相互作用するリガンドおよび/またはアンタゴニストと、哺乳動物核内受容体残基を同定するために逆酵母ツーハイブリッドシステム

1Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine, 2Shanghai Key Laboratory of Complex Prescription and MOE Key Laboratory for Standardization of Chinese Medicines, Institute of Chinese Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
* These authors contributed equally
Biology

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Summary

ケトコナゾールに結合し、プレグナンX受容体(PXR)の活性化に拮抗する。 PXR変異体の酵母ハイスループットスクリーニングは、ケトコナゾールが結合するための独自の領域を規定する。この酵母ベースの遺伝的方法は、表面結合部位と会合したリガンドを有する新規な核内受容体相互作用を検出します。

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Li, H., Dou, W., Padikkala, E., Mani, S. Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists. J. Vis. Exp. (81), e51085, doi:10.3791/51085 (2013).

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Abstract

薬物代謝および炎症の重要な調節因子として、プレグナンX受容体(PXR)は、代謝、炎症( 例えば脂肪肝) の1,2を結ぶ疾患の病態生理に重要な役割を果たしている。 PXRのアゴニストリガンドの同定に多くの進歩があったが、薬物様拮抗薬およびPXR 3,4,5上のそれらの結合部位の限られた記述があります。重大な障壁を効率的PXRは1998年にクローニングされ、特徴付けられたという事実にもかかわらず、拮抗薬との構造の研究のために、完全長のタンパク質を精製することができないことであった。当研究室では、PXR 6に結合残基、アンタゴニスト、ケトコナゾールのを定義するのに基づく新規のハイスループット酵母ツーハイブリッドアッセイを開発しました。我々の方法は、ケトコナゾールと対話することが期待PXRのAF-2表面上の単一変異の効果を救うだろ突然変異のライブラリを作成する必要があります。救助または「機能獲得型」セコndは突然変異はPXRにケトコナゾールの遺伝的相互作用および表面残基(複数可)に関する結論が実現可能であるようにすることができる。従って、我々はそのコアクチベーター、SRC-1との相互作用PXR変異体の高スループットツーハイブリッド酵母画面を開発しました。酵母は抗真菌薬、ケトコナゾールの研究に対応するように変更されたこのアプローチを、使用して、我々は、ケトコナゾールに結合することができないのクローンが濃縮されたPXRに特定の変異を実証できた。逆論理によって、我々は、元の残基はケトコナゾールとの直接的な相互作用残基であると結論付けている。このアッセイは、核内受容体表面上の結合部位アンタゴニストをスクリーニングするための新規な、扱いやすい遺伝的アッセイを表す。このアッセイは、酵母、ならびに標準的な構造生物又はプロテオミクスベースの方法を使用して研究することができない細胞タンパク質(単数または複数)に関係なく、その細胞傷害能の任意の薬物に適用することができる。潜在的な落とし穴は、データの解釈(相補メソッド便利)、信頼を含めるシングルY2H法、酵母を取り扱うまたは酵母ツーハイブリッドアッセイを実施する専門知識、およびアッセイの最適化にある低インピーダンス。

Introduction

酵母ツーハイブリッド(Y2H)アッセイが広くタンパク質-タンパク質相互作用を発見するために使用され、より最近では、タンパク質-タンパク質相互作用複合体7、図8、図9、図10、図11を破壊する新規な小分子の発見のために。しかし、このアッセイの従来のアプローチは、創薬または「ヒット」のために使用、改変された時にはまだ相互作用し、改変された残基11の尋問を可能にすること、タンパク質-タンパク質表面内の化学薬品化合物のアロステリック相互作用残基の検出を可能にしない。実際に、このような方法(単数または複数)は、開発することが可能であれば、タンパク質 - タンパク質相互作用の破壊のための重要なアロステリック相互作用残基のハイスループット評価に扱いやすい酵母系を可能にする。薬物発見の文脈において、タンパク質と化合物の相互作用を確立するための最も直接的な方法は、構造決定(タンパク質-阻害剤複合体、例えば crystalization)を含むであろう。これらのメソッドは中出しですbersome、精巧なリソースを使用し、それはすべてのタンパク質上の構造研究を行うことは技術的に実現不可能である。

扱いやすい遺伝的薬剤スクリーニング系は、細菌、1,2および哺乳動物ツーハイブリッドなどの他のモデル系において確立されている。しかしながら、これらのシステムは、Y2Hのような最適化お​​よび代替システムがまだほとんどの薬物発見で試験する必要がある。乏しい感度および特異法13を用いて相互作用の信頼性を含む限界があるが、単一のY2Hアッセイは、相互作用残基に関する特定の質問に答えるように改変することができる。核内受容体研究の分野において、Y2Hは、相互作用タンパク質14を定義するために使用されてきたが、これらのタンパク質相互作用はほとんど/アンタゴニストは、核受容体-タンパク質複合体と相互作用するリガンドた性質を定義するために使用されていない。したがって、我々の研究室では、特にありません受容体タンパク質のために、メソッドを定義することに力を注い逆Y2Hベースの検出プラットフォームを使用して残留物を相互作用新規リガンド/アンタゴニストを発掘だろ基づく方法を、プロテオミクスに容易に適用できる。

ケトコナゾールはPXRとその活性化因子SRC-1を破壊という我々の以前の知見に基づいて、我々は小説はPXR 6にケトコナゾール作用する残基を定義して、質問するために私達を可能にするY2H系を逆に開発しました。我々の方法は、DNA結合および転写活性化に関与する分離可能なドメインからなる酵母GAL4タンパク質の特性に基づく。タンパク質はGAL4活性化ドメインとの融合体として発現される完全長クチベーターSRC-1(ステロイド受容体コアクチベーター1)しながら、PXR LBDタンパク質はAD(LexAのDNA結合ドメイン(DNA-BD)との融合体として発現される)。 PXR及びSRC-1融合タンパク質間の相互作用は、酵母genomに統合されたレポーター遺伝子β-LacリZを含有するGAL4結合部位の転写活性化をもたらすE。ケトコナゾール、PXRアンタゴニストは、PXR及びSRC-1の相互作用15、16、17を破壊し、我々はX-gal活性のためのフィルター上のコロニーを染色した後、ケトコナゾールの存在下又は非存在下でPXR及びSRC-1との相互作用を検出することができる。 Y2Hの原理は、図1に示されており、実験手順を図2にまとめる。

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Protocol

1。酵母ベクターにおけるPXRとSRC-1融合の構築

  1. ヒトPXR LBD(107から434アミノ酸)およびヒトSRC-1完全長(アミノ酸1から1401)のPCR増幅。
    1. SRC-1テンプレートとしてをpCMX-SRC1プラスミドを使用し、PXR LBDテンプレートとしてのpSG5-hPXRプラスミド8を使用してください。
    2. 雪解けのPCRのSuperMix、DNAテンプレートとプライマーは(材料を参照)、氷上で保管してください。
    3. 0.25μgの/μLDNAテンプレート1μL、10 mMのプライマー対2μLそれぞれ、PCR法のSuperMix 45μL追加し、50μlに全量を、H 2 Oを加える。
    4. 2分2分、30秒、94℃で20サイクル、30秒、55℃、72℃、94℃の1サイクルでのPCRを設定し、拡張のための10分間の72℃での1サイクル。 1%アガロースゲル上で実行して、PCR産物を確認する。
  2. PCR産物は、Y2Hベクターにクローニングする。
    1. 1%アガロースゲルからPCR産物を精製する。ダイジェストPXR、LBD、PCR、およびY2HベクトルpSH2-1とBamHIとSalIで、NotΙとSalΙとSRC-1 PCRおよびY2HベクトルpGADNOTを消化。これを行うには、30μlに全量を最終的に1μgのDNAを、3μLの10×反応緩衝液、1μlの制限酵素、及びH 2 Oを加える。
    2. 1時間、37℃の水浴中で消化サンプルを置く。 1%アガロースゲル上で実行して消化を確認する。
    3. 1%アガロースゲルから消化サンプルを精製、ライゲーションはPCR産物とY2Hベクターを消化し、DH5αコンピテント細胞に形質転換する。
    4. コロニーをピックアップし、プラスミドDNAを分離します。
  3. のNotI / SalI消化によってpGADNOT-SRC-1プラスミドDNAを識別をBamHI / SalI消化によってpSH2-1-PXRプラスミドDNAを識別します。配列決定により、すべての正のプラスミドDNAを確認してください。

2。酵母ツーハイブリッドアッセイ

  1. 5ミリリットルのYPADに酵母株を接種し、一定の攪拌(30℃、220回転)で一晩インキュベートする。注: サッカロマイセス·セレビシエ株はCTY10-5Dた(MAT ADE2のTRP 1から901 LEU2-3、112 HIS3-200 GA L4 - GAL80 - URA3 :: のlexA-LacZ)ののlexAオペレータ10と統合されたGAL1-lacZ遺伝子が含まれています。ケトコナゾールに耐性の生酵母細胞を得ることではなく、アゾール耐性18〜20の原因は、CTY10-5D酵母の新規株としてトランスポーターの変化を運ばなかったものが最初に削除ERG3(ERG3の Δ)によって得られ、その後、追加、削除を導入したERG11(ERG3Δ/ ERG11Δ)遺伝子の相同組換えによる。構造の詳細は、以前に公開された原稿6に記載されている。
  2. (午前中)、次の日は、5ミリリットルのYAPD酵母(1:20)に接種し、一定の攪拌(30℃、220回転)により、OD 600〜0.2を得るために、インキュベートする。
  3. 2分間の微量2,000 rpmで細胞をペレットと上清を捨てる。その後PELLEを洗うオートクレーブ水で一回、0.1M LiAc形質との二度トン。
  4. 最後の洗浄後、上澄み液を廃棄し、細胞ペレットに以下の試薬 ​​を追加します。240μLのPEG 3500 50%W / V、36μlの1 M LiAc形質、50μL2 mg / mlの沸騰したサケ精子のssDNA、H 2 Oを34μL。 、ミックス1μgのPSH-PXRおよび1μgのpGADNOT-SRC-1のDNAを加え、混合する渦。
  5. 30分間(30℃で220 rpm)を、丸底チューブをポリスチレン転換を攪拌、混合するミックスを転送します。 42℃の水浴にチューブを移動し、さらに30分間インキュベートする。
  6. 2分間2,000 rpmでチューブを遠心分離し、上澄み液を除去します。オートクレーブ水で一回ペレットを洗浄。
  7. チューブにピペット100μlの滅菌水、タッピング、ピペッティング優しい指で細胞を再懸濁し、-His/-Leuドロップアウトミディアム1リ​​ットル-His/-Leuドロップアウト中につき(製剤のプレート上にプレート:20グラムのブドウ糖、 1.7グラムのYNB、0.67グラムCSM-His/-Leu、5gの硫酸アンモニウム、1.5%寒天)及びセシ形質転換体を単離するための3〜4日間、30℃でubate。

3。のX-galフィルターアッセイ

  1. ペトリ皿の部分のサイズにニトロセルロース膜をカット。向きをマークするためにニトロセルロース膜にラベルを付けます。
  2. 酵母コロニーにpremarkedニトロセルロース膜を配置し、膜が平板培地の表面に接触していることを確認してください。
  3. 膜を取り外し、3mmの濾紙上にコロニー側を上に置き、15分間-80℃で膜、ろ紙を置き。
  4. X-gal溶液を作る。追加50μL(1Lバッファが16.1グラムHPO 4 7H 2 O、5.5グラムののNaH 2 PO 4、H 2 O、0.75グラム2のNaが含まれているZバッファの5ミリリットルに20 mg / mlのX-galおよび15μlのβ-メルカプトエタノール塩化カリウム、硫酸マグネシウム4•7H 2 O 0.25グラム)。 Zバッファを4℃に維持した場合、これらの試薬を添加する前に室温にそれをもたらす。
  5. 3mmの濾紙の二つの円を配置シャーレ内と5ミリリットルのX-gal溶液でそれらを浸す。ペトリ皿から過剰の緩衝液を排出し、コロニー側を上にしてニトロセルロース膜を配置します。
  6. 膜は、ろ紙との完全な接触をしているし、それが完全に濡れていることを確認して蓋を閉じます。ホイルにペトリ皿をラップし、一晩に30分間37℃でインキュベートする。

4。液体のβ-galアッセイ

  1. OD 600 0.7に-His/-Leuドロップ液体培地中の酵母を育てる。
  2. 2分間3,000 rpmで1.5 mlのマイクロ遠心チューブと遠心分離機に1ミリリットル媒体搬送。上清を捨てる。
  3. 、ペレットを再懸濁させ、Zバッファの1ミリリットルを追加します。2分間、再び3000 rpmで遠心分離します。上清を捨てる。
  4. その後、50μlのクロロホルムと20μlの0.1%SDSを加え、混合し、細胞ペレットを再懸濁する2MEとZバッファの150を添加する。精力的に15秒間のサンプルをボルテックスする。
  5. ONPGソリューション(Z bufに1 mg / mlの700μlのを追加します。FER)。タイマーを設定し、黄色が全反応時間を開発し、注意することができるように十分に長い、30℃でインキュベートする。
  6. 反応を停止し、420 nmの吸光度を測定するために、1MのNa 2 CO 3の500を添加する。ブランクは700μlのONPG水溶液を加えた500μlの1 MのNa 2 CO 3である。

ミラーユニット=(*千A420)/(A600 *分*のml)に次のようにミラーユニットを計算する

A420:420 nmにおける吸光度の単位; A600:600 nmにおける吸光度の単位、 :分単位での反応時間; ミリリットル :中の反応容積

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Representative Results

我々は、PXRとステロイド受容体コアクチベーター1(SRC-1)の関連性の比色読み取りを検出できるかどうかを確認するためにアッセイを行った。酵母は有意なステロール生を有するので、予め酵母におけるlacZ発現は、追加の外因性リガンドを必要とせずに誘導することができることが示されている。私たちは、lacZ発現(青色コロニー)もPXRとSRC-1で形質転換された酵母株が誘導されることがわかったが、空のベクター、PXR、または個別に、SRC-1で形質転換された酵母におけるLacZ発現(白コロニー)の誘導はありません( 図3)。ケトコナゾール(25μm)を酵母でPXRとSRC-1の相互作用を妨害するかどうかを判断するには、ケトコナゾールを含むレプリカプレートはエレベーター、ニトロセルロースおよびX-galフィルターを浸漬し、β-ガラクトシダーゼ液体アッセイを実施した。私たちは、(レプリカフィルタからすべてのコロニーは今や白だったので、ケトコナゾールは、酵母におけるPXRとSRC-1の相互作用を破壊ということであったかを示しまた、液体の酵素アッセイと大幅に減少、β-ガラクトシダーゼ活性)( 図4A)で示した。我々は以前PXR変異体(T248E/K277Q)は、強力なリガンド( 例えば 、リファンピシン)によって活性化することができる哺乳動物のアッセイで示すが、ケトコナゾール1 7の拮抗作用を受けないでした。我々は、酵母プラスミドにPXRの二重変異体(T248E/K277Q)を設計した後、SRC-1と酵母の変換を行った場合も同様に、我々はケトコナゾールにさらされたコロニーは、まだLacZ発現( 図4B)を保持することを示すことができた。

図1
図1。概略酵母ツーハイブリッド(Y2H)アッセイの原理を示す。酵母アッセイはRESISTANあるPXRの変異体の単離を可能にする機能的アッセイとして確立されているSRC-1の相互作用の媒介阻害をケトコナゾールに対するT、A、GAL4活性化ドメインに融合されたSRC-1(GAL4AC-SRC-1)とのLexA-DB-hPXR融合タンパク質のリファンピシンにより誘導される2ハイブリッド相互作用。なぜならLacZレポーターののX-galアッセイで青色のコロニーでの相互作用の結果。B、ケトコナゾールの存在が、SRC-1とhPXRのリファンピシンにより誘導される相互作用を破壊する。白色コロニーのX-galアッセイの結果をC、それはケトコナゾールの作用に対する免疫青コロニーが得られますレンダリングhPXR中(アスタリスクで示される)変異の存在、D、我々のアッセイのさらなる修正、将来の可能性X-galアッセイにおけるhPXR-SRC-1相互作用の破壊、したがって、白コロニーにつながる可能性第一の突然変異の効果を無効化(半月で図示)の追加第二のサイトサプレッサー突然変異を組み込む。 LexAOp、LexAのオペロン、GALP、Gal4のプロモーター、lac Z、β-glalactosidase、DB、GALPのLexAOp DNA結合ドメイン;交流、行為ivati​​onドメイン; *、突然変異(群)。 (参照6から再生)。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください

図2
図2。実験的なフローチャートである。

図3
図3。 X-galを、リフトアッセイ、およびβ-galの液体アッセイ酵母、示されたプラスミドおよびX-galをリフトアッセイ(左のパネル)およびβ-galの液体アッセイ(右パネル)に付しめっきコロニーを形質転換した。 PSH空ベクター+ pGADNOT空ベクター( レーン1)、PSH-PXR + pGADNOT空ベクター( レーン2); PSH空ベクター+ pGADNOT-SRC-1( レーン3)、PSH-PXR + pGADNOT-SRC-1( レーン4 </ EM>); 5。 PSH-INI-1 + pGADNOT-c-Mycの(ポジティブコントロール、レーン5)。 (参照6から再生)。

図4
図4。ケトコナゾールは、コアクチベーターと野生型、変異しないPXRの関連付けを破壊し、SRC-1酵母コロニー車両含むプレートにレプリカした。は (0.2%DMSOを、レーン1)またはケトコナゾール(25μM、レーン2)。 X-galのリフトアッセイ(左のパネル)およびβ-galの液体アッセイ(右パネル)を次に実施した。野生型PXR(A、B ライン1および2)およびケトコナゾールミュート突然変異T248E/K277Q(B 線3及び4)、この図に示した。 (参照6から再生)。

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Discussion

私たちの修正Y2Hアッセイでは、PXR 6上のケトコナゾールとの相互作用に重要な残基を同定した。 SRC-1はコアクチベーターである(及びpGADNotベクターにクローニングした)ので、我々はまた、SRC-1は、これが活性化プロフィールを変更および/または漏出性に影響を与えるかどうかをPSHベクター系にクローン化されたときにla​​cZ発現を活性化し得るかどうかを試験した酵母ツーハイブリッドアッセイ。我々はERG3Δ/ ERG11Δを酵母ツーハイブリッドアッセイを行った私たちの再設計されたプラスミドを用いて。前と同様に、我々は、lacZ発現(青色コロニー)もPXR及びSRC-1で形質転換ERG3Δ/ ERG11Δ酵母株において誘導されることを示しているが、空のベクターで形質転換された酵母におけるLacZ発現の誘導(白色コロニー)が存在しない個別PXR又はSRC-1(データは示さず)。我々のアプローチはconventioに適していないタンパク質のための遺伝的相互作用のアロステリックリガンド - タンパク質残基を単離するための強力な新しい方法を提供し、NAL構造生物学および/ ​​またはプロテオームは5,21近づく

記載されたプロトコルは、確認をする必要があり、いくつかの落とし穴があります。まず、検出の感度は、特に、タンパク質 - タンパク質相互作用残基上のそれらの部分的なアンタゴニスト効果は、アッセイの解像度を制限することができる。比色スキャンは、検出の問題21のいくつかを解決するのに役立つかもしれません。第二に、青色のコロニーが存在することは、常に(偽陽性)ケトコナゾール耐性PXR変異を示さないことがあります。 lacZ発現は、SRC-1の相互作用の蛋白質が恒常的に活性または独立したアクティブにPXR内の変異(複数可)にケトコナゾールの存在下で救出される可能性があります。 PXRのような変異体は、自己へのLexA-DB-PXRの能力を試験することにより、真のケトコナゾール耐性変異株と区別することができ、これらの変異体はGAL4AC-SRC-1の非存在下では青色のコロニーが得られます。すなわち 、lacZの発現を活性化する。当然の結果として、変異体は、缶アルこれをさらにLacZを自己活性化のための証拠を記述するためのLexA-DB-SRC-1が存在しない場合にGAL4AC-プラスミドを用いて酵母に導入した。他のY2Hプロトコル/ベクターを13使用された場合と同じ結果が得られるならば第三に、それは未知のままである。第四に、分子内復帰突然変異体(ケトコナゾール耐性変異体の第二の部位サプレッサー変異体)の研究では、結合ファーマコフォアに影響を与える隣接残基を定義することで、結合アンタゴニストの理解に追加することができます。変異体のライブラリーの変更で、1は、突然変異誘発のテンプレートとしてケトコナゾール耐性変異を使用して、より正確に、これを定義することができます。

この方法は、酵母における細胞傷害性ターゲットが十分に確立され又は酵母に向かって潜在的な毒性を有さない薬物(複数可)にされる任意の薬物を組み込むように修正することができる。酵母は、我々は6を示しているように、変更された、まだY2Hアッセイのための実行可能なことができます。このメソッドのパワーも補助的な知らせに依存していますサイト固有の相互作用を知らせ、他のアッセイ( 例えば分子 ​​ドッキング)からATION。さらに、特定の核内受容体/コレギュレーターの相互作用( 例えば nurr77/LKB1、AR/PELP1)は22,23研究することができる。このシステムの扱いやすさは、それがポータブルであるということです、ハイスループットな方法で日以内に行うことができ、高価な試薬や方法を必要としません。

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Disclosures

利害の対立が宣言されていません。

Acknowledgments

この作品は、衛生研究所(NIH)の国立研究所によってサポートされていましたCA127231と(SM)のデイモンラニヨン財団臨床研究者賞(CI 1502)を付与します。我々は彼らの機関やプロトコルの標準化へのこの技術の移植性を議論に彼の有用な洞察のためパラツキー大学オロモウツ、チェコ共和国からの教授ズデニェクドヴォルザークに感謝したいと思います。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast Strain CTY10-5d erg3Δ/erg11Δ Our lab CTY10-5d yeast was double knocked out ERG3 and ERG11 (erg3Δ/erg11Δ) genes6 .
YPD Growth Medium BD Biosciences 630409
Difco Yeast Nitrogen Base (YNB) w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate BD Biosciences 233520
Bacto Agar BD Biosciences 214010
CSM-His/-Leu Complete Supplement Mixture MP Biomedicals 4250-412
ONPG (o-Nitrophenyl Β-D- Galactopyranoside). Sigma-Aldrich N1127
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Luria Broth (LB) Sigma-Aldrich L3022
X-Gal Fisher BP-1615
Sonicated Salmon Sperm DNA boiled (10 mg/ml) Life Technology 156-017
Ampicillin Acros Organics 61177
Ketoconazole Sigma-Aldrich K1003
N,N-Dimethylformamide Acros Organics 326871000
Lithium Acetate Sigma-Aldrich L4158
50% PEG-3350 solution, filter-sterilized Sigma-Aldrich P-3640
Nitrocellulose Membrane Whatman 10402091
10 cm Petri Dish Fisher 875712
5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3' our lab PXR LBD forward primer for pSH2-1
5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3' our lab PXR LBD reverse primer for pSH2-1
5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCATCC -3' our lab SRC-1 forward primer for pGADNOT
5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3' our lab SRC-1 reverse primer for pGADNOT
Platinum PCR Supermix Invitrogen 11306-016
BamHI our lab R0136
SalI our lab R0138
NotI our lab R0189

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References

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