофизиологии изучать один нейрон. Это особенно полезно при исследовании гетерогенную популяцию нейронов, в котором желаемый тип нейронов является редким, таких как, гипоталамических глюкозы зондирования нейронов. Мы использовали мембранного потенциала красителя визуализации взрослых вентромедиальных нейронов гипоталамуса изучать свои ответы на чаНГРЭС в внеклеточной глюкозы. Нейроны Глюкоза зондирования, как полагают, играют определенную роль в центральной регуляции энергетического баланса. Способность к обучению зондирования глюкозы у взрослых грызунов особенно полезно с преобладанием заболеваний, связанных с неблагополучной энергетического баланса (например. Ожирение) увеличивается с возрастом.

Introduction

Мозг регулирует энергетического гомеостаза через нейроэндокринной и вегетативной нервной системы. Вентромедиального гипоталамус (VMH), состоит из вентромедиального ядра (ВМН) и дугообразного ядра (ARC), имеет важное значение для центральной регуляции энергетического гомеостаза. Специализированный нейроны зондирования глюкозы, в VMH, ссылаются активность нейронов и периферийного гомеостаза глюкозы 1. Есть два типа глюкозы зондирования нейронов; глюкозы, возбуждаемые (GE) нейроны расти, а уровень глюкозы ингибирует (GI) нейроны уменьшить свою деятельность как внеклеточных глюкозы увеличивается. Нейроны VMH глюкозы зондирования, как правило, изучены с помощью электрофизиологии или потенциальную изображений чувствительный краситель кальция / мембраны.

Электрофизиологические техника патч зажим считается золотым стандартом при изучении экс естественных нейронной активности. В этой технике, стекло микропипетки электрод прикреплен к клеточной мембране с помощью высокой устойчивостью(ГОм) печать. Патч зажим электроды позволяют в режиме реального времени записи потенциала действия частоты (ток зажима) или ион проводимости (зажим напряжения) меняет в пределах одного нейрона. В то время как техника патч зажим предоставляет подробную информацию об изменениях в конкретных проводимостей ионных каналов, основным недостатком является то, что только один нейрон может наблюдаться одновременно. Это занимает примерно 30-45 мин записи, чтобы убедиться, что один находится в режиме записи от чувствительного к глюкозе нейрона даже до начала конкретного экспериментальное лечение. Кроме того, GI и GE нейроны составляют <20% от общей численности населения нейронов VMH. Усугубляет эту проблему, является отсутствие во многих случаях, из идентифицирующего сотовой маркера для этих нейронов. Таким образом, ясно, что, несмотря на ценную информацию электрический что другие методы не могут, анализ патч зажим является трудоемким, трудоемким и низкий выход.

Использование визуализации флуоресценции диссоциированных нейронов ВМХ позволяет для изучения хуndreds нейронов одновременно. Кальций чувствительные красители могут быть использованы для измерения внутриклеточного кальция изменений, которые косвенно коррелируют с изменением активности нейронов. Мембранный потенциал чувствительные красители используются для мониторинга изменений мембранного потенциала. Измерение сотовой мембранный потенциал является более прямой индекс активности нейронов по сравнению с изменениями в внутриклеточных уровней кальция. Кроме того, мембранный потенциал краситель (MPD) изображений потенциально распознает малейшие изменения мембранного потенциала, где потенциал действия стрельбы не изменяется и внутриклеточные уровни кальция может не измениться. Оба этих методов визуализации флуоресценции были использованы для изучения VMH нейроны чувствительных к глюкозе у мышей с ювенильного 2-7. В то время как результаты менее подробная, чем полученные с патч зажим электрофизиологии, прочность экспериментов изображений является то, что они одновременно оценить большое популяцию клеток, которые неизбежно включают в себя значительное количество глюкозы нейронами зондирования. MPD изображений яы особенно полезны для изучения GI нейроны, которые более равномерно локализован по всей VMH; таким образом обеспечивая адекватное население учиться в диссоциированной VMH (~ 15% GI). В отличие от этого, в то время как GE нейроны плотно локализованы в вентролатеральной-VMN и клеточной бедном регионе между АРК и VMN, они не представляют значительное число нейронов в пределах VMH (<1% GE). Кроме того, изучая изолированные нейроны, астроцитов и пресинаптические эффекты устраняются. Это может быть преимуществом в изучении последствий первого порядка нейронов, а также недостатком, поскольку физиологические соединений и процессов, будут потеряны.

Ограничивающим фактором в обоих патч зажим электрофизиологии и визуализации MPD / кальция красителя является необходимость использовать более молодых животных (например,. Мышей или крыс <возрасте 8 недель). Это преимущественно за счет увеличения соединительной ткани в сочетании с пониженной нейронной жизнеспособности, которое происходит с возрастом. В мозг-среза электрофизиологии шпильких годов, увеличилось соединительной ткани делает его более трудным для визуализации нейронов. Увеличение соединительной ткани также затрудняет отделить большое количество здоровых нейронов для визуальных исследований. Кроме того, нейроны от молодых животных живут дольше во время или записи патч зажим или изображений. Тем не менее, использование молодых мышей может быть основным ограничением. Активность нейронов и / или ответы на нейротрансмиттеров или циркулирующих питательных веществ меняются с возрастом. Например, так как энергетический баланс тесно связана с репродуктивного статуса, гипоталамуса нейроны, регулирующие энергетический баланс может иначе реагировать в предварительном против postpubescent животных. Кроме того, многие болезни требуют длительного лечения или не никак не проявляют до совершеннолетия. Ярким примером таких заболеваний являются пищевые ожирение или сахарный диабет 2 типа. Поскольку нейроны зондирования глюкозы, как полагают, играют определенную роль в этих болезней мы разработали методологию успешно культивирование здоровых взрослых VMH нейроны для использования в визуализации MPD ехрeriments.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Животные

  1. Все процедуры были одобрены Комитетом Институциональная уходу и использованию животных в Университете медицины и стоматологии Нью-Джерси на.
  2. Группа дом мужской мышей C57BL / 6 на 12 ч light/12 ч графику темной и позволяют вволю доступ к воде и пище. Жертвоприношение на 4-5 месяцев. Euthanasia из мышей проводили с использованием хирургической анестезии плоскость и вторичную форму эвтаназии (т.е. проникающей разрез в грудную полость через мембрану). Это согласуется с AVMA Руководящие принципы по эвтаназии.

2. Подготовка перфузии решение, покровные, стеклянных пипеток и СМИ

  1. Сделать 1L перфузии раствор, состоящий из 2,5 мМ KCl, 7 мм MgCl 2, 1,25 мМ NaH 2 PO 4, 28 мМ NaHCO 3, 0,5 мМ CaCl 2, 7 мМ глюкозы, 1 мМ аскорбата и 3 мМ пирувата в дистиллированной дН 2 O. Отрегулируйте осмолярность до ~ 300 мосм использованием приблизительно 80 г / л сахарозы. Кислородсодержащих путем пропускания с 95% O 2/5% СО 2 и доведения рН до 7,4. Каждый эксперимент потребует приблизительно 200 мл раствора перфузии. Аликвоты могут храниться при температуре -20 ° С в течение до 2 месяцев.
  2. Сделать 250 мл Neurobasal семенного материала, Neurobasal носитель без глюкозы, 2,5 мМ глюкозы и 100 ед / мл пенициллина стрептомицин. Отрегулируйте осмолярность акции Neurobasal до 280 мосм с использованием сахарозы. Сделать 500 мл Hibernate семенного материала, Hibernate-медиа без глюкозы, 2,5 мМ глюкозы и 100 ед / мл пенициллина стрептомицин.
  3. Перемешать обе акции также и фильтр-стерилизовать с помощью Stericup единиц вакуум-фильтра. Будьте осторожны, чтобы не вводить глюкозу или другие загрязнения через посуды или размешивать баров. Оберните бутылки в фольгу, чтобы защитить СМИ от света и хранить при температуре 4 ° С в течение до 2 месяцев.
  4. Пламя кончики 4 автоклавного стеклянных пипеток (9 в) так, чтобы кончики не являются лоNger острые и открытие диаметры большие (~ 0,9 мм), средний большой (~ 0,7 мм), средние (~ 0,5 мм), а мала (~ 0,3 мм). Крупнейший следует едва полированный и наименьший должно быть около трети этого диаметра.
  5. За день до сбора урожая нейронов, чистые четырех 25 мм покровные стекла с использованием 70% этанола и проходящих над пламенем горелки Бунзена. Место каждого покровное в стерильной 35 мм культуры блюдо и добавить 2 мл стерильной 1% поли-D-лизина в дН 2 O. Положите посуду в инкубаторе (37 ° C) в течение ночи. На следующий день, мыть стерильной дН 2 O 3-кратным и позволяют покровные, чтобы полностью высохнуть.
  6. Сделать 75 мкл аликвоты 1 М молочной кислоты и 200 мкл аликвоты Glutamax; хранить при -20 ° С Полностью разморозить аликвоты молочной кислоты и глютамаксом перед использованием, чтобы гарантировать однородность.
  7. В день нейронов уборки, составит 30 мл свежей культуральной среды, состоящие из Hibernate-семенного материала, 1 мМ молочную кислоту, 0,5 мм Glutamax, и 2% B27 без инсулина. ВоRTEX и отрегулировать рН до 7,4 с помощью 1 N NaOH.
  8. Поместите 10 мл культуральной среды в 60 мм стекл нную чашку Петри на льду, положить 2 мл в 15 мл коническую пробирку на льду и держать остальные носители при комнатной температуре.
  9. В день нейронов заготовки, сделать 25 мл свежей питательной среды, состоящие из Neurobasal сырья, содержащего 1 мМ молочной кислоты, 0,5 мМ глютамаксом и 2% B27 без инсулина. Vortex и отрегулировать рН до 7,4 с помощью 1 N NaOH. Разрешить свежий СМИ роста, чтобы уравновесить в инкубаторе (37 ° С, 5% СО 2) в течение не менее 30 мин.

