झिल्ली वयस्क चूहों से ventromedial Hypothalamus न्यूरॉन्स की संभावित डाई इमेजिंग ग्लूकोज सेंसिंग अध्ययन करने के लिए

Neuroscience

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Summary

वयस्क आयु वर्ग के चूहों से एकल न्यूरॉन्स की गतिविधियों विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों से न्यूरॉन्स अलग कर और फ्लोरोसेंट झिल्ली संभावित डाई इमेजिंग का उपयोग करके अध्ययन किया जा सकता है. ग्लूकोज में परिवर्तन करने के लिए परीक्षण प्रतिक्रियाओं से, यह तकनीक वयस्क ventromedial हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स की ग्लूकोज संवेदनशीलता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Vazirani, R. P., Fioramonti, X., Routh, V. H. Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing. J. Vis. Exp. (81), e50861, doi:10.3791/50861 (2013).

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Abstract

Neuronal गतिविधि का अध्ययन अक्सर कारण बढ़ रही संयोजी ऊतक के साथ जुड़े तकनीकी कठिनाइयों को कृन्तकों उम्र के कम से कम 2 महीने से न्यूरॉन्स का उपयोग किया जाता है और उम्र के साथ होते हैं कि neuronal व्यवहार्यता घट रहे हैं. यहाँ, हम वयस्क आयु वर्ग के चूहों से स्वस्थ hypothalamic न्यूरॉन्स की हदबंदी के लिए एक पद्धति का वर्णन. वयस्क आयु वर्ग के चूहों से न्यूरॉन्स अध्ययन करने की क्षमता एक बाद की उम्र में प्रकट और कुछ अध्ययनों के लिए अधिक developmentally सही हो सकता है कि बीमारी मॉडल के उपयोग की अनुमति देता है. एक न्यूरॉन का अध्ययन करने के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग करने के लिए विरोध के रूप में अलग न्यूरॉन्स के प्रतिदीप्ति इमेजिंग, न्यूरॉन्स की आबादी की गतिविधि का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वांछित neuronal प्रकार इस तरह के हाइपोथैलेमस ग्लूकोज संवेदन न्यूरॉन्स के लिए के रूप में दुर्लभ है जिसमें एक विषम neuronal आबादी का अध्ययन करने पर यह विशेष रूप से उपयोगी है. हम चा करने के लिए उनकी प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए वयस्क ventromedial hypothalamic न्यूरॉन्स की झिल्ली संभावित डाई इमेजिंग उपयोगकोशिकी ग्लूकोज में nges. ग्लूकोज संवेदन न्यूरॉन्स ऊर्जा संतुलन के केंद्रीय विनियमन में एक भूमिका निभा माना जाता है. वयस्क कृन्तकों में ग्लूकोज संवेदन अध्ययन करने की क्षमता बेकार ऊर्जा संतुलन (जैसे. मोटापा) उम्र के साथ वृद्धि से संबंधित रोगों की प्रबलता के बाद से विशेष रूप से उपयोगी है.

Introduction

मस्तिष्क neuroendocrine और स्वायत्त तंत्रिका प्रणाली के माध्यम से ऊर्जा homeostasis को नियंत्रित करता है. ventromedial हाइपोथेलेमस (VMH), ventromedial नाभिक (VMN) और धनुषाकार नाभिक (एआरसी) के शामिल, ऊर्जा homeostasis के केंद्रीय विनियमन के लिए महत्वपूर्ण है. विशिष्ट ग्लूकोज संवेदन न्यूरॉन्स, VMH भीतर, neuronal गतिविधि और परिधीय ग्लूकोज homeostasis 1 लिंक. ग्लूकोज उत्साहित (जीई) ग्लूकोज (सैनिक) न्यूरॉन्स कोशिकी ग्लूकोज बढ़ जाती है के रूप में अपनी गतिविधि को कम हिचकते हैं, जबकि न्यूरॉन्स वृद्धि, न्यूरॉन्स संवेदन ग्लूकोज के दो प्रकार के होते हैं. VMH ग्लूकोज संवेदन न्यूरॉन्स आम तौर पर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी या कैल्शियम / झिल्ली संभावित संवेदनशील डाई इमेजिंग अध्ययन का उपयोग कर रहे हैं.

electrophysiological पैच दबाना तकनीक पूर्व vivo neuronal गतिविधि के अध्ययन में स्वर्ण मानक माना जाता है. इस तकनीक में, एक गिलास micropipette इलेक्ट्रोड एक उच्च प्रतिरोध के माध्यम से कोशिका झिल्ली से जुड़ा हुआ है(GΩ) मुहर. पैच दबाना इलेक्ट्रोड कार्रवाई संभावित आवृत्ति (वर्तमान दबाना) या आयन प्रवाहकत्त्व (वोल्टेज दबाना) की वास्तविक समय रिकॉर्डिंग एक न्यूरॉन के भीतर परिवर्तन की अनुमति. पैच दबाना तकनीक विशिष्ट आयन चैनल conductances में परिवर्तन के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान करता है, एक बड़ी खामी केवल एक न्यूरॉन एक समय में मनाया सकता है. यह भी एक विशिष्ट प्रयोगात्मक उपचार शुरू होने से पहले एक ग्लूकोज संवेदन न्यूरॉन से एक है कि रिकॉर्डिंग है सत्यापित करने के लिए रिकॉर्डिंग के लगभग 30-45 मिनट लगते हैं. इसके अलावा, सैनिक और जीई न्यूरॉन्स <कुल VMH neuronal आबादी का 20% शामिल है. इस समस्या को और जटिल इन न्यूरॉन्स के लिए एक पहचान सेलुलर मार्कर के कई मामलों में कमी,, है. इस प्रकार, यह स्पष्ट है कि अन्य तकनीकों, पैच दबाना विश्लेषण श्रमसाध्य है नहीं कर सकते हैं कि मूल्यवान विद्युत जानकारी, समय लेने वाली और कम उपज प्रदान करने के बावजूद.

अलग VMH न्यूरॉन्स के प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग हू के अध्ययन के लिए अनुमति देता हैएक साथ न्यूरॉन्स की ndreds. कैल्शियम संवेदनशील रंगों परोक्ष रूप से neuronal गतिविधि में परिवर्तन से संबद्ध हों जो intracellular कैल्शियम परिवर्तन, मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. झिल्ली क्षमता संवेदनशील रंजक झिल्ली संभावित परिवर्तन की निगरानी के लिए उपयोग किया जाता है. सेलुलर झिल्ली क्षमता मापने intracellular कैल्शियम के स्तर में परिवर्तन की तुलना में neuronal गतिविधि का एक और अधिक प्रत्यक्ष सूचकांक है. इसके अलावा, झिल्ली संभावित डाई (एमपीडी) इमेजिंग संभावित कार्रवाई संभावित फायरिंग बदल नहीं है और intracellular कैल्शियम का स्तर बदल नहीं सकता जहां झिल्ली क्षमता में छोटे परिवर्तन का पता लगाता है. इन प्रतिदीप्ति इमेजिंग तकनीक के दोनों किशोर चूहों 2-7 से VMH ग्लूकोज संवेदन न्यूरॉन्स अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. परिणाम पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी साथ प्राप्त की तुलना में कम विस्तृत हो रहे हैं, इमेजिंग प्रयोगों की ताकत है कि वे एक साथ अनिवार्य रूप से ग्लूकोज संवेदन न्यूरॉन्स की एक महत्वपूर्ण संख्या में शामिल हैं जो कोशिकाओं की एक बड़ी आबादी का मूल्यांकन करता है. एमपीडी इमेजिंग मैंअधिक समान रूप से पूरे VMH भर स्थानीयकृत हैं जो सैनिक न्यूरॉन्स के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, इस प्रकार अलग VMH (~ 15% सैनिक) में अध्ययन करने के लिए एक पर्याप्त आबादी प्रदान करते हैं. जीई न्यूरॉन्स घनी ventrolateral-VMN और एआरसी और VMN के बीच सेल गरीब क्षेत्र के लिए स्थानीय कर रहे हैं, जबकि इसके विपरीत, वे VMH भीतर न्यूरॉन्स की एक महत्वपूर्ण संख्या (<1% जीई) का प्रतिनिधित्व नहीं करते. इसके अलावा, पृथक न्यूरॉन्स का अध्ययन करके, astrocytic और presynaptic प्रभाव समाप्त हो जाते हैं. शारीरिक कनेक्शन और प्रक्रियाओं खो रहे हैं के बाद से यह पहला आदेश न्यूरॉन प्रभावों के अध्ययन में एक फायदा है, साथ ही एक नुकसान हो सकता है.

पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और एमपीडी / कैल्शियम डाई इमेजिंग दोनों में एक सीमित कारक छोटे जानवरों (उदाहरण. चूहों या चूहों <उम्र के 8 सप्ताह) का उपयोग करने की आवश्यकता है. इस वजह से उम्र के साथ होता है कि कमी हुई neuronal व्यवहार्यता के साथ संयोजन में वृद्धि हुई संयोजी ऊतक के लिए मुख्य रूप से है. मस्तिष्क टुकड़ा इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी संवर्धन मेंएँ, बढ़ संयोजी ऊतक इसे और अधिक कठिन न्यूरॉन्स कल्पना करने के लिए बनाता है. बढ़ी हुई संयोजी ऊतक भी यह कठिन इमेजिंग अध्ययन के लिए स्वस्थ न्यूरॉन्स की एक बड़ी संख्या को अलग कर देना पड़ता है. इसके अलावा, छोटे जानवरों से न्यूरॉन्स पैच दबाना रिकॉर्डिंग या इमेजिंग या तो के दौरान लंबे समय तक जीवित रहते हैं. हालांकि, युवा चूहों के उपयोग के एक प्रमुख सीमा हो सकती है. Neuronal गतिविधि और / या न्यूरोट्रांसमीटर या परिसंचारी पोषक तत्वों के लिए प्रतिक्रियाओं उम्र के साथ बदल जाते हैं. ऊर्जा संतुलन बारीकी से प्रजनन की स्थिति से जुड़ा हुआ है क्योंकि उदाहरण के लिए, ऊर्जा संतुलन को विनियमित hypothalamic न्यूरॉन्स postpubescent जानवरों पूर्व बनाम में अलग ढंग से प्रतिक्रिया हो सकती है. साथ ही, कई रोगों लंबे समय तक इलाज की आवश्यकता होती है या वयस्कता जब तक प्रकट नहीं करते. इस तरह के रोगों के प्रमुख उदाहरण आहार मोटापे या टाइप 2 मधुमेह रहे हैं. ग्लूकोज संवेदन न्यूरॉन्स इन रोगों में एक भूमिका निभा माना जाता है के बाद से हम सफलतापूर्वक एमपीडी इमेजिंग EXP में उपयोग के लिए स्वस्थ वयस्क VMH न्यूरॉन्स संवर्धन के लिए एक पद्धति विकसित कीeriments.

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Protocol

1. पशु

  1. सभी प्रक्रियाओं न्यू जर्सी के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग चिकित्सा विश्वविद्यालय में समिति और दंत चिकित्सा द्वारा अनुमोदित किया गया.
  2. समूह घर पुरुष C57BL 6 / एक 12 घंटा light/12 घंटा अंधेरे समय पर चूहों और पानी और भोजन के लिए यथेच्छ उपयोग की अनुमति. 4-5 महीने की उम्र में किया. चूहों की इच्छामृत्यु संज्ञाहरण की शल्य चिकित्सा विमान और इच्छामृत्यु की एक माध्यमिक फार्म (यानी डायाफ्राम के माध्यम से सीने गह्वर में चीरा मर्मज्ञ) का उपयोग किया गया था. इस इच्छामृत्यु पर AVMA दिशा निर्देशों के अनुरूप है.

2. छिड़काव समाधान, coverslips, कांच pipettes, और मीडिया की तैयारी

  1. 2.5 मिमी KCl, 7 मिमी 2 MgCl, 1.25 मिमी नाह 2 पीओ 4, 28 मिमी 3 NaHCO, 0.5 मिमी 2 CaCl से मिलकर 1L छिड़काव समाधान करें, 7 मिमी ग्लूकोज, 1 मिमी एस्कॉर्बेट, और आसुत DH 2 ओ में 3 मिमी पाइरूवेट करने के लिए ~ 30 परासारिता समायोजितलगभग 80 ग्राम / एल सुक्रोज का उपयोग 0 mOsm. 95% 2 हे / 5% सीओ 2 के साथ बुदबुदाती और 7.4 पीएच को समायोजित करके आक्सीजन के साथ मिलना. प्रत्येक प्रयोग छिड़काव समाधान के लगभग 200 मिलीलीटर की आवश्यकता होगी. Aliquots अप करने के लिए 2 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
  2. ग्लूकोज, 2.5 मिमी ग्लूकोज, और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन बिना Neurobasal मीडिया युक्त 250 मिलीलीटर Neurobasal शेयर करें. सुक्रोज का उपयोग कर 280 mOsm करने Neurobasal शेयर की osmolarity समायोजित करें. 500 मिलीलीटर ग्लूकोज, 2.5 मिमी ग्लूकोज, और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन बिना हाइबरनेट एक मीडिया वाले शेयर हाइबरनेट करें.
  3. Stericup वैक्यूम फिल्टर इकाइयों का उपयोग अच्छी तरह से शेयरों और फिल्टर बाँझ दोनों हिलाओ. कांच के बने पदार्थ या हलचल सलाखों के माध्यम से ग्लूकोज या अन्य contaminants परिचय नहीं सावधान रहो. प्रकाश से मीडिया की रक्षा और अप करने के लिए 2 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए पन्नी में बोतलों लपेटें.
  4. सुझावों कोई लो कर रहे हैं इतना है कि 4 autoclaved कांच pipettes (9) के सुझावों ज्वालाnger तेज और खोलने व्यास बड़े (~ 0.9 मिमी), मध्यम बड़े (~ 0.7 मिमी), मध्यम (~ 0.5 मिमी), और छोटे (~ 0.3 मिमी). सबसे बड़ी मुश्किल से पॉलिश किया जाना चाहिए और छोटी से छोटी है कि व्यास की एक तिहाई के बारे में होना चाहिए.
  5. कटाई न्यूरॉन्स, 70% इथेनॉल का उपयोग और एक लेम्प बर्नर लौ पर गुजर स्वच्छ चार 25 मिमी कांच coverslips से पहले दिन. एक बाँझ 35 मिमी संस्कृति डिश में प्रत्येक coverslip जगह और 2 मिलीलीटर DH 2 ओ में बाँझ 1% पाली डी lysine जोड़ रात भर एक मशीन (37 डिग्री सेल्सियस) में बर्तन डाल दिया. अगले दिन, बाँझ DH 2 हे 3x से धो लें और coverslips के लिए पूरी तरह से सूखी अनुमति देते हैं.
  6. 1 एम लैक्टिक एसिड और GlutaMAX के 200 μl aliquots के 75 μl aliquots बनाओ, -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान पूरी तरह एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए उपयोग करने से पहले लैक्टिक एसिड और GlutaMAX की aliquots पिघलना.
  7. कटाई न्यूरॉन्स के दिन, इंसुलिन के बिना 1mm लैक्टिक एसिड, 0.5mm GlutaMAX, और 2% B27 युक्त हाइबरनेट एक शेयर से मिलकर ताजा संस्कृति मीडिया के 30 मिलीलीटर. Vortex और 1 एन NaOH का उपयोग 7.4 पीएच को समायोजित करें.
  8. बर्फ पर एक 60 मिमी गिलास पेट्री डिश में संस्कृति मीडिया के 10 मिलीलीटर डालो, बर्फ पर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 2 मिलीलीटर रख दिया और कमरे के तापमान पर शेष मीडिया रहते हैं.
  9. कटाई न्यूरॉन्स के दिन, 1 मिमी लैक्टिक एसिड, 0.5 मिमी GlutaMAX, और इंसुलिन के बिना 2% B27 युक्त Neurobasal स्टॉक से मिलकर ताजा वृद्धि मीडिया के 25 मिलीलीटर. भंवर और 1 एन NaOH का उपयोग 7.4 पीएच को समायोजित करें. ताजा वृद्धि मीडिया में कम से कम 30 मिनट के लिए एक मशीन (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) में संतुलित करने की अनुमति दें.

3. हृदय छिड़काव

  1. पूरी तरह से 95% 2 हे / 5 कम से कम 15 मिनट के लिए बर्फ पर% सीओ 2 के साथ 200 मिलीलीटर छिड़काव समाधान और आक्सीजन के साथ मिलना पिघलना.
  2. एसीटोन, 70% इथेनॉल, और DH 2 ओ के साथ एक vibratome ब्लेड धो लें Vibratome में ब्लेड स्थिति.
  3. DH 2 ओ के साथ vibratome शीतलन कक्ष और छिड़काव टयूबिंग कुल्ला ठंडा चैम्बर भरें (4 डिग्री सेल्सियस) छिड़काव समाधान के साथ और आक्सीजन के साथ मिलना जारी है.
  4. Pentobarbital सोडियम 50 मिलीग्राम के साथ एक माउस anesthetize / एमएल, बाँझ पानी के साथ 1:1 पतला, intraperitoneally इंजेक्शन. सत्यापित करें माउस को पूरी तरह पूंछ बन्द रखो और कोई जवाब नहीं देख द्वारा anesthetized है.
  5. बस विच्छेदन के लिए पहले छिड़काव जलाशय और टयूबिंग में ठंड छिड़काव समाधान डालो. मस्तिष्क विच्छेदन के लिए 20-30 मिलीलीटर सहेजें और बर्फ पर आक्सीजन के साथ मिलना जारी है. ट्यूबिंग के माध्यम से एक ऊंचा 60 मिलीलीटर सिरिंज से गुरुत्वाकर्षण प्रवाह और एक 20 जी सुई पर्याप्त प्रवाह प्रदान करता है. हवाई बुलबुले बाहर धो रहे हैं जब तक हल चलाने की अनुमति दें. आक्सीजन के लिए आगे बढ़ें.
  6. माउस का ribcage ऊपर त्वचा वापस कट. Ribcage उठा और ध्यान से डायाफ्राम के माध्यम से एक क्षैतिज काट कर. दिल को बेनकाब करने के लिए हथियारों की ओर ribcage ऊपर के माध्यम से दो पार्श्व कटौती करें. Ribcage वापस पकड़ संदंश का प्रयोग करें.
  7. रक्त vascu के बाहर धोया जा करने के लिए एक निकास बिंदु प्रदान करने के लिए सही आलिंद में एक छोटे से 2 मिमी कटौती करेंLAR प्रणाली.
  8. अभी काफी सुई उद्घाटन सम्मिलित करने के लिए, छिड़काव सुई के साथ बाएं वेंट्रिकल पंचर. एक हाथ से जगह में सुई पकड़ो और दूसरे हाथ से छिड़काव समाधान का प्रवाह शुरू करते हैं. छिड़काव समाधान के 10-15 मिलीलीटर के बाद, खून से धोया जाना चाहिए और प्रवाह साफ हो जाएगा.

4. मस्तिष्क टुकड़ा करने की क्रिया और विच्छेदन

  1. हृदय छिड़काव के बाद, हस्तांतरण का उपयोग करने के लिए बस से पहले बर्फ पर एक पेट्री डिश को ठंड छिड़काव समाधान oxygenated.
  2. जल्दी से, सिर काटना खोपड़ी से मस्तिष्क को हटाने और छिड़काव समाधान में मस्तिष्क जगह है. मस्तिष्क निकालने के लिए: आगे त्वचा खींच, आँख कुर्सियां ​​ओर खोपड़ी में एक midline कटौती करने, हर आंख की ओर 2 पार्श्व में कटौती करने, वापस, खोपड़ी के प्रत्येक पक्ष खींच आँख कुर्सियां ​​बीच एक राज्याभिषेक काट कर, और संदंश का उपयोग धीरे छिड़काव समाधान में मस्तिष्क बाहर मनाना एक रंग का उपयोग करें. यदि आवश्यक हो तो ऑप्टिक इलाकों में कटौती के लिए कैंची का प्रयोग करें. Hypothalami स्पर्श नहीं करतेग क्षेत्र और इस मंझला श्रेष्ठता और अंतर्निहित hypothalamic ऊतक पर बहुत अधिक दबाव डालता है क्योंकि ऑप्टिक इलाकों खींच नहीं है.
  3. ऊतक (पर्वबिन्दु -3.52 मिमी) डूबे हुए है, जबकि laterally हाइपोथेलेमस के लिए मस्तिष्क के ऊतकों लगभग 3 मिमी पीछे और पूर्वकाल ट्रिम करने के लिए एक रेजर ब्लेड और सुई का प्रयोग करें. मस्तिष्क vibratome चक पर सीधे बैठ जाएगा तो यह है कि पूर्वकाल पक्ष कटौती स्तर होना करने के लिए यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है.
  4. समाधान से शेष मस्तिष्क ऊतक निकालें और घुड़सवार मस्तिष्क अनुभाग से समाधान दूर बाती को फिल्टर पेपर का उपयोग करें.
  5. एक vibratome चक पर सुपर गोंद का एक थपका प्लेस और मस्तिष्क के आकार को गोंद फैल गया. पूर्वकाल ओर नीचे का सामना करना पड़ और हाइपोथेलेमस ब्लेड का सामना करना पड़ के साथ गोंद के शीर्ष पर मस्तिष्क ऊतक रखो. बाती दूर अतिरिक्त गोंद और vibratome ठंडा चेंबर में चक जगह है. यह समाधान में मस्तिष्क के आसपास बुलबुला ऊपर रखा जाएगा जब के रूप में ज्यादा गोंद छोड़ने के लिए नहीं सावधानी बरतें.
  6. Vibratom साथई एक धीमी गति (स्तर 2) और उच्च आयाम (9 स्तर) करने के लिए सेट, हाइपोथैलेमस क्षेत्र तक पहुँचने तक 300-500 माइक्रोन स्लाइस बनाने. अब पूर्वकाल को पीछे से काटने पतली 100 माइक्रोन स्लाइस बनाने. के रूप में निम्नानुसार दृश्य cues हैं. तीसरे वेंट्रिकल (-2.70 -2.30 मिमी पर्वबिन्दु) बहुत छोटा हो जाएगा हाइपोथेलेमस को पीछे. पर्वबिन्दु -2.30 मिमी, तीसरे निलय राज्याभिषेक टुकड़ा पर पृष्ठीय और उदर वर्गों में विभाजित है.
  7. तीसरे वेंट्रिकल फ्यूज के वर्गों, (-2.18 -1.22 मिमी पर्वबिन्दु) VMH की सही क्षेत्र में शामिल होंगे जो दो 500 माइक्रोन स्लाइस एक बार. पूर्वकाल VMH को, तीसरे निलय नहीं रह 8 (-1.06 -0.82 लिए पर्वबिन्दु) मस्तिष्क का वेंट्रल मंजिल तक फैली हुई है.
  8. बर्फ युक्त संस्कृति मीडिया पर पेट्री डिश के लिए इन स्लाइस स्थानांतरण. चित्रा 1 में दिखाया गया है VMH (VMN + एआरसी) काटना. धीरे बर्फ पर संस्कृति मीडिया के 2 मिलीलीटर में VMH टुकड़े स्थानांतरित करने के लिए एक विंदुक का प्रयोग करें.

5. हदबंदी और संस्कृति

  1. बर्फ से VMH निकालें और कमरे के तापमान पर रखें. संस्कृति मीडिया के 4 एमएल के लिए 20 यू / एमएल papain जोड़ें. एक 34 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में मिश्रण और जगह को पलटना. पाचन मीडिया को अब बादल है जब तक हर मिनट की जाँच करें और उलटा द्वारा मिश्रण. एक बाँझ फ्लास्क में (0.22 मीटर) तक और पाचन मीडिया के लिए ऊतक स्थानांतरण.
  2. 30 मिनट के लिए 34 डिग्री सेल्सियस पर 100 rpm पर झटकों से ऊतक डाइजेस्ट.
  3. पाचन के दौरान 8% गोजातीय सीरम albumin (BSA) युक्त मीडिया के 1 एमएल तैयार करें. एक शंक्वाकार ट्यूब में संस्कृति मीडिया और फिल्टर के 1 मिलीलीटर (0.22 मीटर) में 80 मिलीग्राम बीएसए भंग.
  4. एक शंक्वाकार ट्यूब में संस्कृति मीडिया के 5 एमएल को स्थानांतरित और धीरे धीरे एक बार inverting द्वारा ऊतकों को धो लें.
  5. संस्कृति मीडिया के 6 मिलीग्राम के लिए 30 μl DNase एंजाइम जोड़ें और विचूर्णन मीडिया बनाने के लिए मिश्रण. धोने मीडिया aspirate और विचूर्णन मीडिया के 3 मिलीलीटर जोड़ें.
  6. एल के क्रम में triturate को कांच pipettes का प्रयोग करेंargest छोटी करने के लिए. धीरे 10x triturate और फिर व्यवस्थित करने के लिए बड़े टुकड़े के लिए 4 मिनट इंतज़ार करो. एक नया शंक्वाकार ट्यूब के लिए एक अलग सेल निलंबन युक्त शीर्ष 2 मिलीलीटर स्थानांतरित करने के लिए दूसरा पिपेट का प्रयोग करें. , विचूर्णन मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें 10x triturate और 3 मिनट इंतज़ार करो. सेल निलंबन के लिए शीर्ष 2 मिलीलीटर स्थानांतरित करने के लिए तीसरे पिपेट का प्रयोग करें. विचूर्णन मीडिया, महीन चुर्ण बनाना 5x के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 2 मिनट इंतज़ार करो. सेल निलंबन के लिए शीर्ष 2ml स्थानांतरित करने के लिए चौथे पिपेट का प्रयोग करें.
  7. मिश्रण करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा है, 8% बीएसए के शीर्ष पर अलग सेल निलंबन परत. 5 मिनट के लिए 1000 rpm पर अपकेंद्रित्र.
  8. प्रत्येक coverslip के केंद्र में सिलेंडरों की क्लोनिंग autoclaved 6 मिमी x 8 मिमी रखें. Coverslips पूरी तरह से सूखा होना चाहिए. महाप्राण और 440 μl गर्म विकास मीडिया में गोली resuspend. 20 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में neuronal निलंबन और जगह के साथ सिलेंडर क्लोनिंग भरें.
  9. क्लोनिंग सिलेंडरों निकालें और बहुत धीरे से मलबे को धो. प्रत्येक पकवान वाई भरेंविकास मीडिया के 2 मिलीलीटर वें. किसी भी assays के प्रदर्शन कर रहे हैं इससे पहले कि कोशिकाओं को कम से कम 1 घंटे के लिए ठीक करने के लिए अनुमति दें.

6. एमपीडी इमेजिंग के लिए तैयारी

  1. 121 मिमी NaCl, 4.7 मिमी KCl, 2 मिमी 2 CaCl, 0.1 मिमी 2 MgCl, 1.2 मिमी 4 MgSO, 0.97 मिमी कश्मीर 2 4 HPO, 0.23 मिमी के.एच. 2 पीओ 4, 5 मिमी 3 NaHCO, और 25 मिमी से मिलकर रिकॉर्डिंग समाधान करें HEPES. 7.4 पीएच को समायोजित करें.
  2. वांछित कम ग्लूकोज परीक्षण समाधान (0.1-2.0 मिमी ग्लूकोज) बनाने के लिए ग्लूकोज जोड़ें. अच्छी तरह मिक्स और 400 एमएल कम ग्लूकोज रिकॉर्डिंग समाधान सुरक्षित रखते हैं. 2.5 मिमी ग्लूकोज रिकॉर्डिंग समाधान बनाने और मिश्रण अच्छी तरह से करने के लिए शेष 600 मिलीलीटर ग्लूकोज जोड़ें.
  3. जितना संभव प्रकाश से डाई को सुरक्षित रखें. एक ब्लू एमपीडी शीशी को कमरे के तापमान बफर के 4 मिलीलीटर जोड़ें. अच्छी तरह मिक्स और मिलीलीटर रिकॉर्डिंग समाधान प्रति 5 μl डाई जोड़ें. समाधान के बीच में पिपेट के साथ मिश्रण से समरूप समाधान रखें. डाई फ्लोरोसेंट मीटर शामिलविध्रुवण साथ कोशिकाओं में प्रवेश, अणुओं और पेय, जो कोशिका झिल्ली को पार नहीं कर सकते जो olecules,. Aliquots -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और 4 दिनों के भीतर इस्तेमाल किया जा सकता है. फ्रीज पिघलना नहीं है एक बार से अधिक.
  4. 30 मिनट के लिए 34 डिग्री सेल्सियस पर 2.5 मिमी ग्लूकोज रिकॉर्डिंग समाधान प्लस डाई के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं को सेते हैं. एक सूखी हीटिंग ब्लॉक किया जा सकता है. प्रकाश से सुरक्षित रखें.
  5. 2.5 मिमी और 0.1 मिमी रिकॉर्डिंग समाधान प्लस डाई के साथ सिरिंज पंप और छिड़काव प्रणाली तैयार करें. 60 मिलीलीटर सीरिंज से ट्यूबिंग एक कई गुना से जुड़ा होना चाहिए.
  6. कई गुना पर समाधान स्विच करने से पहले 10 सेकंड सिरिंज में दबाव buildup को रोकने के लिए ~ के लिए किसी भी पंप रोकने के बाद, रुको. दबाव परिवर्तन छवियों का प्रयोग और विरूपण के दौरान माइक्रोस्कोप फोकस में परिवर्तन के कारण, न्यूरॉन्स युक्त बंद कक्ष के लिए तरल पदार्थ वितरण में परिवर्तन.
  7. कई गुना उत्पादन ट्यूबिंग एक में लाइन हीटर और एक बंद कक्ष को जोड़ता है जो तब पॉलीथीन ट्यूबिंग, से जुड़ा होना चाहिए. बुलबुले को मंजूरी दे दी जानी चाहिए और छिड़काव दर 0.5 मिलीग्राम / मिनट के लिए सेट किया जाना चाहिए. प्रकाश से सुरक्षित रखें.
  8. Coverslip हवाई बुलबुले को पेश करने के लिए सूखी और नहीं करने के लिए अनुमति देने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा है, बंद कक्ष के अनुयायी न्यूरॉन्स के साथ 25 मिमी coverslip स्थानांतरण. पर्ची नीचे टुकड़ा के खांचे में गठबंधन किया है, रिकॉर्डिंग समाधान के एक जोड़े बूँदें पक्षों के साथ रखा गया है, और शीर्ष टुकड़ा धीरे जगह में coverslip धारण करने के लिए फिट है.
  9. रिकॉर्डिंग समाधान के साथ चैम्बर भरें और फिर शीर्ष पर एक 18 मिमी coverslip जगह के लिए एक dropper का उपयोग करें. धीरे जगह में छोटे coverslip धारण करने के चेंबर में सफेद अंगूठी फिट. बंद कक्ष में पेश किया जा रहा से हवाई बुलबुले को रोकने के लिए बहुत धीरे धीरे और हल्के से नीचे दबाएँ.
  10. 2.5 मिमी ग्लूकोज रिकॉर्डिंग समाधान, नीचे सफेद अंगूठी पर प्रेस के लिए सिरिंज पंप शुरू, और बंद कक्ष से कनेक्ट. धीरे धीरे सफेद अंगूठी से दबाव जारी है और बर्बादी कंटेनर के प्रमुख के लिए टयूबिंग कनेक्ट.
ई "> 7. एमपीडी इमेजिंग

  1. कम उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाश का उपयोग कर न्यूरॉन्स केंद्र. कोशिकाओं प्रकाश के संपर्क में किया जा रहा है समय की राशि को कम करने की कोशिश करें.
  2. छिड़काव प्रणाली तापमान, ध्यान के स्थिरीकरण के लिए अनुमति देने के लिए 10 मिनट के लिए चलाने के लिए, और संतुलन डाई करने की अनुमति दें.
  3. भड़काना जबकि, Metamorph कार्यक्रम खुला और न्यूरॉन्स की एक उज्ज्वल छवि क्षेत्र (10X) ले. फ्लोरोसेंट छवियों के 3 ढेर (150 मिसे, संकीर्ण Cy3 फिल्टर, 10X) लेने के लिए और 5 माइक्रोन के भीतर ध्यान केंद्रित निर्धारित करने के लिए ऑटो फोकस समारोह का प्रयोग करें. 10 मिनट भड़काना अवधि के अंत में, एक बार और अधिक ध्यान देने की जाँच करें.
  4. 40 मिनट के लिए फ्लोरोसेंट छवियों हर 30 सेकंड रिकॉर्ड करने के लिए शुरू करो. 10 मिनट के लिए 2.5 मिमी ग्लूकोज में एक आधारभूत स्थापित, फिर 15 मिनट के लिए ग्लूकोज को कम, और अंत में 15 मिनट के लिए 2.5 मिमी ग्लूकोज पर लौटें. समाधान, एक सिरिंज पंप रोक 10 सेकंड इंतजार कर, कई गुना पर एक बंदरगाह मोड़, और एक और सिरिंज पंप शुरू करने से बदल रहे हैं. परिवर्तन आगे वांछित समय अंक बीए की हो जाना चाहिएकई गुना और कोशिकाओं के बीच अंतराल पर sed.
  5. सभी फ्लोरोसेंट छवियों रिकॉर्डिंग के बाद, न्यूरॉन्स की एक उज्ज्वल क्षेत्र छवि ले.

8. एमपीडी इमेजिंग विश्लेषण

  1. प्रयोग के अंत में लिया उज्जवल छवि क्षेत्र में प्रत्येक कक्ष के आसपास अंडाकार क्षेत्रों बनाने के लिए MetaMorph का प्रयोग करें. क्षेत्र एक न्यूरॉन की तुलना में थोड़ा बड़ा होना चाहिए और सेल के अंधेरे बढ़त के बाहर 1 पिक्सेल बनाया जा सकता है. , अस्वस्थ अतिव्यापी, या मलबे के करीब हैं कि कोशिकाओं का चयन न करें. अस्वस्थ कोशिकाओं अक्सर अंधेरा दिखाई देते हैं. अन्त में, पृष्ठभूमि माप के लिए कोई कोशिकाओं या मलबे के साथ क्षेत्रों में 5 बड़ी अंडाकार क्षेत्र बनाने.
  2. सभी फ्लोरोसेंट छवियों क्षेत्रों स्थानांतरण और कोई आंदोलन / बदलाव आ गई है कि सत्यापित करने के लिए निरीक्षण किया. एक एक्सेल फाइल में सभी छवियों के लिए प्रत्येक क्षेत्र के प्रतिदीप्ति तीव्रता रिकॉर्ड करने के उपाय समारोह का प्रयोग करें. Metamorph में पत्रिकाओं के उपयोग की सलाह दी है.
  3. Excel में, प्रत्येक fluoresc के लिए 5 पृष्ठभूमि क्षेत्रों के एक औसत बनाईएनटी छवि. यह हर समय बिंदु पर औसत पृष्ठभूमि मूल्य का प्रतिनिधित्व करता है. प्रत्येक छवि / समय बिंदु के लिए, सभी क्षेत्र माप से पृष्ठभूमि घटाना. पृष्ठभूमि घटाया प्रतिदीप्ति तीव्रता तीव्रता इसके बाद के रूप में करने के लिए भेजा जाएगा.
  4. प्रत्येक कक्ष के लिए, मिनट रिकॉर्डिंग की 2-8 दौरान औसत तीव्रता की गणना. यह 2.5 मिमी ग्लूकोज में सेल का बेसलाइन का प्रतिनिधित्व करता है. प्रत्येक उपचार के दोनों सिरों पर एक 2 मिनट बफर शोर को कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
  5. प्रत्येक कक्ष के लिए, आधारभूत से परिवर्तन प्रतिशत की गणना: (तीव्रता आधारभूत) / बेसलाइन
  6. समय बनाम आधारभूत से प्रतिशत में परिवर्तन के साथ एक पंक्ति ग्राफ बनाएँ.
  7. मिनट 18-23 के दौरान आधारभूत से औसत प्रतिशत परिवर्तन की गणना. मिनट 35-40 के दौरान आधारभूत से औसत प्रतिशत परिवर्तन की गणना. इमेज प्रोसेसिंग का प्रयोग नहीं किया जाता है, शोर प्रत्येक कोशिका क्षेत्र के भीतर तीव्रता के औसत, पृष्ठभूमि घटाव, और 5 मिनट ओ से अधिक क्षेत्र तीव्रता के औसत से कम हैआर लंबी है.
  8. 2.5 मिमी ग्लूकोज रिकॉर्डिंग समाधान 2.5 मिमी ग्लूकोज रिकॉर्डिंग समाधान के साथ बातचीत की है जिसमें नियंत्रण प्रयोगों शोर सीमा निर्धारित करने के लिए किया जाना चाहिए. कम से कम 6 व्यंजन और 3 चूहों के लिए मिनट 18-23 के दौरान आधारभूत से औसत प्रतिशत परिवर्तन की गणना. इन मूल्यों का मतलब है और मानक विचलन का निर्धारण करते हैं.
  9. मतलब प्लस 2 मानक विचलन के लिए एक सकारात्मक विध्रुवण प्रतिक्रिया के लिए सीमा निर्धारित करें. मतलब प्लस 2 मानक विचलन <0.05 पी के साथ एक अंतर से मेल खाती है. हमारे नियंत्रण प्रयोगों उचित मूल्य सीमा के रूप में आधारभूत से एक 10% परिवर्तन का पता चला.
  10. प्रत्येक कक्ष के लिए, 2 मापदंड पर आधारित प्रतिवर्ती विध्रुवण प्रतिक्रिया का आकलन करें. सबसे पहले, मिनट 18-23 के दौरान आधारभूत से औसत प्रतिशत परिवर्तन से अधिक 10%, पिछले चरण में निर्धारित सीमा से होना चाहिए. दूसरा, मिनट 35-40 के दौरान आधारभूत से औसत प्रतिशत परिवर्तन कम से औसत प्रतिशत परिवर्तन के आधे से अधिक होना चाहिएमिनट 18-23 के दौरान आधारभूत. यह ग्लूटामेट या KCl के साथ उत्तेजना से भी अधिक कठोर हो पाया था, क्योंकि दूसरी कसौटी चुना गया था. कमी हुई ग्लूकोज को अपनी प्रतिक्रिया प्रतिवर्ती नहीं हैं, भले ही अस्वस्थ न्यूरॉन्स अक्सर ग्लूटामेट या KCl के साथ उत्तेजना का जवाब.
  11. हर डिश के लिए, depolarized न्यूरॉन्स की% की गणना. यह मान अलग उपचार समूहों के बीच सैनिक न्यूरॉन्स का% यों के लिए प्रयोग किया जाता है.

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Representative Results

दूर अन्य हाइपोथैलेमस क्षेत्रों से VMH की सटीक विच्छेदन अनुरूप परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. अन्य क्षेत्रों के शामिल किए जाने की गणना depolarized न्यूरॉन्स का% बदल रहा है, VMH neuronal आबादी को कमजोर कर सकता है. इसके अलावा, ग्लूकोज संवेदन न्यूरॉन्स ऐसे VMH ग्लूकोज संवेदन न्यूरॉन्स से कार्यात्मक और mechanistically अलग हो सकता है, जो पार्श्व hypothalamus है, के रूप में अन्य हाइपोथैलेमस क्षेत्रों में पहचान की गई है. 1 उचित विच्छेदन के लिए सही शारीरिक स्थानों को दिखाता है चित्रा. ऊपर प्रोटोकॉल के बाद सही VMH क्षेत्र युक्त मस्तिष्क के ऊतकों अलग किया जा सकता है. प्रत्येक subpopulation की संपूर्णता को बनाए रखते हुए संक्षेप में, VMN और एआरसी अलग करने के लिए आगे विच्छेदन, संभव नहीं हो सकता है. चित्रा 2 स्वस्थ का एक उदाहरण VMH न्यूरॉन्स अलग दिखाता है. Immunocytochemistry का उपयोग करना, हम हमारे तैयारी> 90% neuronal पुष्टि की है कि. केवल स्वस्थ न्यूरॉन्स डेटा analy के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिएभी कई अस्वस्थ न्यूरॉन्स के साथ बहन और व्यंजन खारिज किया जाना चाहिए. अस्वस्थ हैं कि न्यूरॉन्स अक्सर, बहुत ही गहरे किनारों है एक बड़ी हद तक एमपीडी ले, और अनियमित आकार की है. इसके अतिरिक्त, न्यूरॉन्स सबसे न्यूरॉन्स की रिकॉर्डिंग के दौरान एक दूसरे को छू नहीं कर रहे हैं कि इस तरह के एक घनत्व पर चढ़ाया जाना चाहिए. विश्लेषण के लिए चुना न्यूरॉन्स अन्य कोशिकाओं या मलबे को छू नहीं किया जाना चाहिए.

एक सैनिक न्यूरॉन और एक nonGI न्यूरॉन की रिकॉर्डिंग से प्राप्त आंकड़ों के 3 चित्र में दिखाया गया. 10 मिनट के लिए एक आधार रेखा के प्राप्त करने के बाद, कोशिकी ग्लूकोज 2.5-0.1 मिमी से कम था. सैनिक न्यूरॉन आधारभूत से 10% परिवर्तन की पूर्व निर्धारित सीमा से अधिक एक मजबूत प्रतिवर्ती प्रतिक्रिया से पता चलता है. प्रतिदीप्ति में वृद्धि विध्रुवण को दर्शाता है. जीई न्यूरॉन hyperpolarization प्रतिक्रियाएं भी पता चला रहे हैं, वहीं आवृत्ति ग्लूकोज संवेदन न्यूरॉन के इस उप पर इस तकनीक के सफल प्रयोग के लिए (<1% न्यूरॉन्स) बहुत कम है. शारीरिक glucos की एक श्रेणीई घटने का परीक्षण किया गया और reversibly depolarized जो VMH न्यूरॉन्स का प्रतिशत हर डिश के लिए गणना की गई. चित्रा 4 एक सकारात्मक संबंध ग्लूकोज कमी और न्यूरॉन्स depolarizing का प्रतिशत की भयावहता के बीच मौजूद है कि दिखाता है. इस वयस्क murine न्यूरॉन्स की सफल प्राथमिक संस्कृति वयस्क VMH सैनिक न्यूरॉन्स के अध्ययन के लिए अनुमति देने के लिए प्रतिदीप्ति इमेजिंग के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि यह दर्शाता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. सही VMH विच्छेदन के लिए मार्कर के साथ राज्याभिषेक अनुभाग. विच्छेदित ऊतक अन्य हाइपोथैलेमस क्षेत्रों से कम से कम प्रदूषण के साथ VMN और एआरसी में शामिल है. विकर्ण कटौती ~ से 25-30% तीसरे वेंट्रिकल के ऊपर से नीचे बनाया जाना चाहिए करने के लिए ~ प्रांतस्था hypothalamic क्षेत्र (नीला *) से मिलता है, जहां बिंदु और तीसरे वेंट्रिकल के बीच 25-30%(3V). माउस ब्रेन पर्वबिन्दु-1.7mm करने के लिए इसी -2.8 मिमी Paxinos और वॉटसन 1998 9,. पर्वबिन्दु से अनुकूलित बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. एक वयस्क माउस से स्वस्थ VMH न्यूरॉन्स की brightfield छवि. इस छवि हदबंदी के बाद 24 घंटे में लिया गया था और एमपीडी इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है. होगा (नीला *) या (लाल x) के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाएगा चिह्नित हैं कि न्यूरॉन्स के कुछ उदाहरण हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
एफigure 3. एक सैनिक न्यूरॉन (ग्रीन लाइन) और एक nonGI न्यूरॉन (नारंगी लाइन) के प्रतिनिधि एमपीडी प्रतिदीप्ति निशान. कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए और एक के लिए 0.1 मिमी जी को एक कमी के बाद 10 मिनट के लिए 2.5 मिमी ग्लूकोज (जी) रिकॉर्डिंग समाधान, साथ perfused थे 15 मिनट के लिए 2.5 मिमी जी पर लौटें. सैनिक न्यूरॉन में, आधारभूत से परिवर्तन प्रतिशत 0.1 मिमी जी छिड़काव अवधि (20-25 मिनट से 40% औसत) के दौरान 10% से अधिक की वृद्धि हुई है और कम 2.5 मिमी जी उलट अवधि (15 में इस वृद्धि के आधे से अधिक की कमी आई 35-40 मिनट से% औसत). बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
चित्रा 4. reversibly फ्लोरोसेंट एमपीडी इमेजिंग का उपयोग कर पाया ग्लूकोज की कमी हुई है के जवाब में बिगाड़ना जो वयस्क VMH न्यूरॉन्स का प्रतिशत. एकसकारात्मक संबंध ग्लूकोज कमी और न्यूरॉन्स depolarizing का प्रतिशत की भयावहता के बीच मौजूद है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

वयस्क चूहों से न्यूरॉन्स की गतिविधियों का अध्ययन करने में सक्षम होने की कुंजी स्वस्थ न्यूरॉन्स अलग कर देना करने की क्षमता है. वयस्क चूहों से hypothalamic न्यूरॉन्स की हदबंदी किशोर चूहों से न्यूरॉन्स की तुलना में प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम पर और अधिक कठिन है. हम तरीकों की एक संख्या में इस समस्या को दूर किया है. मोटी 500 माइक्रोन मस्तिष्क स्लाइसें बनाने युवा चूहों से मस्तिष्क के ऊतकों के लिए इस्तेमाल सामान्य 250-350 माइक्रोन स्लाइस की तुलना में न्यूरॉन्स के लिए यांत्रिक क्षति को कम करता है. हालांकि, मोटा स्लाइस हृदय छिड़काव और मस्तिष्क के ऊतकों की papain पाचन के लिए अधिक से अधिक ध्यान देने की जरूरत. खून मस्तिष्क के ऊतकों पर देखा जाता है, तो सही आलिंद में कटौती और बाएं वेंट्रिकल में रखा सुई की परिशुद्धता और प्लेसमेंट का मूल्यांकन. प्रवाह दर और छिड़काव समाधान की मात्रा भी समायोजित किया जा सकता है. रक्त न्यूरॉन्स को विषैला होता है और स्वस्थ न्यूरॉन्स की एक कम उपज में परिणाम होगा के बाद से एक पूरी तरह से छिड़काव जरूरी है. Papain पाचन अनुमति देने के लिए पर्याप्त कुशल होना चाहिएकोमल विचूर्णन और मस्तिष्क के ऊतकों से एकल कक्षों की आसान रिहाई के लिए. बड़ा ऊतक टुकड़े दूसरे विचूर्णन दौरान उपस्थित हैं जब VMH ऊतक पाचन के अंत में जल्दी से डूब और जब एक अक्षम papain पाचन संदिग्ध है. अच्छा पाचन के साथ, ऊतक टुकड़े मुश्किल से तीसरे विचूर्णन दौरान नग्न आंखों से पता चला रहे हैं. विचूर्णन कोमल नहीं है, neuronal स्वास्थ्य भुगतना होगा. एक अक्षम papain पाचन संदिग्ध है, papain की एकाग्रता 5 यू / मिलीलीटर से बढ़ाया जा सकता है या papain की एक नई शीशी इस्तेमाल किया जा सकता है. इस neuronal स्वास्थ्य ख़राब कर सकते हैं हालांकि, बाद से papain एकाग्रता 30 यू / मिलीलीटर से ऊपर की वृद्धि हुई नहीं किया जाना चाहिए.

बीएसए के लिए जोखिम प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम है. बाद triturated कोशिकाओं समय न्यूरॉन्स की राशि बीएसए के संपर्क में हैं और बीएसए गोली के साथ कम से कम किया जाना चाहिए रहने की अनुमति की राशि दोनों, बीएसए ढाल पर centrifuged किया गया है. सतह पर तैरनेवाला और बीएसए ढालcentrifugation अवधि के बाद तुरंत aspirated किया जाना चाहिए. वैक्यूम सक्शन सतह पर तैरनेवाला के बहुमत को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन सेल गोली बाधित नहीं है कि इतनी पिछले ~ 100 μl एक विंदुक के साथ स्वयं हटा दिया जाना चाहिए. स्वस्थ न्यूरॉन्स प्राप्त करने का एक और महत्वपूर्ण पहलू सेल घनत्व अनुकूलन करने के लिए है. चढ़ाया न्यूरॉन्स भी कम के रूप में स्वस्थ नहीं हैं. इतना कुछ न्यूरॉन्स एक माउस मस्तिष्क से प्राप्त कर रहे हैं, यह चढ़ाना पहले कोशिकाओं की गिनती करने के लिए व्यावहारिक नहीं है. गिनती खर्च किया जाएगा कि समय के दौरान, कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या प्लास्टिक का पालन करना होगा और खो जाएगा. एक शुरुआती बिंदु के रूप में माउस प्रति 4 व्यंजन (~ 1 एक्स 10 4 कोशिकाओं / एमएल) का उपयोग करना, व्यंजन की संख्या का अनुभवजन्य दृढ़ संकल्प इष्टतम न्यूरॉन घनत्व प्राप्त करने के लिए सबसे अधिक व्यावहारिक दृष्टिकोण है. बड़े चूहों से VMH न्यूरॉन्स की उपज युवा चूहों से उपज का लगभग आधा हो जाने की उम्मीद की जा सकती है. न्यूरॉन उपज में सुधार करने के लिए और समस्या निवारण शेष न्यूरॉन्स की मात्रा का ठहराव शामिलहदबंदी प्रोटोकॉल के हर कदम पर भारी neuronal उदासीनता के इस कदम को तुच्छ.

हमारे प्रोटोकॉल का प्रयोग, स्वस्थ अलग न्यूरॉन्स 2-3 दिनों के लिए संस्कृति में जीवित रह सकते हैं. हालांकि, फ़िल्टर astrocyte वातानुकूलित विकास मीडिया के उपयोग के न्यूरॉन्स संस्कृति में 2 सप्ताह तक जीवित रहने के लिए अनुमति देता है. विकास मीडिया रातोंरात मिला हुआ प्राथमिक astrocytes पर incubating द्वारा वातानुकूलित किया जा सकता है. एक ही कृंतक तनाव, यौन संबंध, और मस्तिष्क क्षेत्र से astrocytes उपयोग किया जाना चाहिए. Astrocyte वातानुकूलित मीडिया के उपयोग के एक और चर का परिचय है, इस संशोधन संस्कृति में अधिक समय की आवश्यकता के वैकल्पिक प्रयोगों के लिए आवश्यक हो सकता है. इसके अलावा, स्पष्ट नहीं कर रहे हैं, जो कारणों के लिए, हम ग्लूकोज भावना की क्षमता आसानी से ऐसे ग्लूटामेट के रूप में अन्य उत्तेजनाओं, के लिए प्रतिक्रियाओं के रखरखाव के बावजूद, suboptimal neuronal स्वास्थ्य के साथ खो दिया है कि मिल गया है. इस प्रकार, अतिरिक्त ध्यान रखा जाना चाहिए. कमी हुई ग्लूकोज को neuronal प्रतिक्रियाओं का पालन करने के लिए, यह contaminati से बचने के लिए जरूरी हैपर बैक्टीरिया से, मिट्टी, नमक, साबुन, और ग्लूकोज. सभी कांच के बने पदार्थ और nonsterile प्लास्टिक पूरी तरह DH 2 ओ के साथ धोया जाना चाहिए Contaminants के रहने वाले इसके अलावा, डिटर्जेंट और लवण neuronal अखंडता और गतिविधि को प्रभावित करती है. ग्लूकोज की थोड़ी मात्रा काफी ग्लूकोज सांद्रता बदल सकता है. ग्लूकोज संवेदन न्यूरॉन्स 0.1-2.5 मिमी 10,11 के nonhyperglycemic शारीरिक सीमा के भीतर कोशिकी ग्लूकोज में छोटे बदलाव करने के लिए बहुत संवेदनशील होते हैं क्योंकि यह परिणाम बाधित होगा.

उपचार समूहों के बीच एमपीडी इमेजिंग, स्थिरता और पक्ष द्वारा साइड प्रयोग जब उपयोग सार्थक परिणाम के लिए महत्वपूर्ण हैं. संभव है या कम से कम दिनों बारी पर अगर अलग उपचार समूहों में समान दिन पर परीक्षण किया जाना चाहिए. इस संस्कृति की तैयारी या एमपीडी aliquots में संभव विविधताओं को कम करता है. इसके अतिरिक्त, हम इमेजिंग उपरोक्त कारणों के लिए न्यूरॉन हदबंदी के 24 घंटे के भीतर किया जाता है जब कम से कम भिन्नता तब होता पाया. परिणाम के बादVMH विच्छेदन और neuronal तैयारी में न्यूरॉन्स, सटीकता और निरंतरता depolarizing के एक% के रूप में विश्लेषण कर रहे हैं यह भी आवश्यक है. काटा समग्र VMH neuronal आबादी निरंतर होना चाहिए और अन्य क्षेत्रों से न्यूरॉन्स नहीं होनी चाहिए. इस प्रकार, ऊपर प्रोटोकॉल बारीकी से और ठीक से पालन किया जाना चाहिए. वैकल्पिक प्रयोगों का प्रदर्शन हो रहे हैं और आबादी के रखरखाव के लिए एक चिंता का विषय नहीं है हालांकि, अगर ऊतक घूंसे VMN या एआरसी न्यूरॉन्स को अलग करने के लिए किया जा सकता है.

यहाँ वर्णित विधि एक वयस्क माउस और कैसे ग्लूकोज संवेदन न्यूरॉन्स अध्ययन करने के लिए एमपीडी इमेजिंग का उपयोग करने से स्वस्थ VMH न्यूरॉन्स फसल को कैसे स्थापित. इसके बजाय, प्रयोगों ग्लूकोज परिवर्तन के अलावा और उत्तेजनाओं को VMH neuronal प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए तैयार किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, हदबंदी प्रोटोकॉल अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों से फसल न्यूरॉन्स के लिए extrapolated किया जा सकता है. वयस्क चूहों से न्यूरॉन्स का उपयोग करना, पढ़ाई अब उम्र के साथ या प्रगति है कि विकसित murine रोग मॉडल का उपयोग किया जा सकता है. Moreoveआर, स्वस्थ वयस्क न्यूरॉन्स आगे जैसे कैल्शियम इमेजिंग, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, एकल कोशिका पीसीआर, immunocytochemistry या इन तकनीकों के संयोजन के रूप एमपीडी इमेजिंग के अलावा अन्य तकनीक का उपयोग का अध्ययन किया जा सकता है.

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

एनआईएच R01 DK55619, एनआईएच R21 CA139063

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal-A Medium (Custom) Invitrogen 0050128DJ custom made glucose free
Hibernate-A Medium (Custom) BrainBits custom made glucose free
Penicillin streptomycin (20,000 U/ml) Invitrogen 15140 other vendors acceptable
Stericup vacuum filter units (0.22 μm) Millipore other vendors acceptable
25 mm Glass coverslips Warner #1 25mm round
18 mm Glass coverslips Warner #1 18mm round
GlutaMAX Invitrogen 35050
B27 minus insulin (50x) Invitrogen 0050129SA
Razor blade VWR 55411
Vibratome & cooling chamber Vibratome Series 1000 Sectioning system
Vibratome blades Polysciences 22370 injector or double edge blades from other vendors acceptable
Papain, suspension Worthington LS003124
BSA, suitable for cell culture Sigma other vendor acceptable
DNAse, for cell culture Invitrogen other vendor acceptable
cloning cylinders, 6 mm x 8 mm Bellco Glass 2090-00608
Membrane Potential Dye (blue) Molecular Devices R8042
In-line heater Warner SF-28
Syringe pumps WPI sp100i other vendor acceptable
Closed chamber Warner RC-43C
Polyethylene tubing Warner PE-90
Metamorph Molecular Devices alternate image analysis software acceptable
Microscope Olympus BX61 WI

used with 10X objective

Camera Photometrics Cool Snap HQ
Narrow Cy3 Filter Set Chroma 41007a
Illumination System Sutter Instruments Lambda DG-4

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References

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