Potentiel de membrane Dye Imaging de ventromédian hypothalamus neurones de souris adulte à étudier Glucose Sensing

Neuroscience

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Summary

L'activité des neurones isolés à partir de souris adultes, âgées peut être étudiée en dissociant les neurones à partir de régions spécifiques du cerveau et en utilisant l'imagerie de colorant potentiel de membrane fluorescent. Par les réponses de test à des changements dans le glucose, cette technique peut être utilisée pour étudier la sensibilité au glucose des neurones hypothalamiques ventromédians adultes.

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Vazirani, R. P., Fioramonti, X., Routh, V. H. Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing. J. Vis. Exp. (81), e50861, doi:10.3791/50861 (2013).

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Abstract

Les études de l'activité neuronale sont souvent effectuées à l'aide de neurones rongeurs moins de 2 mois d'âge en raison des difficultés techniques liées à l'augmentation du tissu conjonctif et une diminution de la viabilité neuronale qui se produisent avec l'âge. Ici, nous décrivons une méthodologie pour la dissociation des neurones hypothalamiques sains provenant de souris adultes âgés. La possibilité d'étudier les neurones de souris adultes d'âge permet l'utilisation de modèles de maladies qui se manifestent à un âge plus avancé et peut-être plus de développement précis pour certaines études. L'imagerie par fluorescence des neurones dissociés peut être utilisé pour étudier l'activité d'une population de neurones, par opposition à l'aide d'électrophysiologie pour étudier un seul neurone. Ceci est particulièrement utile lors de l'étude d'une population neuronale hétérogène dans lequel le type désiré neuronale est rare tel que de neurones hypothalamiques de détection de glucose. Nous avons utilisé le potentiel de membrane imagerie de colorant de neurones hypothalamiques ventromédian adultes d'étudier leurs réponses à changes de glucose extracellulaire. Neurones glucose de détection sont soupçonnés de jouer un rôle dans la régulation centrale de l'équilibre énergétique. La possibilité d'étudier la détection du glucose chez les rongeurs adultes est particulièrement utile, car la prédominance des maladies liées à l'équilibre de l'énergie dysfonctionnel (par exemple. L'obésité) augmente avec l'âge.

Introduction

Le cerveau régule l'homéostasie énergétique par la neuro-endocrinien et nerveux autonome. L'hypothalamus ventromédian (VMH), composé du noyau ventromédian (VMN) et le noyau arqué (ARC), est important pour la régulation centrale de l'homéostasie énergétique. Neurones spécialisés de détection du glucose, dans le VMH, lien l'activité neuronale et l'homéostasie du glucose périphérique 1. Il existe deux types de glucose détection neurones; glucose excités (GE) neurones augmentent tandis que le glucose inhibe (GI) neurones diminuent leur activité glucose augmente extracellulaires. Neurones VMH glucose de détection sont généralement étudiés en utilisant l'électrophysiologie ou potentiel imagerie de colorant sensible au calcium / membrane.

La technique de patch-clamp électrophysiologie est considéré comme l'étalon-or dans l'étude ex vivo de l'activité neuronale. Dans cette technique, une électrode de micropipette en verre est attachée à la membrane cellulaire par l'intermédiaire d'une résistance élevée(GQ) joint. Électrodes de patch-clamp permettent enregistrement en temps réel de l'action potentielle fréquence (pince de courant) ou la conductance ionique (tension de serrage) change dans un seul neurone. Bien que la technique de patch-clamp fournit des informations détaillées en ce qui concerne les changements dans les conductances spécifiques des canaux ioniques, un inconvénient majeur est que seul un neurone peut observer à la fois. Il faut environ 30-45 minutes de l'enregistrement pour vérifier que l'on enregistre depuis un neurone de détection de glucose avant même de commencer un traitement expérimental spécifique. De plus, les neurones GI et GE comprennent <20% de la population totale de VMH neuronale. S'ajoute à ce problème est l'absence, dans de nombreux cas, d'un marqueur cellulaire pour identifier ces neurones. Ainsi, il est clair que malgré fournir des informations précieuses électrique que d'autres techniques peuvent pas, l'analyse de patch-clamp est laborieux, prend du temps et un faible rendement.

L'utilisation de l'imagerie par fluorescence des neurones dissociés VMH permet l'étude de l'hundreds de neurones simultanément. Colorants sensibles au calcium peuvent être utilisés pour mesurer les changements de calcium intracellulaire, qui sont en corrélation indirectement aux variations de l'activité neuronale. Colorants sensibles potentiels membranaires sont utilisés pour surveiller les changements potentiels de membrane. La mesure du potentiel de membrane cellulaire est un index plus directe de l'activité neuronale par rapport à des changements dans les niveaux de calcium intracellulaire. En outre, le potentiel colorant (MPD) Imagerie de membrane détecte potentiellement petites modifications du potentiel de membrane où l'action tir potentiel n'est pas altérée et les niveaux de calcium intracellulaire peut pas changer. Ces deux techniques d'imagerie de fluorescence ont été utilisées pour étudier VMH neurones glucose de détection de jeunes souris 2-7. Bien que les résultats sont moins détaillées que celles obtenues avec patch clamp électrophysiologie, la force d'expériences d'imagerie est qu'ils évaluent simultanément une grande population de cellules qui comprennent inévitablement un nombre important de neurones de détection du glucose. MPD imagerie is particulièrement utile pour étudier les neurones digestifs qui sont plus uniformément localisée dans l'ensemble du VMH, fournissant ainsi une population suffisante pour étudier dans le VMH dissocié (~ 15% IG). En revanche, si les neurones GE sont densément localisées au ventro-VMN et cellule région pauvre entre le CRA et VMN, ils ne représentent pas un nombre important de neurones dans le VMH (<1% GE). De plus, en étudiant les neurones isolés, les astrocytes et les effets présynaptiques sont éliminés. Cela peut être un avantage dans l'étude de premiers effets afin de neurones, ainsi que d'un inconvénient puisque les connexions et les processus physiologiques sont perdus.

Un facteur limitant dans les deux patch clamp électrophysiologie et d'imagerie de colorant MPD / de calcium est la nécessité d'utiliser de jeunes animaux (souris, par exemple. <Ou rats âgés de 8 semaines). C'est principalement en raison de l'augmentation du tissu conjonctif en combinaison avec la viabilité neuronale diminué qui se produit avec l'âge. Dans le cerveau tranche électrophysiologie goujons, une augmentation du tissu conjonctif, il est plus difficile de visualiser les neurones. Tissu conjonctif accrue rend également plus difficile de dissocier un grand nombre de neurones sains pour les études d'imagerie. En outre, les neurones de jeunes animaux survivent plus longtemps pendant l'enregistrement ou l'imagerie patch clamp. Cependant, l'utilisation de jeunes souris peut être une limitation majeure. L'activité et / ou de réponses à des neurotransmetteurs ou des nutriments circulent neuronale changent avec l'âge. Par exemple, depuis le bilan énergétique est étroitement liée à l'état reproducteur, les neurones hypothalamiques régulant la balance énergétique peuvent réagir différemment en pré-vs animaux après la puberté. En outre, de nombreuses maladies nécessitent un traitement à long terme ou ne manifestent pas avant l'âge adulte. Les principaux exemples de ces maladies sont l'obésité alimentaire ou diabète de type 2. Depuis neurones glucose de détection sont soupçonnés de jouer un rôle dans ces maladies, nous avons développé une méthodologie pour la culture de succès adultes sains neurones HVM pour une utilisation dans l'imagerie de MPD experiments.

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Protocol

Une. Animaux

  1. Toutes les procédures ont été approuvées par l'établissement de soins et d'utilisation des animaux Comité à l'Université de médecine et de dentisterie du New Jersey.
  2. maison de groupe mâle C57BL / 6 sur un programme de sombre lumière/12 h 12 h et de permettre l'accès ad libitum à l'eau et de la nourriture. Sacrifier à l'âge de 4-5 mois. L'euthanasie des souris a été effectuée en utilisant le plan de l'anesthésie chirurgicale et une forme secondaire de l'euthanasie (c. pénétrant incision dans la cavité thoracique par le diaphragme). Ceci est cohérent avec les lignes directrices de l'AVMA sur l'euthanasie.

2. Préparation de perfusion de solutions, Lamelles de, verre Pipettes et médias

  1. Préparer une solution de perfusion 1L constitué de 2,5 mM de KCl, MgCl2 7 mM, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 28 mM NaHCO 3 mM CaCl2 0,5 mM de glucose 7, 1 mM d'ascorbate, et mM pyruvate 3 distillée dH 2 O. Réglez l'osmolarité à ~ 300 mOsm en utilisant environ 80 g / L de saccharose. Oxygéner par barbotage avec 95% O 2/5% CO 2 et ajuster le pH à 7,4. Chaque expérience, il faudra environ 200 ml de solution de perfusion. Des aliquotes peuvent être stockées à -20 ° C pendant jusqu'à 2 mois.
  2. Faire 250 ml Neurobasal mère contenant médias Neurobasal sans glucose, 2,5 mM de glucose, et 100 U / ml de pénicilline streptomycine. Réglez l'osmolarité du stock Neurobasal à 280 mOsm par le saccharose. Faire 500 ml Hibernate mère contenant Hibernate Un média sans glucose, 2,5 mM de glucose, et 100 U / ml de pénicilline streptomycine.
  3. Mélanger les deux stocks ainsi et filtre stériliser utilisant Stericup vide unités de filtration. Veillez à ne pas introduire de glucose ou d'autres contaminants dans les verres ou sautés bars. Enveloppez les bouteilles en aluminium pour protéger les médias de la lumière et conserver à 4 ° C pendant 2 mois.
  4. La flamme du bout des 4 pipettes en verre autoclave (9 po) de sorte que les conseils ne sont pas lodiamètres nger vives et l'ouverture sont de grande taille (~ 0,9 mm), moyenne à grande (~ 0,7 mm), moyen (~ 0,5 mm), et de petite taille (~ 0,3 mm). La plus grande devrait être à peine polie et la plus petite doit être environ un tiers de ce diamètre.
  5. Le jour avant la récolte des neurones, quatre lamelles de verre de 25 mm de nettoyage à l'aide de 70% d'éthanol et passant au-dessus d'une flamme du bec Bunsen. Placer chaque lamelle dans une boîte de culture de 35 mm stérile et ajouter 2 ml de poly-D-lysine stérile 1% en DH 2 O. Mis les petits plats dans un incubateur (37 ° C) pendant une nuit. Le lendemain, laver avec dH 2 O stérile de 3x et permettre à lamelles sécher complètement.
  6. Faire 75 aliquotes de 1 M d'acide lactique et 200 aliquotes de GlutaMAX; conserver à -20 ° C. Décongeler complètement des parties aliquotes de l'acide lactique et GlutaMAX avant l'utilisation pour assurer l'homogénéité.
  7. Le jour de neurones de récolte, faire 30 ml de milieu de culture frais constitués de Hibernate Un stock contenant de l'acide lactique 1 mM, 0,5 mM GlutaMAX, et 2% B27 sans insuline. VoRTEX et ajuster le pH à 7,4 en utilisant du NaOH 1 N.
  8. Mettez 10 ml de milieu de culture dans un 60 mm verre boîte de Pétri sur de la glace, mettre 2 ml dans un tube de 15 ml conique sur glace et conserver les médias reste à la température ambiante.
  9. Le jour de neurones de récolte, faire 25 ml de milieu de croissance frais comprenant des Neurobasal mère contenant 1 mM d'acide lactique, mM Glutamax 0,5 et 2% B27 sans insuline. Vortex et ajuster le pH à 7,4 en utilisant du NaOH 1 N. Laisser le milieu de croissance frais de s'équilibrer dans un incubateur (37 ° C, 5% CO 2) pendant au moins 30 min.

3. Perfusion cardiaque

  1. Décongeler complètement la solution de perfusion 200 ml et oxygéné avec 95% O2 / 5% de CO 2 sur la glace pendant au moins 15 min.
  2. Laver une lame de vibratome avec de l'acétone, éthanol à 70%, et dH 2 O. Placez la lame dans le vibratome.
  3. Rincer la chambre de refroidissement vibratome et tubulure de perfusion avec dH 2 O. Remplir la chambre de refroidissement (4 ° C) Avec une solution de perfusion et de continuer à oxygéner.
  4. Anesthésier une souris avec du pentobarbital sodique 50 mg / ml, dilué à 1:1 avec de l'eau stérile, injectés par voie intrapéritonéale. Vérifiez la souris est totalement anesthésié par pincement de la queue et en observant l'absence de réponse.
  5. Verser la solution de perfusion à basse température dans le réservoir et la tubulure de perfusion juste avant la dissection. Enregistrer 20-30 ml pour dissection du cerveau et de continuer à oxygéner sur la glace. L'écoulement par gravité à partir d'une seringue de 60 ml élevée à travers un tube et une aiguille 20 G fournit un débit suffisant. Laisser la solution à courir jusqu'à ce que les bulles d'air sont lavés. Continuer à oxygéner.
  6. Coupez la peau au-dessus de la cage thoracique de la souris. Soulevez la cage thoracique et de faire soigneusement une coupe horizontale à travers le diaphragme. Effectuer deux coupes latérales à travers la cage thoracique vers le haut vers les bras pour exposer le coeur. Utilisez une pince pour retenir la cage thoracique.
  7. Faites un petit 2 mm coupe dans l'oreillette droite de fournir un point de sang pour être lavé de la vascu de sortiesystème de lar.
  8. Perforer le ventricule gauche avec l'aiguille de perfusion, juste assez pour insérer l'ouverture de l'aiguille. Tenez l'aiguille en place avec une main et démarrer le flux de la solution de perfusion avec l'autre main. Après 10 à 15 ml de solution de perfusion, le sang doit être éliminé par lavage et l'effluent effacera.

4. Cerveau tranchage et dissection

  1. Après la perfusion cardiaque, transfert oxygéné solution froide de perfusion à une boîte de Pétri sur la glace juste avant de les utiliser.
  2. Décapiter rapidement, retirez le cerveau du crâne et de placer le cerveau dans la solution de perfusion. Pour retirer le cerveau: tirer la peau de l'avant, faire une coupe de la ligne médiane dans le crâne vers les orbites, faire 2 découpes latérales vers chaque œil, utilisez une pince pour retirer chaque côté du crâne, faire une coupe coronale entre les orbites, et utiliser une spatule pour amadouer doucement la cervelle dans la solution de perfusion. Utilisez des ciseaux pour couper les voies optiques si nécessaire. Ne pas toucher l'hypothalamuszone de c et ne tirez pas sur les voies optiques, car cela met trop de pression sur l'éminence médiane et tissus hypothalamiques sous-jacent.
  3. Utiliser une lame de rasoir et une aiguille pour couper latéralement le tissu cérébral d'environ 3 mm en arrière et en avant de l'hypothalamus alors que le tissu est immergé (bregma -3,52 mm). Il est particulièrement important pour la coupe de côté antérieur soit mis à niveau afin que le cerveau va s'asseoir directement sur le mandrin vibratome.
  4. Retirez le tissu cérébral restant de la solution et utiliser du papier filtre pour évacuer la solution de la section du cerveau monté.
  5. Placez une goutte de super glue sur un mandrin de vibratome et étendre la colle à la taille du cerveau. Mettre le tissu cérébral sur le dessus de la colle avec la face antérieure tournée vers le bas et l'hypothalamus en regard de la lame. Wick l'excès de colle et placez le mandrin dans la chambre de refroidissement vibratome. Faites attention de ne pas laisser de colle car il bulle autour du cerveau lorsqu'il est placé dans une solution.
  6. Avec la Vibratome mettre à une vitesse lente (niveau 2) et de grande amplitude (niveau 9), 300-500 um faire tranches jusqu'à l'aire hypothalamique. Maintenant, assurez-minces 100 um tranches de coupe de la partie postérieure de la partie antérieure. Les repères visuels sont les suivants. Postérieure à l'hypothalamus du troisième ventricule sera très faible (bregma -2,70 à -2,30 mm). Au bregma -2.30 mm, le troisième ventricule est séparé en dorsale et ventrale sections sur la tranche coronale.
  7. Une fois les sections de la troisième fusible du ventricule, faire deux 500 um tranches qui contiendra la région correcte du VMH (bregma -2,18 à -1,22 mm). En avant de la VMH, le troisième ventricule ne s'étend plus à l'étage ventrale du cerveau (bregma -1,06 à -0,82) 8.
  8. Transférer ces tranches de la boîte de Pétri sur de la glace contenant des milieux de culture. Disséquer le VMH (VMN + ARC), comme illustré sur la figure 1. Utiliser une pipette pour transférer délicatement les morceaux VMH dans 2 ml de milieu de culture sur la glace.

5. Dissociation et de la culture

  1. Retirez le VMH de glace et placer à température ambiante. Ajouter 20 U / ml de papaïne à 4 ml de milieu de culture. Retourner à mélanger et placer dans un bain d'eau à 34 °. Vérifier et mélanger par inversion chaque minute jusqu'à ce que les médias de la digestion est plus trouble. Filtrage (0,22 um) dans un flacon stérile et transférer le tissu sur le support de digestion.
  2. Digérer le tissu en agitant à 100 rpm à 34 ° C pendant 30 min.
  3. Préparer 1 ml de milieu contenant 8% de sérum albumine bovine (BSA) pendant la digestion. Dissoudre 80 mg de BSA dans 1 ml de milieu de culture et le filtre (0,22 um) dans un tube conique.
  4. Laver le tissu par le transfert de 5 ml de milieu de culture dans un tube conique et une fois lentement inverseuse.
  5. Ajouter 30 ul DNase enzyme à 6 ml de milieu de culture et mélanger pour faire les médias de trituration. Aspirer les médias de lavage et ajouter 3 ml de milieu de trituration.
  6. Utilisez les pipettes en verre à triturer dans l'ordre de lArgest au plus petit. Triturer doucement 10x et attendre 4 minutes pour les gros morceaux à régler. Utilisez la seconde pipette pour transférer les 2 premiers ml contenant une suspension de cellules dissociées dans un nouveau tube conique. Ajouter 2 ml de milieu de trituration, triturer 10x et attendre 3 minutes. Utilisez le troisième pipette pour transférer les 2 premiers ml de la suspension cellulaire. Ajouter 1 ml de médias de trituration, 5x triturer et attendre 2 min. Utiliser la quatrième pipette pour transférer la partie supérieure de 2ml de la suspension cellulaire.
  7. Couche la suspension cellulaire dissociée au-dessus de 8% de BSA, en faisant attention de ne pas mélanger. Centrifuger à 1000 rpm pendant 5 min.
  8. Placer l'autoclave 6 mm x 8 mm clonage cylindres dans le centre de chaque lamelle. Les lamelles couvre-doivent être complètement secs. Aspirer et remettre en suspension le culot dans 440 milieux de croissance ul chaud. Remplissez le clonage cylindres avec la suspension neuronale et le placer dans l'incubateur pendant 20 min.
  9. Retirez les cylindres de clonage et très laver délicatement les débris. Remplir chaque plat wie 2 ml de milieu de croissance. Laisser les cellules se rétablir pendant au moins 1 h avant que les tests sont réalisés.

6. Préparation pour MPD Imaging

  1. Ajoutez la solution d'enregistrement constitué d'mM NaCl 121 mM, KCl 4,7, CaCl2 2 mM, 0,1 mM de MgCl2, 1,2 mM de MgSO 4, 0,97 mM de K 2 HPO 4, 0,23 mM de KH 2 PO 4, 5 mM NaHCO 3, et 25 mM HEPES. Ajuster le pH à 7,4.
  2. Ajouter glucose pour rendre la solution faible de test de glucose souhaité (de 0,1 à 2,0 mM de glucose). Bien mélanger et réserver 400 ml de solution faible d'enregistrement de glucose. Ajouter glucose dans les 600 ml restants pour obtenir une solution d'enregistrement de 2,5 mM de glucose et bien mélanger.
  3. Protéger colorant de la lumière autant que possible. Ajouter 4 ml de la température ambiante tampon dans un flacon bleu MPD. Bien mélanger et ajouter 5 pi colorant par solution d'enregistrement ml. Conserver la solution homogène en mélangeant avec une pipette entre les deux solutions. Le colorant fluorescent contient molecules, qui entrent dans les cellules de la dépolarisation, et l'extincteur molécules, qui ne peuvent pas traverser la membrane cellulaire. Des aliquotes peuvent être stockées à -20 ° C et utilisées dans les 4 jours. Ne gel-dégel plus d'une fois.
  4. Incuber les cellules dans 2 ml d'une solution 2,5 mM de glucose, plus de l'enregistrement de colorant à 34 ° C pendant 30 min. Un bloc de chauffage à sec peut être utilisé. Protéger de la lumière.
  5. Préparer des pompes seringues et le système de perfusion avec 2,5 mM et 0,1 mM solutions d'enregistrement ainsi que la teinture. Tubes de 60 ml seringues doit être connectée à un collecteur.
  6. Après l'arrêt d'une pompe, attendre pour ~ 10 secondes avant les solutions de commutation au niveau du collecteur pour éviter l'accumulation de pression dans la seringue. Les changements de pression modifient distribution de fluide à la chambre fermée contenant les neurones, ce qui provoque des changements dans microscope focalisation lors de l'expérience et de la distorsion des images.
  7. La tubulure de sortie de collecteur doit être connecté à un dispositif de chauffage en ligne et ensuite des tuyaux en polyéthylène, qui se raccorde à une chambre fermée. Bulles doivent être effacés et le débit de perfusion doivent être fixés à 0,5 ml / min. Protéger de la lumière.
  8. Transfert 25 mm lamelle avec les neurones adhérentes à la chambre fermée, en faisant attention de ne pas laisser lamelle sécher et ne pas introduire de bulles d'air. La barbotine est aligné dans les rainures de la pièce de fond, quelques gouttes de solution d'enregistrement sont placés le long des côtés, et la pièce supérieure sont équipés pour tenir doucement la lamelle couvre-objet en place.
  9. Utilisez un compte-gouttes pour remplir la chambre avec une solution d'enregistrement et puis placez une lamelle de 18 mm sur le dessus. S'adapter doucement anneau blanc dans la chambre de tenir la petite lamelle en place. Appuyez très lentement et modérément pour éviter les bulles d'air étant introduit dans la chambre fermée.
  10. Démarrer la pompe de la seringue pour la solution d'enregistrement de glucose 2,5 mM, appuyez sur l'anneau blanc, et se connecter à la chambre fermée. Relâchez doucement la pression de l'anneau blanc et se connecter à tube menant à un conteneur à déchets.
e "> 7. MPD Imaging

  1. Centrez les neurones en utilisant peu de lumière sur fond clair. Essayer de minimiser la quantité de temps les cellules sont exposées à la lumière.
  2. Laisser le système de perfusion à courir pendant 10 min pour permettre la stabilisation de la température, de concentration et de colorant équilibre.
  3. Lors de l'amorçage, ouvrez le programme MetaMorph et prendre une image de champ lumineux (10X) des neurones. Utilisez la fonction Auto-Focus pour prendre 3 piles d'images fluorescentes (150 ms, filtre Cy3 étroite, 10X) et déterminer l'orientation à 5 um. A la fin de la période d'amorçage de 10 min, vérifier la mise une fois de plus.
  4. Commencer à enregistrer des images fluorescentes toutes les 30 secondes pendant 40 min. Établir une base de référence à 2,5 mM de glucose pendant 10 min, puis baisser le glucose pendant 15 minutes, et enfin revenir à 2,5 mM de glucose pendant 15 min. Les solutions sont modifiées par l'arrêt d'une pompe de seringue, en attendant 10 secondes, en tournant d'un port sur le collecteur, et de commencer une autre pompe à seringue. Les changements doivent se produire avant souhaités points de temps based sur le décalage entre le collecteur et les cellules.
  5. Après avoir enregistré toutes les images fluorescentes, prendre une image de champ lumineux des neurones.

8. Analyse MPD Imaging

  1. MetaMorph utiliser pour créer des régions de forme ovale autour de chaque cellule dans l'image de champ lumineux prise à la fin de l'expérience. Les régions devraient être légèrement plus grand que chaque neurone et peuvent être réalisés en dehors de 1 pixel de bord sombre de la cellule. Ne choisissez pas des cellules qui sont insalubres, chevauchement, ou à proximité de débris. Les cellules malsaines apparaissent souvent sombre. Enfin, créer des 5 grandes régions ovales dans des zones où aucun des cellules ou des débris pour les mesures de fond.
  2. Transférer les régions à toutes les images fluorescentes et inspecter pour vérifier qu'aucun mouvement / changement s'est produit. Utilisez la fonction de mesure pour enregistrer l'intensité de fluorescence de chaque région pour toutes les images dans un fichier Excel. L'utilisation des revues en Metamorph est conseillé.
  3. Dans Excel, créez une moyenne de 5 régions d'arrière-plan pour chaque Déessimage ent. Il s'agit de la valeur initiale moyenne à chaque point de temps. Pour chaque point image / temps, il faut soustraire le fond de toutes les mesures de la région. L'intensité de fluorescence de fond soustrait sera dénommé ci-après l'intensité.
  4. Pour chaque cellule, calculer l'intensité moyenne pendant 2-8 minutes de l'enregistrement. Cela représente la ligne de base de la cellule dans 2,5 mM de glucose. Un tampon de 2 minutes sur les deux extrémités de chaque traitement est utilisé pour réduire le bruit.
  5. Pour chaque cellule, calculer la variation de pour cent du niveau de référence: (Intensité-base) / de base
  6. Créer un graphique de ligne avec le changement de pour cent du niveau de référence en fonction du temps.
  7. Calculer le changement pour cent en moyenne par rapport au départ pendant 18-23 minutes. Calculer le changement pour cent en moyenne par rapport au départ pendant 35-40 minutes. Bien que le traitement d'image n'est pas utilisé, le bruit est réduit par l'intermédiaire du calcul de la moyenne de l'intensité à l'intérieur de chaque région de cellule, la soustraction du fond, et le calcul de la moyenne de l'intensité de la région en 5 min or plus.
  8. Des expériences de contrôle, dans lequel la solution d'enregistrement de glucose 2,5 mM est échangée avec une solution d'enregistrement de glucose 2,5 mM doivent être effectuées afin de déterminer le seuil de bruit. Calculer le changement pour cent en moyenne par rapport au départ pendant 18-23 minutes pour au moins 6 plats et 3 souris. Déterminer la moyenne et l'écart-type de ces valeurs.
  9. Régler le seuil d'une réponse de dépolarisation positive à la moyenne plus 2 écarts-types. La moyenne plus 2 écarts-types correspond à une différence avec p <0,05. Nos expériences de contrôle ont montré une variation de 10% du niveau de référence en tant que valeur de seuil appropriée.
  10. Pour chaque cellule, d'évaluer la réponse de dépolarisation réversible en fonction de deux critères. En premier lieu, le changement de la ligne de base moyenne pour cent pendant 18 à 23 minutes doit être supérieure à 10%, le seuil déterminé à l'étape précédente. Deuxièmement, le changement pour cent en moyenne par rapport au départ pendant 35-40 minutes doit être inférieure à la moitié de la variation moyenne des pour cent debase pendant 18-23 minutes. Le deuxième critère a été choisi car il a été trouvé à être plus rigoureux que la stimulation avec le glutamate ou KCl. Neurones malsaines répondent souvent à une stimulation par le glutamate ou KCl même si leurs réponses à une diminution du glucose ne sont pas réversibles.
  11. Pour chaque plat, calculer le% de neurones dépolarisés. Cette valeur est utilisée pour quantifier le% de neurones digestifs chez les différents groupes de traitement.

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Representative Results

La dissection précise du VMH l'écart des autres zones hypothalamiques est important d'obtenir des résultats cohérents. L'inclusion d'autres domaines pourrait diluer la population neuronale VMH, changer le% de neurones dépolarisés calculées. En outre, les neurones de détection de glucose ont été identifiées dans d'autres régions hypothalamiques, tels que l'hypothalamus latéral, qui peut différer fonctionnellement et mécaniquement à partir de la détection de glucose dans les neurones VMH. Figure 1 illustre les emplacements anatomiques correctes pour dissection appropriée. Suivant le protocole ci-dessus, le tissu cérébral contenant la région correcte VMH peut être dissocié. En outre dissection de séparer précisément la VMN et ARC, tout en conservant l'intégralité de chaque sous-population, peut ne pas être possible. Figure 2 montre un exemple de saine dissocié neurones HVM. Utilisation immunocytochimie, nous avons confirmé que notre préparation est> 90% neuronale. Seuls les neurones sains devraient être utilisés pour analyse de donnéessis et plats avec trop de neurones malsains devraient être jetés. Les neurones qui sont insalubres ont souvent des bords très sombres, prendre le MPD à une plus grande mesure, et ont des formes irrégulières. En outre, les neurones doivent être étalées à une densité telle que la plupart des neurones ne se touchent pas les uns les autres pendant l'enregistrement. Neurones choisis pour l'analyse ne doivent pas toucher d'autres cellules ou de débris.

Les données obtenues à partir d'enregistrements d'un neurone et un neurone GI nonGI sont présentés dans la figure 3. Après l'obtention d'une ligne de base pendant 10 min, le glucose extracellulaire a été diminué de 2,5 à 0,1 mM. Le neurone IG montre une réponse robuste réversible supérieur au seuil prédéterminé de variation de 10% du niveau de référence. L'augmentation de la fluorescence reflète la dépolarisation. Bien que les réponses d'hyperpolarisation neuronale GE sont également détectés, la fréquence est trop faible (<1% des neurones) pour une utilisation avec succès de cette technique sur ce sous-type de neurone de détection du glucose. Une gamme de glucos physiologiquese diminutions ont été testés et le pourcentage de neurones qui VMH dépolarisée de façon réversible a été calculé pour chaque boîte. figure 4 montre que la relation positive entre la grandeur de la diminution du glucose et le pourcentage de dépolarisation des neurones. Cela démontre que la culture primaire réussie de neurones murins adultes peut être utilisé en conjonction avec l'imagerie de fluorescence pour permettre l'étude des adultes VMH neurones digestifs.

Figure 1
Figure 1. Coupe frontale avec des marqueurs pour la dissection VMH correct. Le tissu disséqué contient la VMN et ARC avec un minimum de contamination d'autres zones hypothalamiques. Coupes diagonales doivent être fabriqués à partir de ~ 25-30% en dessous du haut de la troisième ventricule à ~ 25-30% entre le point où le cortex répond à la zone de l'hypothalamus (bleu *) et le troisième ventricule(3V). Adapté du bregma -2,8 mm Paxinos et Watson 1998 9, correspondant à cerveau de souris bregma-1.7mm. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 2
Figure 2. image Brightfield de neurones sains VMH de souris adulte. Cette image a été prise 24 heures après la dissociation et a été utilisé pour l'imagerie de MPD. Quelques exemples de neurones qui serait (bleu *) ou ne serait pas (rouge x) être utilisé pour l'analyse sont marquées. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 3
Faigure 3. Représentatives des traces de fluorescence de MPD d'un neurone de GI (ligne verte) et un neurone nonGI (ligne orange). Cellules ont été perfusées avec 2,5 mM de glucose (G) de la solution d'enregistrement pendant 10 min, suivie d'une diminution de 0,1 mM G pendant 15 min et une revenir à 2,5 mM G pendant 15 min. Dans le neurone de GI, le changement de pour cent de la ligne de base a augmenté de plus de 10% au cours de la mM G période de 0,1 perfusion (moyenne de 40% par rapport à 20-25 min) et a diminué à moins de la moitié de cette augmentation dans le mM G période de 2,5 inversion (15 moyenne de 35 à 40% min). Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 4
Figure 4. Le pourcentage de neurones adultes VMH qui dépolariser réversible en réponse à une diminution de glucose détecté en utilisant l'imagerie de fluorescence MPD. Arelation positive existe entre l'ampleur de la diminution de la glycémie et le pourcentage de dépolarisation des neurones. Cliquez ici pour agrandir l'image .

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Discussion

La clé pour être en mesure d'étudier l'activité des neurones de souris adultes est la capacité de dissocier les neurones sains. La dissociation des neurones hypothalamiques de souris adultes est plus difficile à plusieurs étapes clés du protocole par rapport aux neurones de souris juvéniles. Nous avons surmonté ce problème dans un certain nombre de façons. Faire des tranches épaisses de 500 um de cerveau minimise les dégâts mécaniques aux neurones par rapport aux habituels 250-350 um tranches utilisées pour le tissu cérébral des souris plus jeunes. Cependant, des tranches plus épaisses nécessitent une plus grande attention à la perfusion cardiaque et digestion à la papaïne du tissu cérébral. Si du sang est visible sur le tissu cérébral, d'évaluer la précision et le positionnement de la découpe dans l'oreillette droite et l'aiguille placée dans le ventricule gauche. Le débit et la quantité de solution de perfusion peuvent également être ajustés. Une perfusion approfondie est impératif depuis sang est toxique pour les neurones et se traduira par un plus faible rendement de neurones sains. Digestion à la papaïne doit être suffisamment efficace pour permettrede trituration douce et dégagement facile de cellules individuelles de tissu cérébral. Une digestion à la papaïne est suspectée inefficace lorsque le tissu VMH coule rapidement à la fin de la digestion, et lorsque de plus grands morceaux de tissu sont présents au cours de la seconde trituration. Avec une bonne digestion, des morceaux de tissus sont à peine détectés à l'œil nu au cours de la troisième trituration. Si la trituration n'est pas douce, la santé neuronale va souffrir. Si une digestion à la papaïne inefficace est suspectée, la concentration de la papaïne peut être augmentée par 5 U / ml ou un flacon de papaïne peut être utilisé. Cependant, la concentration de la papaïne ne doit pas être augmentée au-dessus de 30 U / ml, puisque cela peut nuire à la santé des neurones.

L'exposition à la BSA est une autre étape importante dans le protocole. Après avoir trituré cellules ont été centrifugées sur le gradient de BSA, à la fois la quantité de neurones de temps sont exposés à de la SAB et de la quantité de BSA autorisé à rester avec le culot doit être minimisée. Le surnageant et le gradient de BSAdoit être aspiré immédiatement après la période de centrifugation. Aspiration sous vide peut être utilisé pour éliminer la majorité de surnageant, mais la dernière ~ 100 ul doit être retirée manuellement à l'aide d'une pipette de sorte que le culot cellulaire ne soit pas perturbé. Un autre aspect important de l'obtention de neurones sains est d'optimiser la densité des cellules. Neurones plaqués sont trop peu pas en aussi bonne santé. Etant donné que très peu de neurones sont obtenus à partir de chaque cerveau de la souris, il n'est pas pratique pour compter les cellules avant l'étalement. Pendant le temps qui serait passé à compter, un nombre important de cellules serait adhérer à la plastique et serait perdu. Utilisation de 4 plats par souris (~ 1 x 10 4 cellules / ml) comme point de départ, la détermination empirique du nombre de plats est l'approche la plus pratique pour atteindre la densité de neurones optimal. Le rendement des neurones VMH de souris âgées peut être devrait être d'environ la moitié de la production de jeunes souris. En outre dépannage pour améliorer le rendement neurone implique la quantification des neurones restantsà chaque étape du protocole de dissociation d'identifier des mesures d'attrition neuronale lourd.

Grâce à notre protocole, les neurones dissociés en bonne santé peuvent survivre dans la culture jusqu'à 2-3 jours. Cependant, l'utilisation de milieux de culture d'astrocytes conditionné filtré neurones permet de survivre jusqu'à 2 semaines en culture. Les milieux de culture peuvent être conditionnés par incubation sur des astrocytes primaires confluentes pendant la nuit. Les astrocytes provenant de la même souche de rongeur, le sexe, et la région du cerveau devraient être utilisés. Bien que l'utilisation des médias d'astrocytes conditionné introduit une autre variable, cette modification peut être nécessaire pour des expériences alternatives nécessitant plus de temps dans la culture. En outre, pour des raisons qui ne sont pas claires, nous avons constaté que la capacité de sentir le glucose est facile de perdre la santé neuronale sous-optimale, malgré le maintien de réponses à d'autres stimuli, tels que le glutamate. Ainsi, des précautions supplémentaires doivent être prises. Pour observer les réponses neuronales à une diminution du glucose, il est impératif d'éviter contaminatipar des bactéries, des moisissures, des sels, du savon, et le glucose. Toute la verrerie et des matières plastiques non stériles doivent être lavés à fond avec dH 2 O. Outre les contaminants vivant, les détergents et les sels affecteraient l'intégrité et de l'activité neuronale. De petites quantités de glucose pourrait changer de façon significative les concentrations de glucose. Cela perturbe les résultats depuis neurones glucose de détection sont très sensibles à de faibles variations de glucose extracellulaire au sein de la gamme physiologique nonhyperglycemic de 0,1-2,5 mM 10,11.

Lors de l'utilisation d'imagerie de MPD, la cohérence et l'expérimentation côte-à-côte entre les groupes de traitement sont essentielles pour obtenir des résultats significatifs. Groupes de traitement doivent être testés le même jour si possible ou au moins les jours en alternance. Cela minimise les variations possibles des préparations de culture ou aliquotes MPD. En outre, nous avons trouvé la moindre variation se produit lorsque l'imagerie est effectuée dans les 24 heures de neurone dissociation pour les raisons mentionnées ci-dessus. Puisque les résultatssont analysés comme un% de dépolarisation des neurones, l'exactitude et la cohérence dans VMH dissection et préparation neuronale est également essentiel. La population neuronale VMH globale récoltée doit être constante et ne doit pas contenir neurones provenant d'autres régions. Ainsi, le protocole ci-dessus doit être suivi de près et avec précision. Toutefois, si d'autres expériences doivent être effectuées et l'entretien de la population n'est pas une préoccupation, poinçons de tissus peuvent être faites pour isoler les neurones VMN ou ARC.

Les méthodes décrites ici établir comment récolter les neurones sains VMH d'une souris adulte et la façon d'utiliser l'imagerie MPD pour étudier les neurones de glucose détection. Au lieu de cela, des expériences peuvent être conçus pour examiner les réponses neuronales VMH à des stimuli autres que les changements de glucose. En variante, le protocole de dissociation peut être extrapolée à des neurones de récolte à partir d'autres régions du cerveau. Utilisation de neurones de souris adultes, les études peuvent maintenant être effectuées en utilisant des modèles murins de maladies qui se développent ou progrès avec l'âge. Moreover, les neurones adultes en bonne santé peuvent être en outre étudiés en utilisant des techniques autres que l'imagerie par MPD telles que l'imagerie de calcium, l'électrophysiologie, une seule cellule de PCR, immunocytochimie ou une combinaison de ces techniques.

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Disclosures

Nous n'avons rien à communiquer.

Acknowledgments

NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal-A Medium (Custom) Invitrogen 0050128DJ custom made glucose free
Hibernate-A Medium (Custom) BrainBits custom made glucose free
Penicillin streptomycin (20,000 U/ml) Invitrogen 15140 other vendors acceptable
Stericup vacuum filter units (0.22 μm) Millipore other vendors acceptable
25 mm Glass coverslips Warner #1 25mm round
18 mm Glass coverslips Warner #1 18mm round
GlutaMAX Invitrogen 35050
B27 minus insulin (50x) Invitrogen 0050129SA
Razor blade VWR 55411
Vibratome & cooling chamber Vibratome Series 1000 Sectioning system
Vibratome blades Polysciences 22370 injector or double edge blades from other vendors acceptable
Papain, suspension Worthington LS003124
BSA, suitable for cell culture Sigma other vendor acceptable
DNAse, for cell culture Invitrogen other vendor acceptable
cloning cylinders, 6 mm x 8 mm Bellco Glass 2090-00608
Membrane Potential Dye (blue) Molecular Devices R8042
In-line heater Warner SF-28
Syringe pumps WPI sp100i other vendor acceptable
Closed chamber Warner RC-43C
Polyethylene tubing Warner PE-90
Metamorph Molecular Devices alternate image analysis software acceptable
Microscope Olympus BX61 WI

used with 10X objective

Camera Photometrics Cool Snap HQ
Narrow Cy3 Filter Set Chroma 41007a
Illumination System Sutter Instruments Lambda DG-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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