3. Сердечная перфузии

  1. Полностью разморозить 200 решение перфузии мл и оксигенат с 95% O 2/5% СО 2 на льду в течение не менее 15 мин.
  2. Вымойте Vibratome лезвие с ацетоном, 70% этанолом, и ЦТ 2 O. Расположите лезвие в Vibratome.
  3. Промойте камеру охлаждения Vibratome и перфузии трубки с немецкой шкале 2 O. Заполните камеру охлаждения (4 ° С) С перфузии раствора и продолжают кислородом.
  4. Обезболить мышь пентобарбиталом натрия 50 мг / мл, разбавленный 1:01 стерильной водой, вводили внутрибрюшинно. Убедитесь, что мышь полностью под наркозом, зажимая хвост и не соблюдая никакой реакции.
  5. Налейте холодный раствор перфузии в резервуар перфузии и трубки непосредственно перед вскрытием. Сохранить 20-30 мл для мозга вскрытия и продолжают кислородом на льду. Гравитация поток от повышенной шприц 60 мл через трубки и 20 G игла обеспечивает достаточный поток. Разрешить решение работать до пузырьки воздуха не вымываются. Продолжайте кислородом.
  6. Сократите кожу над грудной клетки мыши. Поднимите грудную клетку и осторожно сделать горизонтальный разрез через диафрагму. Сделать две боковые порезы через грудную клетку вверх к оружию, чтобы разоблачить сердце. Используйте пинцет, чтобы сдержать грудную клетку.
  7. Сделайте небольшой 2 мм разрез в правом предсердии, чтобы обеспечить точку выхода для крови, чтобы быть вымыты из vascuЛар система.
  8. Прокол левого желудочка с перфузии иглы, достаточно вставить открытие иглы. Удерживая иглу в месте с одной стороны, и начать поток перфузии раствора с другой стороны. Через 10-15 мл перфузии раствора, кровь следует промыть и сточные воды очистит.

4. Мозг нарезки и Рассечение

  1. После сердечного кровоснабжения, передача кислородом холодной перфузии решение чашку Петри на льду непосредственно перед использованием.
  2. Быстро обезглавить, удалить мозг от черепа и поместить мозг в перфузии раствора. Чтобы удалить мозг: тянуть кожу вперед, сделать разрез по средней линии в черепе к глазниц, сделать 2 боковые порезы в сторону каждого глаза используйте щипцы, чтобы вытащить обратно каждую сторону черепа, сделать корональной разрез между глазниц, и использовать шпатель, чтобы мягко уговорить мозг из в перфузии раствора. Используйте ножницы, чтобы вырезать зрительные тракты при необходимости. Не прикасайтесь к гипоталамусас площади и не тяните зрительных трактов, потому что это ставит слишком много давления на срединного возвышения и подстилающей ткани гипоталамуса.
  3. Используйте лезвие и иглу для боков обрезать ткани мозга примерно на 3 мм задней и передней в гипоталамус то время как ткань погружают (брегма -3,52 мм). Это особенно важно для передней боковой вырез быть на одном уровне, так что мозг будет сидеть прямо на Vibratome патрона.
  4. Удалите остатки ткани мозга из раствора и использовать фильтровальную бумагу, чтобы фитиль от решения от установленного разделе мозга.
  5. Поместите каплю супер клей на Vibratome патрона и распространять клей с размером мозга. Положите ткань мозга в верхней части клея с передней стороной вниз и гипоталамус перед лезвие. Вика от избытка клея и поместить патрон в камеру охлаждения Vibratome. Будьте осторожны, чтобы не оставить много клея, как он будет пузыриться вокруг мозга при размещении в раствор.
  6. С vibratomэ установлен на малой скорости (уровень 2) и высокой амплитудой (9 уровень), не делают 300-500 мкм ломтиками до достижения гипоталамической области. Теперь сделайте тонкие 100 мкм ломтиками резки от задней к передней. Визуальные сигналы в следующем. Позади гипоталамуса третий желудочек будет очень мала (брегма -2,70 до -2,30 мм). В брегмы -2.30 мм, третий желудочек разделяется на спинной и брюшной разделов на корональной среза.
  7. После того, как участки третьего желудочка предохранителя, сделать два 500 мкм ломтиками, которые будут содержать правильный область VMH (брегмы -2,18 до -1,22 мм). не Передней к VMH, третий желудочек больше не распространяется на вентральной этаже головного мозга (брегма -1,06 до -0,82) 8.
  8. Передача этих срезов в чашку Петри на льду, содержащий культуральную среду. Рассеките VMH (ВМН + ARC), как показано на рисунке 1. С помощью пипетки осторожно переносить куски VMH в 2 мл культуральной среды на льду.

5. Разобщенность и культура

  1. Снимите VMH ото льда и поместите при комнатной температуре. Добавить 20 Ед / мл папаин в 4 мл культуральной среды. Обратить смешивать и место в водяной бане при 34 °. Проверьте и перемешать с помощью инверсии каждую минуту, пока пищеварение СМИ уже не дождь. Фильтр (0,22 мкм) в стерильной колбе и передачи ткани на пищеварение массовой информации.
  2. Дайджест ткани путем встряхивания при 100 оборотах в минуту при 34 ° С в течение 30 мин.
  3. Подготовка 1 мл среды, содержащей 8% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в течение пищеварения. Растворите 80 мг BSA в 1 мл культуральной среды и фильтр (0,22 мкм) в конической трубе.
  4. Промыть ткань путем передачи в 5 мл культуральной среды в коническую пробирку и медленно переворачивая один раз.
  5. Добавить 30 мкл ДНКазы фермента в 6 мл культуральной среды и смешать, чтобы сделать Растирание носитель. Аспирируйте стирке медиа и добавьте 3 мл тритурационного СМИ.
  6. Используйте стеклянные пипетки, обрабатывать в порядке лargest к меньшему. Аккуратно растирают 10x, а затем ждать 4 мин для больших кусков по урегулированию. С помощью второй пипетки для передачи верхние 2 мл, содержащие диссоциированной клеточной суспензии в новую коническую трубку. Добавить 2 мл Растирание СМИ, растирают в 10 раз и ждать 3 мин. С помощью третьего пипетки для передачи верхние 2 мл в клеточной суспензии. Добавьте 1 мл растирания СМИ, растирают 5x и ждать 2 мин. С помощью четвертого пипетки для передачи верхний 2 мл в клеточной суспензии.
  7. Слой диссоциированную клеточной суспензии в верхней части 8% BSA, стараясь не смешивать. Центрифуге при 1000 оборотах в минуту в течение 5 мин.
  8. Поместите автоклавного 6 мм х 8 мм клонирующих цилиндров в центре каждого покровное. Покровные должна быть полностью сухой. Аспирируйте и ресуспендируют осадок в 440 мкл теплой питательной среды. Заполните клонирования цилиндров с нейронным подвески и место в инкубаторе в течение 20 мин.
  9. Удалите клонирования цилиндров и очень аккуратно смыть мусор. Заполните каждое блюдо шго 2 мл питательной среды. Разрешить клетки для восстановления в течение по крайней мере 1 часа до того, как анализы выполняются.

6. Подготовка к MPD изображений

  1. Сделать запись раствор, состоящий из 121 мм NaCl, 4,7 мМ KCl, 2 мМ CaCl 2, 0,1 мМ MgCl 2, 1,2 мм MgSO 4, 0,97 мМ K 2 HPO 4, 0,23 мм KH 2 PO 4, 5 мМ NaHCO 3, и 25 мм HEPES. Отрегулируйте рН до 7,4.
  2. Добавить глюкозы, чтобы сделать желаемое решение низким тест глюкозы (0,1-2,0 ммоль глюкозы). Тщательно перемешать и зарезервировать 400 мл низкий решение для записи глюкозы. Добавить глюкозы в остальных 600 мл, чтобы сделать решение для записи 2,5 мМ глюкозы и тщательно перемешать.
  3. Защита от света краситель, насколько это возможно. Добавить 4 мл комнатной температуры буфера во флакон Синий MPD. Тщательно перемешать и добавить 5 мкл красителя за решение для записи мл. Хранить раствор гомогенным смешением с пипеткой между ними растворов. Краситель содержит флуоресцентный мolecules, которые входят клетки с деполяризации, и жажду молекул, которые не могут пересечь клеточную мембрану. Аликвоты можно хранить при -20 ° С и использовать в течение 4 дней. Не замораживания-оттаивания более одного раза.
  4. Инкубируйте клетки в 2 мл 2,5 мМ раствора глюкозы записи плюс красителя при 34 ° С в течение 30 мин. Сухой нагревательный блок может быть использован. Защита от света.
  5. Подготовка шприцевые насосы и системы перфузии с 2,5 мм и 0,1 мм решений записи плюс красителя. Трубки от 60 мл шприцы должны быть подключены к коллектору.
  6. После остановки любой насос, ждать ~ 10 сек перед включением решений в коллекторе для предотвращения повышения давления в шприце. Изменение давления подачи текучей среды изменять в закрытой камере, содержащей нейроны, вызывая изменения в фокусе микроскопа в ходе эксперимента и искажение изображений.
  7. Многообразие выход трубки должны быть подключены к нагревателя в линию, а затем полиэтиленовой трубкой, которая соединяется с закрытой камере. Пузырьки должны быть очищены и скорость перфузии должен быть установлен на 0,5 мл / мин. Защита от света.
  8. Трансфер 25 мм покровное с прилипшие нейронов в закрытой камере, стараясь не позволить покровное высохнуть и не вводить пузырьков воздуха. Скольжения выравнивается в пазах нижней части, пару капель раствора записи помещается по сторонам, а верхняя часть слегка установлены провести покровное на месте.
  9. Используйте капельницу, чтобы заполнить камеру раствором записи, а затем разместить 18 мм покровное на вершине. Осторожно подходит белое кольцо в камеру, чтобы держать меньший покровное на месте. Нажмите вниз очень медленно и слегка предотвращает образование воздушных пузырей из внедряются в закрытой камере.
  10. Запустите шприцевой насос для 2,5 мМ раствора записи глюкозы, надавите на белом кольце, и подключиться к закрытой камере. Медленно отпустите давление из белого кольца и соединить с трубкой приводит к контейнер для отходов.
е "> 7. MPD изображений

  1. Сосредоточьте нейроны использовании низкого светлое поле свет. Постарайтесь свести к минимуму количество времени, клетки подвергаются воздействию света.
  2. Позвольте системе перфузии запустить в течение 10 мин, чтобы обеспечить стабилизацию температуры, фокус, и красить равновесие.
  3. В то время как грунтовки, откройте программу Метаморф и взять яркий поля файл (10X) нейронов. Используйте функцию автофокусом взять 3 стеки флуоресцентных изображений (150 мсек, узкий Cy3 фильтр, 10x) и определяют основные направления в пределах 5 мкм. В конце 10 мин грунтовочного период, проверить фокусировку еще раз.
  4. Начните записывать флуоресцентные изображения каждые 30 сек в течение 40 мин. Установить базовую линию в 2,5 мМ глюкозы в течение 10 мин, затем уменьшить уровень глюкозы в течение 15 мин и, наконец, вернуться в 2,5 мМ глюкозы в течение 15 мин. Решения меняются, остановив шприцевой насос, ожидая 10 сек, превращая порт на многообразии, а начиная еще шприцевой насос. Изменения должны произойти впереди желаемых временных точках басед на лага между коллектором и клеток.
  5. После записи все флуоресцентные изображения, взять яркий поля файл нейронов.

8. Анализ MPD изображений

  1. Используйте Metamorph создать овальные районов вокруг каждой ячейки в светлом поле изображении, полученном в конце эксперимента. Регионы должны быть немного больше, чем каждого нейрона и могут быть сделаны 1 пиксель за пределами темного края клетки. Не выбирайте клетки, нездоровый, перекрытие, или близко к мусора. Нездоровые клетки часто выглядят темными. Наконец, создать 5 больших овальных регионов в районах, не имеющих клеток или их остатков для фоновых измерений.
  2. Перенесите регионы для всех флуоресцентных изображений и осмотрите, чтобы убедиться, что никакого движения / смена не произошло. Используйте функцию Measure для записи интенсивности флуоресценции каждого региона для всех изображений в файл Excel. Использование журналов в Metamorph рекомендуется.
  3. В Excel, создавать в среднем на 5 фоновых районах для каждого fluorescЛОР изображения. Это представляет собой среднее фоновое значение в каждый момент времени. Для каждого изображения / момент времени, вычитания фона от всех измерений региона. Фон вычитается интенсивность флуоресценции будет называться интенсивности будущей жизни.
  4. Для каждой ячейки, вычислить среднюю интенсивность во время минуты 2-8 записи. Это представляет собой базовый план ячейки в 2,5 мМ глюкозы. 2 минут буфер на обоих концах каждой обработки используется, чтобы минимизировать шум.
  5. Для каждой ячейки, рассчитать изменение по сравнению с исходным процентов: (Интенсивность базовым) / Базовый
  6. Создайте линейный график с изменением процента по сравнению с исходным против времени.
  7. Рассчитайте среднее процентное изменение по сравнению с исходным во время минуты 18-23. Рассчитайте среднее процентное изменение по сравнению с исходным во время минуты 35-40. В то время как обработка изображений не используется, шум снижается за счет усреднения интенсивности в каждом регионе клеток, вычитание фона и усреднения интенсивности области в течение 5 мин Oг больше.
  8. Контрольные эксперименты, в которых 2,5 мМ раствор глюкозы записи обменивается с 2,5 мМ раствора глюкозы записи должны быть выполнены, чтобы определить порог шума. Рассчитайте среднее процентное изменение по сравнению с исходным во время минуты 18-23 течение не менее 6 блюд и 3 мышей. Определить среднее значение и стандартное отклонение этих значений.
  9. Установите порог на положительный ответ деполяризации к среднему плюс 2 стандартных отклонения. Среднее плюс 2 стандартных отклонения соответствует разнице с р <0,05. Наши контрольные эксперименты показали изменения 10% от исходного уровня в качестве соответствующего порогового значения.
  10. Для каждой ячейки, оценить обратимый отклик деполяризации на основе 2 критериев. Во-первых, среднее изменение в процентах по сравнению с исходным в течение 18-23 минут должно быть больше 10%, порог определяется на предыдущем этапе. Во-вторых, среднее изменение в процентах от исходных условий в течение минуты 35-40 должно быть меньше половины среднего изменения от процентовисходных условий в течение минуты 18-23. Второй критерий был выбран, так как это было установлено, что более строгими, чем стимуляции глутамата или KCl. Нездоровые нейроны часто отвечают на стимуляцию глутамат или KCl, хотя их ответы на пониженной глюкозы не обратимы.
  11. Для каждого блюда, вычислить% от деполяризованных нейронов. Это значение используется для количественного определения% от GI нейронов между различными группами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Точная рассечение VMH от других гипоталамуса областях важно получить устойчивые результаты. Включение других местах может разбавить нейронов население VMH, изменяя% от деполяризованных нейронов расчетных. Кроме того, глюкозы нейроны зондирования были определены в других гипоталамуса регионах, таких как латерального гипоталамуса, которые могут функционально и механистически отличаться от ВМХ глюкозы зондирования нейронов. Рисунок 1 иллюстрирует правильные анатомические места для надлежащего вскрытия. В результате вышеуказанного протокола, мозговая ткань, содержащая правильное VMH регион может быть отделена. Далее рассечение точно отделить Vmn и ARC, сохраняя полноту каждой субпопуляции, может оказаться невозможным. Рисунок 2 показывает пример здорового диссоциирован VMH нейронов. Использование иммуноцитохимии, мы подтвердили, что наша подготовка> 90% нейронов. Только здоровые нейроны должны быть использованы для анализа парам данныхсестра и блюда слишком много нездоровых нейронов следует отказаться. Нейроны, которые нездоровой часто имеют очень темных кромок, взять на себя MPD в большей степени, и есть неправильные формы. Кроме того, нейроны должны быть высевали при плотности такого, что большинство нейроны не соприкасаются друг с другом во время записи. Нейроны, отобранные для анализа не должны касаться других клеток или мусора.

Данные, полученные из записей в GI нейрона и нейрона nonGI показаны на рисунке 3. После получения базовой линии в течение 10 мин, внеклеточный глюкоза снижалась от 2.5-0.1 мМ. GI нейрон показывает устойчивую обратимую реакцию большей, чем предопределенный порог 10% изменений от базовой линии. Увеличение флуоресценции отражает деполяризацию. В то время как ответы GE нейрон Гиперполяризация также обнаружены, частота слишком низкая (<1% нейронов) для успешного использования этой техники на этого подтипа глюкозы зондирования нейрона. Диапазон физиологических glucosЕ снижает были испытаны и процент ВМХ нейронов, которые обратимо деполяризуется была рассчитана для каждого блюда. Рисунок 4 показывает, что позитивные отношения существует между величиной снижения и процент деполяризующий нейроны глюкозы. Это показывает, что успешной первичной культуре мышиных нейронов у взрослых может быть использован в сочетании с флуоресцентной визуализации, чтобы позволить для изучения взрослых ВМХ GI нейронов.

Рисунок 1
Рисунок 1. Корональные части с маркерами для корректного VMH вскрытия. Расчлененный ткани содержит Vmn и ARC с минимальным загрязнения от других гипоталамуса областях. Диагональные сокращения должны быть сделаны из ~ 25-30% ниже верхней части третьего желудочка до ~ 25-30% между точкой, где кора отвечает гипоталамо область (синий *) и третьего желудочка(3 В). По материалам брегмы -2,8 мм Paxinos и Ватсон 1998 9, что соответствует мозга мыши брегмы-1,7 мм. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 2
Рисунок 2. Светлое изображение здоровых нейронов ВМХ от взрослой мыши. Эта фотография была сделана через 24 часа после диссоциации и была использована для работы с изображениями MPD. Несколько примеров нейронов, которые бы (синий *) или не будет (красный крестик) быть использованы для анализа помеченных. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 3
FНа рис 3. Представительства флуоресценции MPD следы GI нейрона (зеленая линия) и нейрона nonGI (оранжевая линия). Клетки перфузии с 2,5 мМ глюкозы (G) решение для записи в течение 10 мин, а затем снижением до 0,1 мм G в течение 15 мин и вернуться в 2,5 мм г в течение 15 мин. В желудочно-кишечном нейрона, изменение от исходного процентов увеличилась до более чем 10% в течение 0,1 мм г перфузии период (40% среднего по 20-25 мин) и снизился до менее половины этого прироста в 2,5 мм G разворота период (15 % в среднем от 35-40 мин). Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 4
Рисунок 4. Процент взрослых ВМХ нейронов, которые обратимо деполяризовать в ответ на пониженной глюкозу, обнаруженных с применением флуоресцентной томографии MPD.положительная связь существует между величиной снижения и процент деполяризующий нейроны глюкозы. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ключ к возможности изучить активность нейронов от взрослых мышей является возможность отделить здоровые нейроны. Разобщенность нейронов гипоталамуса от взрослых мышей сложнее в нескольких ключевых шагов в протоколе по сравнению с нейронами мышей несовершеннолетних. Мы преодолели эту проблему в несколькими способами. Создание толстые ломтики 500 мкм мозга минимизирует механическое повреждение нейронов по сравнению с обычными 250-350 мкм ломтиками, используемых для мозга от молодых мышей. Тем не менее, более толстые ломтики нуждаются в большем внимании к сердечной перфузии и папаином мозговой ткани. Если кровь увидеть на ткани головного мозга, оценить точность и размещение разреза в правом предсердии и иглу, помещены в левом желудочке. Скорость потока и количество перфузии раствора также можно регулировать. Тщательный перфузии важно, так как в крови является токсичным для нейронов и приведет к более низкой доходностью здоровых нейронов. Расщепление папаином должен быть достаточно эффективным, чтобы позволитьдля нежного растирания и легкого освобождения отдельных клеток из ткани головного мозга. Неэффективным папаин пищеварение подозревают, когда VMH ткани быстро тонет в конце пищеварения и когда крупные куски ткани присутствуют во втором растиранием. С хорошего пищеварения, кусочки ткани едва обнаруживается невооруженным глазом в течение третьего растирания. Если растирания не нежный, нейронов здоровье будет страдать. Если неэффективным папаин пищеварение подозревают, концентрация папаина может быть увеличена на 5 ед / мл или новый флакон папаина могут быть использованы. Однако концентрация папаин не должна быть увеличена выше 30 ед / мл, так как это может привести к ухудшению нейронов здоровье.

Риск на БСА является еще одним важным шагом в протоколе. После растирали клетки были центрифугировали на градиенте BSA, и количество времени нейронов подвергаются BSA и количество BSA оставаться с гранул должны быть минимизированы. Супернатант и градиент BSAСледует атмосферный сразу же после периода центрифугирования. Всасывания вакуума может быть использован, чтобы удалить большую часть надосадочной жидкости, но последний ~ 100 мкл, необходимо удалить вручную с помощью пипетки так, чтобы осадок клеток не нарушается. Другим важным аспектом получения здоровых нейронов заключается в оптимизации плотности клеток. Нейроны покрытием слишком редко, не так здорово. Так как очень немногие нейроны получали от каждого мозга мыши, это не практично для подсчета клеток перед покрытием. За время, что бы быть потрачены считая, значительное число клеток будет придерживаться пластика и будут потеряны. Использование 4 блюда на мышь (~ 1 х 10 4 клеток / мл) в качестве отправной точки, эмпирическое определение количества блюд является наиболее практичным подходом к достижению оптимальной плотности нейронов. Выход ВМХ нейронов из старых мышей можно ожидать, что около половины урожая от молодых мышей. Далее устранения неполадок, чтобы улучшить нейронов выход предполагает количественную оценку нейронов оставшийсяна каждом шаге протокола диссоциации, чтобы точно определить этапы тяжелой нейронов истощение.

Используя наш протокол, здоровые диссоциированные нейроны могут выжить в культуре до 2-3 дней. Тем не менее, использование фильтрованной астроцитов кондиционером питательной среды позволяет нейроны, чтобы выжить до 2 недель в культуре. СМИ роста может быть обусловлено инкубации на сливающихся первичных астроцитов в одночасье. Астроциты из того же штамма грызунов, пола и мозга региона должны быть использованы. Хотя использование астроцитов кондиционером СМИ вводит еще одну переменную, эта модификация может быть необходимо для альтернативных экспериментов, требующих больше времени в культуре. Более того, по причинам, которые не ясны, мы обнаружили, что способность чувствовать глюкозу легко теряется с субоптимальной нейронов здоровья, несмотря на содержание в ответ на другие стимулы, такие как глутамат. Таким образом, дополнительный следует соблюдать осторожность. Для наблюдения нейронные ответов на пониженной глюкозы, крайне важно, чтобы избежать contaminatiна бактериями, плесенью, соли, мыло, и глюкоза. Все изделия из стекла и нестерильных пластмассы должны быть тщательно вымыты с немецкой шкале 2 O. Кроме живых загрязнений, моющие средства и соли повлияет нейронов целостность и активность. Небольшие количества глюкозы может существенно изменить концентрацию глюкозы. Это нарушит результаты, так как нейроны зондирования глюкозы очень чувствительны к небольшим изменениям внеклеточной глюкозы в пределах nonhyperglycemic физиологического диапазона 0,1-2,5 мМ 10,11.

При использовании изображений MPD, последовательности и бок о бок экспериментов между группами лечения являются жизненно важными для значимых результатов. Различные группы обработки должны быть испытаны в тот же день, если это возможно, или по крайней мере на переменном дней. Это сводит к минимуму возможные варианты препаратов культуры или MPD аликвоты. Кроме того, мы обнаружили, что хотя бы изменение происходит, когда изображения осуществляется в течение 24 часов нейрона диссоциации по причинам, упомянутым выше. Поскольку результатыанализируются в% от деполяризующий нейронов, точность и последовательность в VMH рассечения и нейронов подготовки также является существенным. Общая численность населения VMH нейронов собирают должна быть постоянной и не должна содержать нейроны от других регионов. Таким образом, указанное протокол должен быть внимательно следил и точно. Однако, если альтернативные эксперименты должны быть выполнены и техническое обслуживание населения не имеет значения, мукотомы могут быть сделаны, чтобы изолировать Vmn или ARC нейронов.

Методы, описанные здесь установить, как собрать здоровые нейроны VMH от взрослой мыши и как использовать визуализацию MPD учиться глюкозы зондирования нейронов. Вместо этого, эксперименты могут быть разработаны, чтобы исследовать VMH нейрональные реакции на раздражители, кроме изменений глюкозы. Кроме того, протокол диссоциации можно экстраполировать на урожай нейронов из других областей мозга. Использование нейроны от взрослых мышей, исследования теперь могут быть выполнены с использованием модели мышиных заболеваний, которые развиваются или прогресс в возрасте. Moreoveг, здоровых взрослых нейронов может быть дополнительно изучены с помощью других, чем изображений MPD методы, такие как визуализации кальция, электрофизиологических, одноклеточного ПЦР, иммуногистохимии или комбинации этих методов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нам нечего раскрывать.

Acknowledgments

NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal-A Medium (Custom) Invitrogen 0050128DJ custom made glucose free
Hibernate-A Medium (Custom) BrainBits custom made glucose free
Penicillin streptomycin (20,000 U/ml) Invitrogen 15140 other vendors acceptable
Stericup vacuum filter units (0.22 μm) Millipore other vendors acceptable
25 mm Glass coverslips Warner #1 25mm round
18 mm Glass coverslips Warner #1 18mm round
GlutaMAX Invitrogen 35050
B27 minus insulin (50x) Invitrogen 0050129SA
Razor blade VWR 55411
Vibratome & cooling chamber Vibratome Series 1000 Sectioning system
Vibratome blades Polysciences 22370 injector or double edge blades from other vendors acceptable
Papain, suspension Worthington LS003124
BSA, suitable for cell culture Sigma other vendor acceptable
DNAse, for cell culture Invitrogen other vendor acceptable
cloning cylinders, 6 mm x 8 mm Bellco Glass 2090-00608
Membrane Potential Dye (blue) Molecular Devices R8042
In-line heater Warner SF-28
Syringe pumps WPI sp100i other vendor acceptable
Closed chamber Warner RC-43C
Polyethylene tubing Warner PE-90
Metamorph Molecular Devices alternate image analysis software acceptable
Microscope Olympus BX61 WI

used with 10X objective

Camera Photometrics Cool Snap HQ
Narrow Cy3 Filter Set Chroma 41007a
Illumination System Sutter Instruments Lambda DG-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Routh, V. H. Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant? Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).
  2. Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).
  3. Canabal, D. D., et al. Glucose, insulin, and leptin signaling pathways modulate nitric oxide synthesis in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. American journal of physiology. Reg. Integr. Comp. Physiol. 292, 1418-1428 (2007).
  4. Murphy, B. A., Fakira, K. A., Song, Z., Beuve, A., Routh, V. H. AMP-activated protein kinase and nitric oxide regulate the glucose sensitivity of ventromedial hypothalamic glucose-inhibited neurons. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C750-C758 (2009).
  5. Murphy, B. A., et al. Fasting enhances the response of arcuate neuropeptide Y-glucose-inhibited neurons to decreased extracellular glucose. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, C746-C756 (2009).
  6. Kang, L., et al. Glucokinase is a critical regulator of ventromedial hypothalamic neuronal glucosensing. Diabetes. 55, 412-420 (2006).
  7. Kang, L., et al. Prior hypoglycemia enhances glucose responsiveness in some ventromedial hypothalamic glucosensing neurons. Reg. Integr. Comp. Physiol. 294, R784-R792 (2008).
  8. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press. (2004).
  9. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4th edn, Academic Press. (1998).
  10. Song, Z., Levin, B. E., McArdle, J. J., Bakhos, N., Routh, V. H. Convergence of pre- and postsynaptic influences on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 50, 2673-2681 (2001).
  11. Song, Z., Routh, V. H. Differential effects of glucose and lactate on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 54, 15-22 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics