ממברנה דיי הדמיה אפשרית של ventromedial היפותלמוס נוירונים מעכברים בוגרים ללמוד גלוקוז חישה

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

פעילותם של נוירונים בודדים מעכברים בגיל מבוגרים ניתן ללמוד על ידי מתנער נוירונים מאזורים מסוימים במוח ובאמצעות הדמיה לצבוע פוטנציאל הממברנה ניאון. על ידי תגובות בדיקות לשינויים ברמת סוכר, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור את רגישות הגלוקוז של נוירונים ההיפותלמוס ventromedial מבוגרים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Vazirani, R. P., Fioramonti, X., Routh, V. H. Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing. J. Vis. Exp. (81), e50861, doi:10.3791/50861 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מחקרים של פעילות עצבית לעתים קרובות מבוצעים באמצעות נוירונים ממכרסמים פחות מ -2 חודשים של גיל בשל הקשיים הטכניים הקשורים לרקמת חיבור גוברת וירידה בכדאיות עצבית המתרחשות עם גיל. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה לניתוק של נוירונים ההיפותלמוס בריאים מעכברים בגיל מבוגר. היכולת ללמוד נוירונים מעכברים בוגרים בגיל מאפשרת שימוש במודלי מחלה המתבטא בגיל מאוחר יותר והוא עשוי להיות יותר מבחינה התפתחותית מדויק ללימודים מסוימים. דימות פלואורסצנטי של נוירונים ניתקו יכולה לשמש כדי לחקור את הפעילות של אוכלוסייה של נוירונים, בניגוד לשימוש באלקטרופיזיולוגיה ללמוד נוירון בודד. התכונה זו שימושית במיוחד כאשר לומד אוכלוסייה עצבית הטרוגניות שבהן הסוג העצבי הרצוי הוא נדיר כגון לתאי עצב גלוקוז חישת ההיפותלמוס. אנו מנוצלים הדמיה לצבוע פוטנציאל הממברנה של נוירונים ההיפותלמוס ventromedial מבוגרים ללמוד את התגובות שלהם לצ'הnges ברמת הגלוקוז החוץ תאי. הם האמינו נוירונים חישת הגלוקוז לשחק תפקיד בויסות מאזן אנרגיה מרכזית. היכולת ללמוד חישת הגלוקוז במכרסמים מבוגרים היא שימושית במיוחד מאז דומיננטיות של מחלות הקשורות לאיזון מתפקד אנרגיה (למשל. השמנת יתר) עם עלייה בגיל.

Introduction

המוח מווסת הומאוסטזיס אנרגיה באמצעות נוירואנדוקריניים ומערכת עצבים אוטונומית. ההיפותלמוס ventromedial (VMH), מורכב מגרעין ventromedial (VMN) וגרעין מקושת (ARC), הוא חשוב לרגולציה של הומאוסטזיס אנרגיה המרכזית. נוירונים חישת הגלוקוז מיוחדים, בתוך VMH, לקשר פעילות עצבית והומאוסטזיס הגלוקוז פריפרית 1. ישנם שני סוגים של גלוקוז חישת תאי עצב; גלוקוז נרגשים (GE) נוירונים להגדיל בעוד גלוקוז עכבות הנוירונים (GI) להקטין את פעילותם עם עלייה ברמת סוכר תאית. נוירונים גלוקוז VMH חישה בדרך כלל למדו באמצעות אלקטרופיזיולוגיה או הדמיה צבע סיד / קרום פוטנציאלי רגישה.

טכניקת מהדק תיקון אלקטרו נחשבת סטנדרטי במחקר של vivo לשעבר פעילות עצבית זהב. בטכניקה זו, אלקטרודה micropipette זכוכית מחוברת לממברנת התא באמצעות עמידות גבוההחותם (GΩ). אלקטרודות מהדק תיקון מאפשרות הקלטה בזמן אמת של תדר פוטנציאל פעולה (מהדק הנוכחי) או מוליכות יון (מהדק מתח) שינויים בתוך תא עצב יחיד. בעוד טכניקת מהדק התיקון מספקת מידע מפורט בנוגע לשינויים בconductances ערוץ יון מסוים, חסרון עיקרי הוא שרק אחד הנוירון עלול נצפה בכל פעם. זה לוקח בערך 30-45 דקות של הקלטה כדי לוודא שאחד הוא הקלטה מתא עצב חישת הגלוקוז, עוד לפני שמתחיל טיפול ניסיוני ספציפי. יתר על כן, תאי עצב במערכת העיכול ומהווים GE <20% מכלל האוכלוסייה העצבית VMH. הרכבה את הבעיה היא חוסר, במקרים רבים, של סמן סלולארי זיהוי לנוירונים אלה. לפיכך, ברור כי למרות מתן מידע בעל ערך חשמלי שטכניקות אחרות לא יכולים, ניתוח מהדק תיקון הוא מייגע, זמן רב ותשואה נמוכה.

השימוש בדימות פלואורסצנטי של תאי עצב VMH ניתקו מאפשרת לחקר hundreds של נוירונים בו זמנית. צבעים רגישים סידן ניתן להשתמש כדי למדוד שינויי סידן תוך תאי, אשר בעקיפין לתאם לשינויים בפעילות עצבית. צבעים רגישים פוטנציאל הממברנה משמשים לניטור שינויי פוטנציאל הממברנה. מדידת פוטנציאל הממברנה תאית היא מדד ישיר יותר של פעילות עצבית בהשוואה לשינויים ברמות סידן תוך תאי. יתר על כן, הדמיה קרום פוטנציאל צבע (MPD) שעלול להיות מזהה שינויים קטנים יותר בפוטנציאל הממברנה שבו ירי פוטנציאל פעולה לא משתנים ורמות סידן תוך תאי לא יכולות לשנות. שתי טכניקות ההדמיה הקרינה אלה נעשו שימוש כדי לחקור תאי עצב חישת הגלוקוז VMH מעכברים לנוער 2-7. אמנם תוצאות הן פחות מפורטות מאלו שהושגו עם אלקטרופיזיולוגיה מהדק תיקון, כוחו של ניסויי הדמיה הוא שהם בו זמנית להעריך אוכלוסייה גדולה של תאים שבהכרח כוללים מספר משמעותי של תאי עצב חישת הגלוקוז. i ההדמיה MPDזה שימושי במיוחד לחקר תאי עצב במערכת העיכול שהם יותר אחיד מקומיים לאורך כל VMH; וכך לספק אוכלוסייה מתאימה ללמוד בVMH ניתק (~ GI 15%). בניגוד לכך, בעוד שנוירונים GE בצפיפות מקומיים לventrolateral-VMN ותא באזור בין עניי ARC וVMN, הם לא מייצגים את מספר משמעותי של תאי עצב בתוך VMH (<1% GE). יתר על כן, על ידי לימוד נוירונים בודדים, astrocytic ואפקטי presynaptic בוטלו. זה יכול להיות יתרון בחקר ההשפעות של נוירון הצו ראשון, כמו גם חסרון שכן קשרים ותהליכים פיסיולוגיים הולכים לאיבוד.

גורם מגביל בשני אלקטרופיזיולוגיה מהדק התיקון והדמיה לצבוע MPD / סידן הוא הצורך בשימוש בבעלי חיים צעירים (למשל. עכברים או חולדות <8 שבועות של גיל). זה בעיקר בשל רקמת חיבור מוגברת בשילוב עם ירידת כדאיות עצבית המתרחשת עם גיל. בהרבעת אלקטרופיזיולוגיה מוח פרוסהies, רקמת חיבור מוגברת עושה את זה יותר קשה לדמיין את תאי העצב. רקמת חיבור גדל גם עושה את זה יותר קשה לנתק מספר גדול של תאי עצב בריאים לבדיקות הדמיה. יתר על כן, נוירונים מבעלי חיים צעירים לשרוד זמן רב יותר בזמן או הקלטת מהדק תיקון או הדמיה. עם זאת, השימוש בעכברים צעירים יכול להיות מגבלה העיקרית. פעילות ו / או תגובות לשליחים עצביים או חומרים מזינים במחזור עצבי משתנות עם גיל. לדוגמא, מאז מאזן אנרגיה קשור באופן הדוק למצב פוריות, נוירונים ההיפותלמוס ויסות מאזן אנרגיה עשויים להגיב באופן שונה ב- vs מראש חיות postpubescent. בנוסף, מחלות רבות דורשות טיפול לטווח ארוך או לא להתבטא עד לבגרות. דוגמאות מובהקות של מחלות כאלה הן השמנה או סוכרת מסוג 2 סוכרת תזונתית. מאז הם האמינו נוירונים חישת הגלוקוז לשחק תפקיד במחלות אלה פיתחנו מתודולוגיה לculturing הצלחת נוירונים VMH בוגר בריאים לשימוש בexp ההדמיה MPDeriments.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בעלי חיים

  1. כל ההליכים אושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטה לרפואה ורפואת השיניים של ניו ג'רזי.
  2. זכר בית הקבוצה עכברי C57BL / 6 בלוח זמנים חשוך שעות light/12 שעות 12 וגישה כרצונך מודעת מזון ומים מאפשרים. להקריב בגיל 4-5 חודשים. המתת חסד של העכברים בוצע באמצעות המטוס של הרדמה כירורגית וצורה משנית של המתת חסד (כלומר חודר חתך לתוך חלל החזה דרך הסרעפת). זה עולה בקנה אחד עם הנחיות AVMA על המתת חסד.

2. הכנת זלוף פתרון, coverslips, פיפטות זכוכית, ומדיה

  1. הפוך פתרון זלוף 1L המורכב 2.5 מ"מ KCl, 7 מ"מ MgCl 2, 1.25 מ"מ אא 2 PO 4, 28 מ"מ NaHCO 3, 0.5 מ"מ CaCl 2, 7 גלוקוז מ"מ, ascorbate 1 מ"מ, ו 3 פירובט מ"מ ב DH 2 O. מזוקק התאם את osmolarity ל~ 30V0 mOsm באמצעות כ 80 סוכרוז גר '/ ליטר. חמצן על ידי מבעבע עם 95% O 2/5% CO 2 ולהתאים את ה-pH 7.4. כל ניסוי ידרוש כ 200 מיליליטר של תמיסת זלוף. ניתן לאחסן aliquots ב -20 ° C עד 2 חודשים.
  2. הפוך 250 מיליליטר מניית Neurobasal המכילה תקשורת Neurobasal ללא גלוקוז, 2.5 גלוקוז מ"מ, ו100 U / ml פניצילין סטרפטומיצין. התאם את osmolarity של מניית Neurobasal 280 mOsm באמצעות סוכרוז. הפוך 500 מיליליטר מצב שינה מניות המכילות Hibernate-מדיה ללא גלוקוז, 2.5 גלוקוז מ"מ, ו100 U / ml פניצילין סטרפטומיצין.
  3. מערבבים את שני מניות טובות ומסנן לעקר שימוש ביחידות סינון ואקום Stericup. היזהר לא להכניס גלוקוז או מזהמים אחרים מבעד לסורגי כלי הזכוכית או מערבבים. לעטוף את הבקבוקים בנייר כסף כדי להגן על התקשורת מפני אור ולאחסן ב 4 ° C עד 2 חודשים.
  4. להבת הטיפים של 4 טפטפות autoclaved זכוכית (9 ב), כך שהטיפים לא loקטרים ​​חדים nger ופתיחה הם גדול (~ 0.9 מ"מ), בינוני גדול (~ 0.7 מ"מ), בינוני (~ 0.5 מ"מ), ו( ~ מ"מ 0.3) קטן. הגדול ביותר צריך להיות בקושי מלוטש והקטן ביותר צריך להיות כשליש מקוטר זה.
  5. ביום שלפני נוירונים קצירה, ארבעה coverslips זכוכית הנקי 25 מ"מ באמצעות 70% אתנול ועובר מעל להבת מבער בונזן. מניחים כל coverslip בצלחת תרבות 35 מ"מ סטרילי ולהוסיף 2 מיליליטר 1% פולי-D-ליזין סטרילי ב DH 2 O. שים את הכלים בחממה (37 מעלות צלזיוס) למשך לילה. למחרת, לשטוף עם סטרילי DH 2 O 3x ולאפשר coverslips לייבוש מלא.
  6. הפוך 75 aliquots μl של חומצה לקטית M 1 ו200 aliquots μl של Glutamax; חנות ב -20 ° C. מלא להפשיר aliquots של חומצה לקטית וGlutamax לפני השימוש כדי לוודא הומוגניות.
  7. ביום של נוירונים קציר, להפוך 30 מיליליטר של תקשורת בתרבות טרי בהיקף של Hibernate-מניות המכילות חומצה לקטית 1 מ"מ, 0.5mm Glutamax, ו2% B27 ללא אינסולין. Vortex ולהתאים את ה-pH 7.4 באמצעות 1 N NaOH.
  8. שים 10 מיליליטר של תקשורת בתרבות בצלחת פטרי זכוכית 60 מ"מ על קרח, לשים 2 מיליליטר בצינור חרוטי 15 מיליליטר על קרח ולשמור על התקשורת שנותרה בטמפרטורת חדר.
  9. ביום של נוירונים קציר, להפוך 25 מיליליטר של תקשורת צמיחה טריות בהיקף של מניית Neurobasal המכילה 1 מ"מ חומצה לקטית, 0.5 מ"מ Glutamax, ו2% B27 ללא אינסולין. ורטקס ולהתאים את ה-pH 7.4 באמצעות 1 N NaOH. לאפשר תקשורת הצמיחה טרי לאזן באינקובטור (37 ° C CO, 2 5%) לפחות 30 דקות.

3. זלוף לב

  1. מלא להפשיר 200 פתרון זלוף מיליליטר וחמצן עם 95% O 2/5% CO 2 על קרח לפחות 15 דקות.
  2. שטוף להב vibratome עם אצטון, אתנול 70%, וDH 2 O. מקם את הלהב בvibratome.
  3. יש לשטוף את חדר vibratome קירור וצינורות טפטוף עם DH 2 O. למלא את תא הקירור (4 ° C) עם פתרון זלוף וימשיך חמצן.
  4. הרדימי עכבר עם נתרן pentobarbital 50 מ"ג / מיליליטר, בדילול מלא 01:01 עם מים סטריליים, הזריק intraperitoneally. בדוק את העכבר הוא בהרדמה מלאה על ידי צובט את הזנב וההתבוננות ללא תגובה.
  5. יוצקים פתרון זלוף קר לתוך מאגר זלוף וצינורות רק לפני לנתיחה. חוסך 20-30 מיליליטר לנתיחה מוח וממשיך חמצן על קרח. זרימת כוח הכבידה ממזרק 60 מיליליטר גבוה דרך צינורות ו20 מחט G מספקת זרימה מספיק. אפשר פתרון לרוץ עד בועות אוויר נשטפות החוצה. המשך לחמצן.
  6. לקצץ עור מעל בית החזה של העכבר. הרם את בית החזה ולהפוך בזהירות חתך אופקי דרך הסרעפת. שני חתכים לרוחב דרך בית החזה לכיוון הידיים כדי לחשוף את הלב. שימוש במלקחיים כדי לבלום את בית החזה.
  7. לעשות חתך 2 מ"מ קטן באטריום הזכות לספק נקודת יציאה לדם להישטף אל מחוץ לvascuמערכת lar.
  8. לנקב את החדר השמאלי עם מחט זלוף, בדיוק מספיק כדי להכניס את פתיחת המחט. החזק את המחט במקום ביד אחת ולהתחיל את הזרימה של פתרון זלוף ביד השנייה. אחרי 10-15 מיליליטר של תמיסת זלוף, הדם צריך להיות דהוי והשפכים ינקה.

4. מוח חיתוך וDissection

  1. לאחר זלוף לב, העברה מחומץ פתרון זלוף קר בצלחת פטרי על קרח רק לפני השימוש.
  2. במהירות לערוף, להסיר את המוח מהגולגולת ולמקם את המוח לפתרון זלוף. כדי להסיר את המוח: למשוך עור קדימה, לעשות חתך קו האמצע בגולגולת לכיוון ארובות עיניים, לעשות 2 חתכים לרוחב לכיוון כל עין, להשתמש במלקחיים כדי למשוך בחזרה כל צד של הגולגולת, לעשות חתך העטרה בין ארובות עיניים, ו להשתמש במרית כדי לשדל את המוח בעדינות אל תוך פתרון זלוף. השתמש במספריים כדי לחתוך את קטעים האופטיים במידת צורך. האם לא לגעת hypothalamiשטח C ולא למשוך את השטחים האופטיים, כי זה מציב אותו על רוממות החציוני ורקמות ההיפותלמוס בסיסית יותר מדי לחץ.
  3. השתמש בסכין גילוח ומחט לקצץ רוחבי רקמת המוח אחורי כ 3 מ"מ וקדמי להיפותלמוס ואילו הרקמות היא שקועות (גבחת -3.52 מ"מ). זה חשוב במיוחד לצד החתך הקדמי להיות ברמה כל כך שהמוח יהיה לשבת ישר על צ'אק vibratome.
  4. הסר את רקמת המוח שנותרה מפתרון ולהשתמש בנייר סינון לפתיל משם פתרון מסעיף המוח רכוב.
  5. הנח טיפה של דבק סופר על צ'אק vibratome ולהפיץ את הדבק לגודל של המוח. שים את רקמת המוח בחלק העליון של הדבק עם הצד הקדמי פונה כלפי מטה וההיפותלמוס מול הלהב. דבק ומשם עודפים וויק למקם את צ'אק לתוך תא קירור vibratome. השתמש בזהירות לא להשאיר הרבה דבק כפי שהוא יהיה בועה סביב המוח כאשר הניח לפתרון.
  6. עם vibratomדואר מוגדר למהירות איטית (רמה 2) ומשרעת גבוהים (רמה 9), להפוך 300-500 מיקרומטר פרוסות עד שמגיע לאזור ההיפותלמוס. עכשיו לעשות 100 מיקרומטר פרוסות דקות חיתוך מהאחורי לקדמי. הרמזים החזותיים הם כדלקמן. אחורי להיפותלמוס החדר השלישי יהיה קטן מאוד (גבחת -2.70 ל-2.30 מ"מ). בגבחת -2.30 מ"מ, החדר השלישי מופרד לגב וחתכים הגחון על פרוסת העטרה.
  7. ברגע שחלקים של פתיל החדר השלישי, לעשות שתי 500 מיקרומטר פרוסות אשר תכיל את האזור הנכון של VMH (גבחת -2.18 ל-1.22 מ"מ). קדמי לVMH, החדר השלישי כבר לא משתרע על רצפת הגחון של המוח (גבחת -1.06 ל-0.82) 8.
  8. העבר את הפרוסות האלה לצלחת פטרי בתקשורת ותרבות המכיל קרח. לנתח את VMH (VMN + ARC) כפי שמוצג באיור 1. השתמש פיפטה להעביר בעדינות את פיסות VMH ב2 מיליליטר של תקשורת בתרבות על קרח.

5. דיסוציאציה ותרבות

  1. הסר את VMH מקרח ומניח בטמפרטורת חדר. הוסף 20 פפאין U / ml ל4 מיליליטר של תקשורת ותרבות. הפוך לערבב ומניחים באמבט מים C ° 34. בדוק ומערבבים על ידי היפוך מכל רגע עד תקשורת העיכול היא כבר לא מעוננת. לסנן (0.22 מיקרומטר) לתוך בקבוק סטרילי ולהעביר את הרקמה לתקשורת העיכול.
  2. לעכל את הרקמה על ידי טלטול ב100 סל"ד ב34 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
  3. הכן 1 מיליליטר של תקשורת המכילה 8% אלבומין בסרום שור (BSA) במהלך העיכול. ממיסים 80 BSA מ"ג ב 1 מיליליטר של תקשורת בתרבות ומסנן (0.22 מיקרומטר) לתוך צינור חרוטי.
  4. שטוף את הרקמה על ידי העברת 5 מיליליטר של תקשורת בתרבות בצינור חרוטי ולאט היפוך פעם אחת.
  5. הוספת אנזים DNase 30 μl עד 6 מיליליטר של תקשורת בתרבות ולערבב כדי להפוך את תקשורת טחינה דקה. לשאוב התקשורת לשטוף ולהוסיף 3 מיליליטר של תקשורת טחינה דקה.
  6. השתמש בטפטפות הזכוכית לtriturate בסדר הגודל של ליטרargest לקטן ביותר. בעדינות triturate 10x ולאחר מכן לחכות 4 דקות לחתיכות גדולות יותר להתיישב. השתמש פיפטה השנייה להעביר את 2 מיליליטר העליון המכיל השעיה תא ניתקת לצינור חרוטי חדש. הוסף 2 מיליליטר של תקשורת טחינה דקה, triturate 10x ולחכות 3 דקות. השתמש פיפטה השלישית להעביר את 2 מיליליטר העליון להשעית התא. הוסף 1 מיליליטר של תקשורת טחינה דקה, 5x triturate ולחכות 2 דקות. השתמש פיפטה הרביעית להעביר 2ml העליון להשעית התא.
  7. שכבת ההשעיה התא ניתק על גבי BSA 8%, נזהרת שלא לערבב. צנטריפוגה ב 1,000 סל"ד למשך 5 דקות.
  8. הנח מ"מ 6 מ"מ x 8 autoclaved שיבוט צילינדרים במרכזו של כל coverslip. Coverslips חייב להיות יבש לחלוטין. לשאוב וresuspend את הכדור ב440 תקשורת צמיחת μl חמה. מלא שיבוט צילינדרים עם ההשעיה העצבית ומקום בחממה עבור 20 דקות.
  9. הסר את צילינדרי שיבוט ומאוד בעדינות לשטוף את הפסולת. ממלא כל מנה wiה 2 מיליליטר של תקשורת צמיחה. לאפשר לתאים להתאושש במשך שעה לפחות 1 לפני כל מבחני מבוצעים.

6. הכנה לMPD הדמיה

  1. הפוך פתרון הקלטה בהיקף של 121 mM NaCl, 4.7 מ"מ KCl, 2 מ"מ CaCl 2, 0.1 מ"מ MgCl 2, 1.2 מ"מ MgSO 4, 0.97 מ"מ K 2 HPO 4, 0.23 מ"מ KH 2 PO 4, 5 מ"מ NaHCO 3, ו25 מ"מ HEPES. התאם את ה-pH 7.4.
  2. הוספת גלוקוז כדי להפוך את הפתרון הרצוי בדיקת גלוקוז נמוכה (.1-2.0 גלוקוז מ"מ). מערבבים היטב ולהזמין 400 מיליליטר פתרון הקלטת הגלוקוז נמוך. הוספת הגלוקוז ל600 מיליליטר שנותר כדי להפוך את פתרון הקלטת גלוקוז 2.5 מ"מ ומערבבים היטב.
  3. הגן על צבע מפני האור ככל האפשר. הוסף 4 מיליליטר של בטמפרטורת חדר הצפת לבקבוקון MPD הכחול. מערבבים היטב ומוסיף 5 צבע μl לפתרון הקלטת מיליליטר. שמור על פתרון הומוגני על ידי ערבוב עם פיפטה בין פתרונות. הצבע מכיל מ 'ניאוןolecules, אשר נכנסים תאים עם שלילת קוטביות, ומרווית מולקולות, שלא יכול לחצות את קרום התא. Aliquots עשויים להיות מאוחסנים ב -20 ° C ושימוש בתוך 4 ימים. אין להקפיא להפשיר יותר מפעם אחת.
  4. דגירה תאים ב 2 מיליליטר של תמיסת גלוקוז 2.5 מ"מ הקלטה בתוספת צבע ב34 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. ניתן להשתמש בלוק חימום יבש. להגן מפני אור.
  5. הכן את משאבות מזרק ומערכת זלוף עם 2.5 מ"מ ו0.1 פתרונות הקלטת מ"מ בתוספת צבע. צינורות מ60 מיליליטר מזרקים צריכים להיות מחוברים לסעפת.
  6. לאחר הפסקת כל משאבה, לחכות ~ 10 שניות לפני מעבר פתרונות בסעפת כדי למנוע הצטברות לחץ במזרק. שינויים בלחץ לשנות את אספקת נוזלים לתא הסגור המכיל את תאי העצב, וגורם לשינויים בפוקוס מיקרוסקופ במהלך הניסוי והעיוות של תמונות.
  7. צינורות פלט הסעפת צריכים להיות מחוברים לתנור ולאחר מכן צינורות פוליאתילן, המתחבר לתא סגור באופן מקוון. צריכה להיות מסומנות בועות ושיעור זלוף צריך להיות מוגדר 0.5 מיליליטר / דקה. להגן מפני אור.
  8. העבר 25 coverslip מ"מ עם נוירונים חסיד לחדר הסגור, נזהר שלא לאפשר coverslip להתייבש ולא להכניס בועות אוויר. תלוש מיושר בחריצים של פיסה התחתונה, כמה טיפות של פתרון הקלטה ממוקמת לאורך הצדדים, ואת פיסת העליונה מצוידת בעדינות להחזיק את coverslip במקום.
  9. השתמש טפטפת כדי למלא את החדר עם פתרון הקלטה ולאחר מכן במקום coverslip 18 מ"מ על העליונה. בעדינות להתאים טבעת לבנה לתוך התא להחזיק coverslip הקטן יותר במקום. לחץ כלפי מטה לאט מאוד וקל, כדי למנוע בועות אוויר מלהיות הציג לתוך התא הסגור.
  10. הפעל את משאבת המזרק לפתרון הקלטת גלוקוז 2.5 מ"מ, לחץ כלפי מטה על הטבעת הלבנה, ולהתחבר לתא הסגור. לאט לאט לשחרר את הלחץ מטבעת לבנה ולהתחבר לצינורות שמוביל למכל פסולת.
דואר "> 7. הדמיה MPD

  1. מרכז את נוירונים באמצעות אור השדה בהיר נמוך. נסה לצמצם את כמות הזמן שהתאים שנחשפו לאור.
  2. לאפשר למערכת זלוף לרוץ ל10 דקות, כדי לאפשר ייצוב הטמפרטורה, המיקוד, ולצבוע את שיווי המשקל.
  3. בזמן שהכין, פתח את תכנית MetaMorph ולקחת תמונת שדה בהירה (10X) של תאי העצב. השתמש בפונקצית Auto-Focus לקחת 3 ערימות של תמונות ניאון (150 אלפיות שניות, מסנן Cy3 צר, 10X) ולקבוע את הפוקוס בתוך 5 מיקרומטר. בתום התקופה תחול 10 דקות, בדוק את המוקד פעם נוספת.
  4. תתחיל להקליט תמונות ניאון כל 30 שניות ל40 דקות. להקים בסיס ב2.5 גלוקוז מ"מ עבור 10 דקות, ולאחר מכן להפחית את רמת הסוכר במשך 15 דקות, ולבסוף לחזור ל2.5 גלוקוז מ"מ ל15 דקות. פתרונות שונה על ידי עצירת משאבת מזרק, מחכה 10 שניות, הופך יציאה בסעפת, ומתחיל משאבת מזרק אחרת. שינויים צריכים להתרחש לפני ba נקודות זמן הרצויsed על הפיגור בין הסעפת והתאים.
  5. לאחר הקלטה את כל תמונות הניאון, לקחת תמונת שדה בהירה של הנוירונים.

8. ניתוח MPD הדמיה

  1. השתמש MetaMorph ליצור אזורים סגלגלים מסביב לכל תא בתמונה השדה הבהיר נלקחה בסוף הניסוי. אזורים צריכים להיות מעט גדולים יותר מכל נוירון ויכולים להתבצע פיקסל 1 מחוץ לקצה הכהה של התא. אין לבחור בתאים שאינם בריאים, חופפים, או בסמוך להריסות. תאים בריאים לעתים קרובות מופיעים כהים. לבסוף, ליצור 5 אזורים סגלגלים גדולים באזורים ללא תאים או פסולת למדידות רקע.
  2. העבר את האזורים לכל תמונות הניאון ולבדוק כדי לוודא שאין תנועה / שינוי התרחש. השתמש בפונקצית מדוד כדי להקליט את עוצמת הקרינה של כל אזור לכל התמונות בקובץ Excel. השימוש בכתבי עת בMetamorph מומלץ.
  3. ב-Excel, ליצור ממוצעת של 5 אזורי הרקע עבור כל fluorescתמונה אף אוזן גרון. זה מייצג את ערך הרקע הממוצע בכל נקודת זמן. עבור כל נקודת תמונה / שעה, לחסר רקע מכל המדידות באזור. עוצמת הקרינה מופחתת רקע יכונה להלן עוצמה.
  4. עבור כל תא, לחשב את העוצמה הממוצעת במהלך דקות 2-8 של הקלטה. זה מייצג את קו הבסיס של התא ב2.5 גלוקוז מ"מ. חיץ של 2 דקות בשני הקצוות של כל טיפול משמש כדי למזער את הרעש.
  5. עבור כל תא, לחשב את אחוז השינוי מנקודת התחלה: (Intensity-Baseline) / Baseline
  6. צור גרף קווים עם אחוז השינוי מנקודת ההתחלה לעומת זמן.
  7. לחשב את אחוז השינוי הממוצע מתחילת המחקר במהלך דקות 18-23. לחשב את אחוז השינוי הממוצע מתחילת המחקר במהלך דקות 35-40. אמנם לא נעשה שימוש בעיבוד תמונה, רעש מופחת דרך המיצוע של עוצמה בכל אזור תא, חיסור רקע, והמיצוע של אינטנסיביות האזור מעל 5 דקות or ארוך יותר.
  8. ניסויי שליטה בי 2.5 פתרון הקלטת גלוקוז מ"מ הוא החליף עם 2.5 פתרון הקלטת גלוקוז מ"מ חייבים להתבצע על מנת לקבוע את סף הרעש. לחשב את אחוז השינוי הממוצע מתחילת המחקר במהלך דקות 18-23 במשך לפחות 6 מנות ו3 עכברים. לקבוע את הסטייה הממוצעת וסטנדרטית של ערכים אלה.
  9. לקבוע את הסף לתגובת שלילת קוטביות חיובית לממוצע בתוספת 2 סטיות תקן. ממוצע פלוס 2 סטיות תקן מתאימה להבדלים עם p <0.05. ניסויי השליטה שלנו גילו שינוי 10% מנקודת ההתחלה כערך הסף המתאים.
  10. עבור כל תא, להעריך את תגובת שלילת קוטביות הפיכה המבוססת על 2 קריטריונים. ראשית, אחוז השינוי הממוצע מתחילת המחקר במהלך דקות 18-23 חייב להיות גדול מ 10%, הסף שנקבע בשלב הקודם. שנית, אחוז השינוי הממוצע מתחילת המחקר במהלך דקות 35-40 חייב להיות פחות ממחצית אחוז השינוי הממוצע מנקודת התחלה במהלך דקות 18-23. הקריטריון השני נבחר שכן הוא נמצא להיות יותר קפדני מאשר גירוי עם גלוטמט או KCl. נוירונים בריאים לעתים קרובות מגיבים לגירוי עם גלוטמט או KCl למרות שהתגובות שלהם לגלוקוז ירד אינן הפיכים.
  11. לכל מנה, לחשב% מתאי עצב depolarized. ערך זה משמש לכמת% מתאי עצב במערכת העיכול בקרב קבוצות טיפול שונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הנתיחה המדויקת של VMH הרחק מאזורי ההיפותלמוס אחרים היא חשובה כדי להשיג תוצאות עקביות. הכללת אזורים אחרים יכולה לדלל את האוכלוסייה העצבית VMH, שינוי% מתאי עצב depolarized המחושב. יתר על כן, תאי עצב חישת הגלוקוז זוהו באזורי ההיפותלמוס אחרים, כגון ההיפותלמוס לרוחב, שעשויות להיות שונה מבחינה תפקודית ואופן מכניסטי מתא עצב גלוקוז חישת VMH. איור 1 מדגים את המקומות אנטומיים הנכונים לנתיחה תקינה. בעקבות הפרוטוקול לעיל, יכולה להיות מנותקת רקמת המוח המכילה את אזור VMH הנכון. נתיחה נוספת להפריד בדיוק VMN וARC, תוך שמירה על השלמות של כל subpopulation, לא יכולה להיות אפשרית. איור 2 מראה דוגמא של בריא ניתקה נוירונים VMH. באמצעות immunocytochemistry, אנו מאשרים כי ההכנה שלנו היא עצבי> 90%. יש להשתמש רק נוירונים בריאים לanaly נתוניםאחותי ומנות עם יותר מדי תאי עצב בריאים צריכה להיות מושלכות. נוירונים שהם לא בריאים לעתים קרובות יש קצוות כהים מאוד, לקחת את MPD במידה רבה יותר, ויש להם צורות לא סדירות. בנוסף, צריכים להיות מצופים הנוירונים בצפיפות כזו שרוב הנוירונים לא נוגעים זה בזה במהלך הקלטה. נוירונים שנבחרו לניתוח לא צריכים להיות נגיעה תאים או פסולת אחרים.

נתונים שהתקבלו מהקלטות של נוירון במערכת העיכול ונוירון nonGI מוצגים באיור 3. לאחר קבלת בסיס ל10 דקות, גלוקוז תאי ירד 2.5-0.1 מ"מ. נוירון במערכת העיכול מראה תגובה הפיכה חזקה גבוהה מהסף שנקבע מראש של שינוי 10% מנקודת ההתחלה. העלייה בקרינה משקפת שלילת קוטביות. בעוד תגובות hyperpolarization נוירון GE גם מזוהות, בתדירות נמוכה מדי (<נוירונים 1%) לשימוש מוצלח של טכניקה זו בתת סוג זה של נוירון חישת הגלוקוז. מגוון glucos הפיזיולוגיירידות דואר נבדקו והאחוז של נוירונים VMH שdepolarized הפיך חושבו לכל מנה. איור 4 מראה כי מערכת יחסים חיוביים שורר בין סדר הגודל של ירידת רמת הסוכר ואחוז depolarizing הנוירונים. זה מוכיח כי תרבות העיקרית מוצלחת של נוירונים עכבריים מבוגר יכולה לשמש בשילוב עם דימות פלואורסצנטי כדי לאפשר המחקר של תאי עצב במערכת העיכול למבוגרים VMH.

איור 1
איור 1. סעיף העטרה עם סמנים לנתיחה VMH נכונה. הרקמה גזור מכילה VMN וARC עם זיהום מינימאלי מאזורי ההיפותלמוס אחרים. חתכים אלכסוניים צריכים להיות עשויים מ~ 25-30% מתחת לחלק העליון של החדר השלישי ל~ 25-30% בין הנקודה שבה הקליפה פוגשת את אזור ההיפותלמוס (* כחול) והחדר השלישי(3V). מעובד מתוך גבחת -2.8 מ"מ פקסינוס ווטסון 1998 9, המקביל ל-גבחת 1.7mm מוח העכבר. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2
איור 2. תמונת brightfield של נוירונים VMH בריאים מעכבר בוגר. תמונה זו צולמה 24 שעות לאחר ניתוק וכבר משמשת הדמיה MPD. כמה דוגמאות של נוירונים שהיו (* כחול) או לא (x האדום) לשמש לניתוח מסומנים. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3
Figure 3. עקבות הקרינה MPD נציג של תא עצב במערכת העיכול (קו ירוק) ונוירון nonGI (קו כתום). תאים היו perfused עם 2.5 גלוקוז מ"מ פתרון (G) הקלטה ל10 דקות, ואחרי ירידה ל0.1 מ"מ G במשך 15 דקות ו לחזור ל2.5 מ"מ G במשך 15 דקות. בתא העצב במערכת העיכול, השינויים באחוזים, מנקודת ההתחלה עלו ל מעל 10% במהלך תקופת 0.1 מ"מ G זלוף (הממוצע 40% 20-25 דקות) וירדו ל פחות ממחצית מעלייה זו בתקופה 2.5 מ"מ G ההיפוך (15 ממוצע% 35-40 דקות). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 4
איור 4. אחוז נוירונים VMH המבוגר אשר הפיך depolarize בתגובה לירידה ברמת סוכר בזוהה באמצעות ההדמיה MPD ניאון.קשר חיובי קיים בין סדר הגודל של ירידת רמת הסוכר ואחוז depolarizing הנוירונים. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המפתח ליכולת ללמוד פעילות של נוירונים מעכברים בוגרים הוא היכולת לנתק את תאי העצב בריאים. דיסוציאציה של נוירונים ההיפותלמוס מעכברים בוגרים קשה יותר בכמה שלבים עיקריים בפרוטוקול בהשוואה לנוירונים מעכברים לנוער. יש לנו להתגבר על בעיה זו במספר הדרכים. מה שהופך את פרוסות 500 מוח מיקרומטר עבות ממזער את הנזק מכאני לתאי עצב בהשוואה ל 250-350 מיקרומטר הפרוסות הרגילות המשמשות לרקמת מוח מעכברים צעירים יותר. עם זאת, פרוסות עבות יותר דורשות תשומת לב רבה יותר לזלוף לב ועיכול פפאין של רקמת המוח. אם הדם נראה על רקמת המוח, להעריך את הדיוק ומיקום של הקיצוץ בעלייה הימנית ואת המחט ממוקמת בחדר השמאלי. יכולים גם להיות מותאמת קצב הזרימה והכמות של פתרון זלוף. זלוף יסודי הוא הכרחי שכן דם הוא רעיל לתאי העצב ויגרום לתשואה נמוכה יותר של תאי עצב בריאים. עיכול פפאין חייב להיות יעיל מספיק כדי לאפשרלטחינה דקה ועדינה שחרור קל של תאים בודדים מרקמת המוח. עיכול פפאין יעיל חשוד כאשר רקמת VMH שוקעת במהירות בסוף העיכול וכאשר חלקי רקמה גדולים יותר נמצאים בטחינה הדקה השנייה. לעיכול טוב, חתיכות רקמה בקושי זוהו על ידי עין בלתי מזוינת בטחינה הדקה השלישית. אם טחינה דקה היא לא עדינה, בריאות עצבית תסבול. אם עיכול פפאין יעיל פי חשד, את הריכוז של פפאין יכול להיות מוגבר על ידי 5 U / ml או בקבוקון חדש של פפאין יכול לשמש. עם זאת, ריכוז פפאין לא צריך להיות מוגבר מעל 30 U / ml שכן זה יכול לפגוע בבריאות עצבית.

החשיפה לBSA היא עוד שלב קריטי בפרוטוקול. תאי triturated אחרי כבר centrifuged על שיפוע BSA, גם את הסכום של נוירונים זמן נחשפים לBSA והסכום של BSA הורשו להישאר עם גלולה צריך להיות ממוזער. Supernatant ושיפוע BSAצריך להישאף מייד לאחר תקופת צנטריפוגה. שאיבת אבק יכולה לשמש כדי להסיר את רוב supernatant, אבל ~ 100 μl האחרון יש להסיר באופן ידני עם פיפטה כך שהתא גלולה לא יופרע. היבט חשוב נוסף של קבלת נוירונים בריאים הוא לייעל צפיפות תאים. נוירונים מצופים מדי דלילות לא בריאים באותה מידה. מאז כל כך מעט תאי עצב מתקבלים ממוח עכבר, זה לא מעשי לספור תאים לפני ציפוי. במהלך הזמן שיהיה בילה לספור, מספר משמעותי של תאים הייתי לדבוק בפלסטיק ויהיה אבוד. באמצעות 4 מנות לכל עכבר (~ 1 x 10 4 תאים / מיליליטר) כנקודת התחלה, נחישות אמפירית של מספר המנות היא הגישה המעשית ביותר להשגת צפיפות נוירון אופטימלית. התשואה של נוירונים VMH מעכברים מבוגרים יכולה להיות צפויה להיות כמחצית מהתשואה מעכברים צעירים. נוסף לפתרון בעיות כדי לשפר את תשואת נוירון כרוך כימות של הנוירונים שנותרהבכל שלב של פרוטוקול דיסוציאציה כדי לאתר במדויק את הפעולות ההתשה עצבית כבדה.

שימוש בפרוטוקול שלנו, נוירונים ניתקו בריאים יכולים לשרוד בתרבות עד 2-3 ימים. עם זאת, השימוש בתקשורת צמיחת מיזוג astrocyte המסונן מאפשר נוירונים לשרוד עד 2 שבועות בתרבות. יכולה להיות מותנית תקשורת צמיחה על ידי דוגרים על האסטרוציטים עיקריים מחוברות הלילה. האסטרוציטים מאותו הזן של המכרסמים, המין והאזור במוח צריכים להיות מנוצלים. בעוד שהשימוש במדיה ממוזג astrocyte מציג משתנה אחרת, שינוי זה עשוי להיות נחוץ לניסויים אלטרנטיביים הדורשים יותר זמן בתרבות. יתר על כן, מסיבות שאינן ברורים, מצאנו כי היכולת לחוש גלוקוז הולכת לאיבוד בקלות עם בריאות עצבית לא טובים, למרות התחזוקה של תגובות לגירויים אחרים, כגון גלוטמט. לפיכך, יש לנקוט בטיפול נוסף. כדי לצפות תגובות עצביות לגלוקוז ירד, זה הכרחי כדי למנוע contaminatiעל ידי חיידקים, עובש, מלחים, סבון, וגלוקוז. כל כלי הזכוכית ופלסטיק לא סטרילי יש לשטוף ביסודיות עם DH 2 O. חוץ מחי מזהמים, חומרי ניקוי ומלחים ישפיעו על שלמות ופעילות עצביות. כמויות קטנות של גלוקוז יכולים לשנות באופן משמעותי את ריכוזי גלוקוז. זה ישבש את תוצאות מאז נוירונים חישת הגלוקוז רגישים מאוד לשינויים קטנים ברמת סוכר תאית בטווח הפיזיולוגי nonhyperglycemic של 0.1-2.5 מ"מ 10,11.

כאשר ניצול ההדמיה MPD, עקביות וניסויים Side-by-צד בין קבוצות טיפול חיוניים לתוצאות משמעותיות. קבוצות טיפול שונות צריכים להיבדק באותו היום אם אפשר, או לפחות בימים לסירוגין. זה ממזער וריאציות אפשריות בהכנות תרבות או aliquots MPD. בנוסף, מצאנו את הווריאציה לפחות מתרחשת כאשר ההדמיה מתבצעת תוך 24 שעות של ניתוק נוירון לסיבות שהוזכרו לעיל. מאז תוצאותמנותחים כ% מdepolarizing נוירונים, דיוק ועקביות בנתיחת VMH והכנה עצבית הוא גם חיוני. האוכלוסייה העצבית הכללית VMH נקטפה חייבת להיות קבועה ולא חייב להכיל נוירונים מאזורים אחרים. לפיכך, הפרוטוקול הנ"ל צריך להיות במעקב צמוד ובדייקנות. עם זאת, אם ניסויים חלופיים הם שיש לבצע ותחזוקת אוכלוסייה היא לא דאגה, יכולים להתבצע אגרופים רקמות לבודד תאי עצב VMN או ARC.

השיטות שתוארו כאן להקים איך לקצור נוירונים VMH בריאים מעכבר בוגר וכיצד להשתמש בהדמית MPD ללמוד נוירונים גלוקוז חישה. במקום זאת, יכול להיות מתוכנן ניסויים כדי לבחון את התגובות עצביות VMH לגירויים אחרים מאשר שינויי גלוקוז. לחלופין, פרוטוקול דיסוציאציה ניתן להסיק על נוירונים אסיף מאזורים אחרים במוח. שימוש בתאי עצב של עכברים בוגרים, יכולים כעת להתבצע מחקרים תוך שימוש במודלים עכבריים מחלה שמתפתחים או התקדמות עם גיל. Moreover, נוירונים בוגרים ובריאים ניתן ללמוד עוד יותר תוך שימוש בטכניקות אחרות מאשר ההדמיה MPD כגון הדמיה סידן, אלקטרופיזיולוגיה, תא בודד PCR, immunocytochemistry או שילוב של טכניקות אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש לנו מה למסור.

Acknowledgments

NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal-A Medium (Custom) Invitrogen 0050128DJ custom made glucose free
Hibernate-A Medium (Custom) BrainBits custom made glucose free
Penicillin streptomycin (20,000 U/ml) Invitrogen 15140 other vendors acceptable
Stericup vacuum filter units (0.22 μm) Millipore other vendors acceptable
25 mm Glass coverslips Warner #1 25mm round
18 mm Glass coverslips Warner #1 18mm round
GlutaMAX Invitrogen 35050
B27 minus insulin (50x) Invitrogen 0050129SA
Razor blade VWR 55411
Vibratome & cooling chamber Vibratome Series 1000 Sectioning system
Vibratome blades Polysciences 22370 injector or double edge blades from other vendors acceptable
Papain, suspension Worthington LS003124
BSA, suitable for cell culture Sigma other vendor acceptable
DNAse, for cell culture Invitrogen other vendor acceptable
cloning cylinders, 6 mm x 8 mm Bellco Glass 2090-00608
Membrane Potential Dye (blue) Molecular Devices R8042
In-line heater Warner SF-28
Syringe pumps WPI sp100i other vendor acceptable
Closed chamber Warner RC-43C
Polyethylene tubing Warner PE-90
Metamorph Molecular Devices alternate image analysis software acceptable
Microscope Olympus BX61 WI

used with 10X objective

Camera Photometrics Cool Snap HQ
Narrow Cy3 Filter Set Chroma 41007a
Illumination System Sutter Instruments Lambda DG-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Routh, V. H. Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant? Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).
  2. Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).
  3. Canabal, D. D., et al. Glucose, insulin, and leptin signaling pathways modulate nitric oxide synthesis in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. American journal of physiology. Reg. Integr. Comp. Physiol. 292, 1418-1428 (2007).
  4. Murphy, B. A., Fakira, K. A., Song, Z., Beuve, A., Routh, V. H. AMP-activated protein kinase and nitric oxide regulate the glucose sensitivity of ventromedial hypothalamic glucose-inhibited neurons. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C750-C758 (2009).
  5. Murphy, B. A., et al. Fasting enhances the response of arcuate neuropeptide Y-glucose-inhibited neurons to decreased extracellular glucose. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, C746-C756 (2009).
  6. Kang, L., et al. Glucokinase is a critical regulator of ventromedial hypothalamic neuronal glucosensing. Diabetes. 55, 412-420 (2006).
  7. Kang, L., et al. Prior hypoglycemia enhances glucose responsiveness in some ventromedial hypothalamic glucosensing neurons. Reg. Integr. Comp. Physiol. 294, R784-R792 (2008).
  8. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press. (2004).
  9. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4th edn, Academic Press. (1998).
  10. Song, Z., Levin, B. E., McArdle, J. J., Bakhos, N., Routh, V. H. Convergence of pre- and postsynaptic influences on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 50, 2673-2681 (2001).
  11. Song, Z., Routh, V. H. Differential effects of glucose and lactate on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 54, 15-22 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics