Multilayer-Halterung für Langzeit-Licht-Mikroskopie Blatt der Zebrafisch

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Summary

Die Entwicklung von Zebrafisch kann über Tage mit Licht-Mikroskopie Blatt, wenn Embryonen werden in optisch klare Polymerrohren mit niedriger Konzentration Agarose eingebettet folgen.

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Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish. J. Vis. Exp. (84), e51119, doi:10.3791/51119 (2014).

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Abstract

Lichtbogen-Mikroskopie ist das ideale bildgebendes Verfahren zur Zebrafisch embryonalen Entwicklung zu studieren. Aufgrund des geringen Phototoxizität und Bleichen, ist es besonders für die Langzeit Zeitraffer-Bildgebung über mehrere Stunden bis zu mehreren Tagen geeignet. Es wird jedoch ein entsprechender Proben Montage Strategie benötigt, die sowohl Haft und normale Entwicklung der Probe bietet. Multilayer-Montage ist eine neue Einbettungstechnik mit niedriger Konzentration Agarose in optisch klaren Rohre, überwindet nun diese Einschränkung und entfesselt das volle Potential der Lichtmikroskopie Blatt für Echtzeit-Entwicklungsbiologie.

Introduction

Um die komplexen Ereignisse und Interaktionen während der Embryogenese zu verstehen, ist die Forschung in der Entwicklungsbiologie mehr und mehr Bewegung von Mikroskopie von einzelnen Zellen und Organe in vivo Bildgebung von ganzen Organismen. Traditionelle Mikroskopie-Techniken in der Regel nicht die räumliche und zeitliche Auflösung, um eine schnelle Ereignisse über einen längeren Zeitraum verfolgen und bieten oft dazu führen, Bleichen oder phototoxische Effekte in der Probe ein. Wir und andere gefunden, Lichtbogen-Mikroskopie (Abbildung 1), um die ideale Technik für die in-vivo-Bildgebung der Zebrafisch-4.2 sein. Die Beleuchtung der Probe mit einer dünnen Schicht von Laserlicht, die orthogonal zur Erkennung Achse, bietet eine schnelle optische Schnitte mit hoher räumlicher Auflösung sowie Foto-Toxizität minimiert 5. Zugleich wird durch diese einzigartige optische Anordnung herkömmlichen Probenbefestigungstechniken unter Verwendung von Petrischalen oder Kulturkammern sind nicht geeignet. In einer typischen LichtBlatt Mikroskop drei translatorischen Motoren und Motordreh Halten der Probe, so dass sie präzise positioniert werden kann, gedreht und aus einer beliebigen Richtung betrachtet wird. In den letzten Proben für die Lichtmikroskopie Blatt oft in 2.1% Agarose in einer Glaskapillare 6,7 eingebettet. In diesem Fall wird die erstarrte Agarose Zylinder mit der eingebetteten Probe wird aus der Glaskapillare in die Probenkammer mit wasserartigen Mediums zur Bildgebung gefüllt extrudiert. Agarose hat einen Brechungsindex nahe Wasser und ist daher für die in vivo Mikroskopie Lichtblatt, die Wasser-korrigierten Belichtungs-und Detektionsoptik erleichtert geeignet. Die Probe wird in der starren Agarose beschränkt und kann auch für eine kurze Zeit abgebildet werden, aber morphogenetische Veränderungen und Wachstum des Embryos stark beeinträchtigt, wenn die Abbildung für mehrere Stunden 7,8. Obwohl Lösungen für andere Anwendungen entwickelt worden, 9, die nicht-invasive Langzeit Zeitraffer-Zebrafisch Bildpotential der Lichtmikroskopie Blatt kann mit dem herkömmlichen 1,5% Agarose-Einbettung nicht ausgenutzt werden.

Wir haben deshalb eine neue Strategie für die Montage in vivo Mikroskopie Lichtblatt der Zebrafisch-Embryonen 10. Die Probe wird in 0,1% Agarose mit 200 mg / L Tricaine in einem Rohr des optisch klare Polymer fluorierten Ethylen-Propylen-(FEP) montiert. Der eingebettete Embryo entwickelt normalerweise aufgrund der niedrigen Viskosität des Mediums. Zur gleichen Zeit, beschränkt die FEP-Röhre des Mediums und der Probe für die Dauer des Experiments. Hier bieten wir ein ausführliches Protokoll der neuen Montagetechnik und Darstellung von Daten reflektieren ihre Vorteile gegenüber dem herkömmlichen Protokoll. Wir zeigen, dass unsere Verfahren Zebrabärblingentwicklung kontinuierlich mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung über einen Zeitraum von mehr als zwei Tage abgebildet werden.

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Abbildung 1. Das Prinzip der Lichtbogen-Mikroskopie. Ein Zebrafisch in einem Rohr von fluorierten Ethylen-Propylen (FEP) vorgenommen montiert übersetzt werden kann und durch die Brennebene des Detektionsobjektiv gedreht. Eine dünne Schicht von Laserlicht (Lichtbogen) wird durch die Beleuchtung Ziel in die Fokusebene des Detektionsobjektiv projiziert und beleuchtet nur eine dünne optische Schnitt der Probe. Das emittierte Fluoreszenzsignal wird von der Detektionsobjektiv gesammelt und auf einem Kamera-Chip aufgezeichnet.

Protocol

1. Materialaufbereitung

  1. Herstellung von Rohren FEP
    1. Reinigen Sie die FEP-Schlauch (2A) durch Spülen Flüssigkeiten (in den folgenden Schritten angegeben) durch das Rohr und mit einer Spritze mit einem stumpfen Ende Kanüle (2B) befestigt Anmerkung 1:.. Benutzen Sie Handschuhe während des gesamten Verfahrens Anmerkung 2: Wir empfehlen Schneiden Sie den Schlauch in Stücken von ca. 1 m in der Länge und die Reinigung dieser parallel.
      1. Zuerst spülen Sie das Rohr mit 1 M NaOH wiederholt. Dann übertragen die Röhre in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 0,5 M NaOH gefüllt und ultrasonicate es für 10 min.
      2. Übertragen Sie die Polymerschlauch zu einem kleinen Becken mit ddH 2 O. Spülen Sie das Rohr zunächst mit ddH2O und dann mit 70% EtOH.
      3. Die FEP-Schlauch Anschließend Transfer in ein frisches Zentrifugenröhrchen mit 70% EtOH. Wieder ultrasonicate dieses Zentrifugenröhrchen für 10 min.
    2. Schneiden Sie den Schlauch gereinigt FEP in Stückevon ca. 3 cm (eine typische Länge für den Einsatz in Montage-und Zebrafisch-Bildgebung) und richten Sie sie gegebenenfalls. Bewahren Sie die Rohre gereinigt FEP in ein frisches 50 ml-Zentrifugenröhrchen mit ddH2O (2C) gefüllt.
  2. Vorbereitung der Tricaine Stammlösung
    1. Bereiten 0,4% Tricaine Stammlösung durch Lösen von 400 mg Tricaine (MS-222) in 97,9 ml ddH 2 O. Nachdem das Pulver vollständig gelöst hat, den pH auf 7,0 unter Verwendung von 2,1 ml 1 M Tris (pH 9,0). Schützen Sie die Lösung aus Licht. Speicher Aliquots bei -20 ° C.
  3. Herstellung von 3% Methylcellulose
    1. Vorbereitung 3% Methylcellulose-Lösung für die Innenbeschichtung der Rohre FEP, wie unten beschrieben. Heizen Sie E3 11 in einer Glasflasche auf ca. 60-70 ° C und fügen Sie die entsprechende Menge an Methylcellulose-Pulver. Fügen Sie einen Rührstab und rühren bei 4 ° C Sobald die Lösung auf unter 30 ° C abgekühlt, fügen Tricaine Lösung auf einen endgültigen concentration von 100 mg / L. Halten Sie das Rühren bei 4 ° C über Nacht.
  4. Zubereitung von 1,5% und 0,1% Agarose in E3
    1. Man löst die entsprechende Menge an niedrig schmelzender Agarose-Pulver in einem definierten Volumen von E3 in einem Glaskolben. Erhitzen Sie die Mischung in eine Mikrowelle und schütteln Sie sie einmal in eine Weile, bis die Agarose-Lösung homogen erscheint, ohne verbleibenden Kristalle.
    2. Bereiten 1 ml Aliquots von 0,1% igen Lösung in 1,5 ml Reaktionsgefäße. Die Aliquots bei 4 ° C gelagert werden
    3. Verwenden Sie die 1,5%-Lösung zur Beschichtung eines Kunststoff-Petrischale. Die Dicke der Schicht sollte ca. Agarose sein. 2 mm. Nachdem die Agarose verfestigt wird, hinzuzufügen E3 Medium auf der Oberseite der Schicht, um sie vor dem Austrocknen zu verhindern. Die beschichtete Schale kann bei 4 ° C gelagert werden
  5. Vorbereitung der Zebrafisch
    1. Halten Zebrafisch (Danio rerio) Erwachsene und Embryonen bei 28,5 ° C und mit ihnen umgehen nach den etablierten Protokollen 11,12.
    2. Richten Sie männliche und weibliche Fische am Nachmittag und trennen Sie diese durch einen Teiler. Am nächsten Morgen entfernen Sie die Trennlinie, um die Paarung der Fische Timeout.
    3. Sammeln Sie die Embryonen in einer Schale mit E3 gefüllt und untersuchen sie mit einem Stereomikroskop.
    4. Bei 24 hpf (oder der Entwicklungsphase Ihres Interesses), wählen Sie die Zebrafisch-Embryo für die Fluoreszenz-Ausdruck und übertragen die positive auf eine neue Schale mit frischen E3.
    5. Sorgfältig dechorionate die Embryonen mit zwei scharfen Pinzette (Abb. 2D und 2E). Verwenden Sie die erste Zange zu greifen und halten Sie die Chorion und die zweite Zange, um es aufzureißen und abziehen Anmerkung 1:. Führen Sie diesen Schritt mit Hilfe eines Stereomikroskops.

2. Multilayer-Montage

  1. Beschichten des FEP-Rohrs
    1. Bringen Sie ein stumpfes Ende eine Kanüle in eine Spritze. Legen Sie die Kanüle vorsichtig für etwa 3 mm in das eine Ende eines gereinigt und geschnitten Stück. FEP-Schlauch (2F und 2G) Hinweis 1: Handschuhe und vermeiden Sie jegliche Biegen oder Zusammendrücken des Rohres.
    2. Tauchen Sie das freie Ende des FEP-Schlauch in 3% Methylcellulose und füllen Sie den Schlauch mit der Lösung.
    3. Langsam den Methylcellulose, indem Sie auf der Spritze. Entsorgen Sie die Lösung.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.2 und 2.1.3 mit E3 Hinweis 1:. Die beschichteten Rohre für die Montage sofort verwendet werden müssen.
  2. Übertragen der Zebrafisch zu der Agarose
    1. Aufheizen eines Aliquots von 0,1% Agarose auf 70 ° C in einem Heizblock. Vortex das Reaktionsrohr kurz und übertragen sie auf eine auf 38 ° C (2H) gesetzt Wärmeblock.
    2. Nehmen Sie die Reaktionsröhrchen aus dem Wärmeblock und abkühlen lassen kurz. Hinzufügen Tricaine bis zu einer Endkonzentration von 133 bis 200 mg / L und Wirbel wieder (Fig. 2I).
    3. Wählen Sie eine der dechorionated Zebrafischembryonen und transfe. r sie in das Reaktionsrohr mit dem vorgewärmten 0,1% Agarose mit einem Glas-Pasteur-Pipette (Abb. 2J und 2K) Hinweis 1: Versuchen Sie, so wenig wie möglich zusätzliche E3 übertragen.
  3. Montage des Zebrafisch
    1. Nehmen Sie den Embryo mit der Spritze befestigt FEP-Schlauch (2L). . Das Rohr sollte vollständig mit 0,1% Agarose gefüllt werden, wobei der Embryo nahe an einem Ende der Röhre und mit dem Kopf in Richtung der Öffnung des Rohres Hinweis 1: Stellen Sie sicher, dass Sie vor der Aufnahme die Fische nehmen einige Agarose. Hinweis 2: Ziehen Sie ganz sanft auf die Spritze, um Blasen zu vermeiden Hinweis 3:. Halten Sie das Rohr in einer horizontalen Ausrichtung, um ein Auslaufen der Inhalte (Bilder 2M und 2N) zu vermeiden.
  4. Stecken Sie den Schlauch
    Figur 2
    2. Multilayer-Halterung für Zebrafisch-Embryonen. A) Fluorierte Ethylen-Propylen (FEP) Röhren auf einer Kabeltrommel vor der Zubereitung. B) Eine Spritze mit einem stumpfen Ende Kanüle befestigt. C) Ein gereinigt und geschnitten FEP-Schlauch. D, E) Dechorionation von 24 hpf Zebrafisch-Embryonen. F) die Röhre in das stumpfe Ende Kanüle. G) Die Spritze mit Kanüle und Schlauch befestigt. H) Eine Teilmenge von 0,1% Agarose in einem Reaktionsgefäß während der Übertragung auf einen Wärmeblock. I) Vortexen des geschmolzenen Agarose. J) Aufnahme eines dechorionated Embryos unter Verwendung einer Glaspipette. K) Übertragung des Embryos in die geschmolzene Agarose. L) Einlass des Embryos mit Umgebung Agarose in die FEP-Röhre. M, N) Der Zebrafisch-Embryos im Inneren des FEP-Rohrs . P) Stecken Sie den Schlauch durch die Verwendung eines Agarose-beschichteten Gericht. Q) Der Embryo innerhalb der gesteckten Röhre. R) Die endgültige Probenvorbereitung in einem Metallhalter. Klicken Sie hier, um größeres Bild zu betrachten.
    1. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um den Schlauch aus der Kanüle (Abbildung 2 O) geschnitten.
    2. Langsam kleben Sie das Ende des Rohres den Fisch durch die gesamte Schicht von 1,5% Agarose in der Kunststoffschale, um das Rohr (Abbildung 2P)-Stecker enthält Anmerkung 1:. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen und versuchen, einen geraden Stecker Oberfläche zu erhalten, indem die . Rohr exakt senkrecht zur Oberfläche Agarose Hinweis 2: Drehen Sie den Schlauch schwach, um einen schönen Stecker zu erhalten.
    3. Halten Sie die Probe montiert in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß mit E3, um das Trocknen zu vermeiden. Die Probe now bereit, abgebildet werden. Vor Bildgebung, zu überprüfen, ob der Fisch sitzt rechts oben auf dem Stecker (2Q Zahlen und 2R). Achten Sie darauf, auch Tricaine auf das Medium innerhalb des Abbildungskammer bei der gleichen Konzentration wie in der Montage Medium hinzufügen.

Representative Results

Multiday Imaging der Zebrafisch-Entwicklung Gefäßsystem

Wir verwenden ein dpf Tg (kdrl: GFP) 13 Zebrafisch, um die Vorteile der Mehrschicht-Montage-Strategie für langfristige Lichtblatt-Mikroskopie zeigen. Ziel ist es, die Bildentwicklung des Gefäßsystems im gesamten Zebrafisch über einen Zeitraum von 2 Tagen. Der Zebrafisch Embryo wurde in 0,1% igen Methylcellulose in einer beschichteten Polymerrohr montiert. Hier wird der Zebrafisch nicht von der Montagemedium beschränkt und kann normal entwickeln. Sein Kopf wirft, der Schwanz erstreckt und Gefäß Austrieb erscheint ungehindert (Abbildung 3).

Fig. 3
3. Multiday Bildgebung Zebrafisch Gefäßentwicklung. Das Gefäßsystem eines multilayer montiert 1 dpf Tg (kdrl: GFP) 13 Zebrafisch entwickelt ungehindert in einem Lichtblatt-Mikroskop im Laufe der zwei Tage. Ein 488-nm-Laserlichtschnitt der Fluoreszenz angeregt und das Signal wurde mit 10X/0.3 W objektive und eine EM-CCD-Kamera detektiert. Z-Stapel wurden auf vier benachbarten Positionen alle 10 Minuten erfasst und anschließend mit Fiji 15 genäht. Maximum Intensity Projections einer Teilmenge von Zeitpunkten dargestellt. Maßstab:. 500 um Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Imaging der frühen Embryogenese Zebrafisch

Hier zeigen wir die Fähigkeit von FEP Rohre als Halterung für die Lichtmikroskopie Blatt der frühen Zebrafischembryogenese während des ersten Tages nach der Befruchtung. Die 8 hpf Tg (H2A: GFP) 14 Zebrafischembryo mit seiner intakten Chorion innerhalb eines E3-gefüllte Röhre mit einem i montiertMänner Durchmesser von 1 mm. Dadurch ergibt sich eine leichte Klemmung der Chorion. Alle Entwicklungsprozesse während der Embryogenese sind unabhängig von der Montage und optimal visualisiert mit Hilfe von Licht-Mikroskopie Blatt werden. In diesem Beispiel wir die abzubildende Probe über einen Zeitraum von 12 h (Fig. 4). Typische Formänderungen während der frühen Embryogenese, wie die zunehmende Dehnung des Eigelbs und Verdickung des Gewebes entlang der Mittellinie, würde bei Verwendung der herkömmlichen Montage ohne Chorion in 1,5% igen unterdrückt werden.

Fig. 4
. Abbildung 4 Imaging der frühen Embryogenese Zebrafisch Ein Tg (H2A: GFP). Zebrafisch-14 durchläuft der frühen Embryogenese. Ein 488-nm-Laserlicht Blatt aufgeregt GFP und das Fluoreszenzsignal erkannt wurdemit einem 10X/0.3 W objektiven und einer EMCCD Kamera. Z-Stapel aus zwei Blickwinkeln wurden alle 3 min über einen Zeitraum von 12 Stunden erworben. Normalisierte maximale Intensität Projektionen einer Teilmenge der Zeitraffer gezeigt. Sichtbare Bewegungsunschärfe bei 19 hpf Ergebnisse aus dem Embryo Zucken während der Akquisition, da keine Betäubung verwendet. Maßstab:. 150 um Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Discussion

Erweiterte Mikroskopietechniken wie Lichtblatt Mikroskopie ermöglichen heute Bilddaten mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung im Laufe von mehreren Tagen aufnehmen, aber auch verlangen Probe Montagetechniken zu verbessern. Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll von Mehrschicht Halterung für Lichtmikroskopie Blatt der Zebrafisch-Entwicklung. Das Verfahren ist einfach zu implementieren und wir sie verwenden in unserem Labor auf einer täglichen Basis.

Die FEP-Schläuche

Schlüsselkomponenten unserer Strategie sind Röhren Montage der Polymer Fluorierte Ethylen-Propylen (FEP) vorgenommen. Wir entschieden uns, FEP vor allem wegen seiner Brechungsindex von 1.338, die ähnlich wie Wasser und daher ideal für die Lichtmikroskopie Blatt mit Wasser-Tauchziele und Probe erfordern wässrigen Medien geeignet ist, zu verwenden. Die Röhrchen mit 0,8 mm Innendurchmesser und 0,4 mm Wandstärke passen die Zebrafisch-Entwicklung sehr gut, kann mit typischen Probenhalter für 1,6 mm geeignet verwendet werdenKapillaren und sind unsere erste Wahl für die Montage vorgestellt Methode. Wir testeten sie gründlich in unserem selbstgebauten Setups sowie im Handelssystem "Lichtschicht Z.1" von Carl Zeiss Mikroskopie und festgestellt, dass FEP Rohre bieten langfristige Stabilität, haben nur minimale Auswirkungen auf die optische Leistung und sind nicht fluoreszierenden 10. Sie sind jedoch nicht für Anwendungen mit Proben, die einen unterschiedlichen Brechungsindex, z. B. gelöscht Probe erfordern.

Rohre und Folien aus FEP sind in einer Vielzahl von Durchmessern und Dicken erhältlich. Darüber hinaus können FEP bei 260 ° C aufgeschmolzen werden und bietet praktisch unbegrenzte Möglichkeiten für maßgeschneiderte Probe Halterungen so. Die Polymerrohre sind in der Regel nicht steril geliefert werden, weshalb das Reinigungsprotokoll umfasst mehrere Schritte, um beste optische Qualität sicherzustellen. Die Beschichtung mit Methylcellulose sichergestellt, daß kein Teil der wachsenden Zebrafischembryo klebt auf das Polymer.

Die Entscheidung für 0,1% Agarose basiert auf umfangreichen Tests der Wachstumsrate und Unbeweglichkeit in verschiedenen Konzentrationen von Agarose und Methylcellulose 10 basiert. Agarose-Konzentrationen über 0,1% zeigten bereits einen starken Einfluss auf die Wachstumsrate von 24 hpf Zebrafisch. Zusätzlich verwenden wir niedrige Dosen der betäubende Droge Tricaine. Tricaine Blöcke Aktionspotentiale, hemmt dadurch die Signalübertragung zwischen Gehirn und Muskeln und Muskelkontraktionen 16 unterdrückt. Eine Konzentration von 133 bis 200 mg / l gewährleistet eine ausreichende Immobilisierung von Zebrafisch zwischen 24-72 hpf. Allerdings Tricaine und andere Medikamente, die wir getestet Anästhesie zeigen dosisabhängige Nebenwirkungen wie Herz Ödeme. Zusätzlich wird die erforderliche Dosis von Tricaine variiert mit dem Entwicklungsstadium des Embryos. Wir empfehlen daher die Verringerung der Tricaine Konzentration auf die für die Entwicklungsstufen, die abgebildet werden, benötigten Menge. Um beste Performan gewährleistence und verhindern die Bildung von toxischen Nebenprodukten sollte frisch zubereitet oder aufgetaut Tricaine Stammlösung verwendet werden, vor Licht geschützt und nicht über 30 ° C erhitzt

Die Einbettung in FEP Rohre ermöglicht auch eine einfache Änderung der Montagemedium für die spezifischen Bedürfnisse zu berücksichtigen. Für Zeitraffer-Bildgebung des Herzens, empfehlen wir die Verwendung von 3% Methylcellulose und 100 mg / L Tricaine anstelle von 0,1% Agarose und 200 mg / L für die Montage. Methylcellulose ist viskoser als 0,1% Agarose wodurch höhere Immobilität auf eigene und weniger Tricaine muss verwendet werden, um eine Begrenzung des Embryos zu gewährleisten.

Tricaine empfindlich auf Temperaturen über 30 ° C und kann auch durch das Medium in der Belichtungskammer verdünnt werden, was zu einer verringerten Leistung und mögliche Zucken des Embryos. Stellen Sie daher sicher, dass Sie Tricaine auch in der Abbildungsmedium, in dem die Probe eingetaucht montiert zu verwenden. Wenn Ihre Experimente erfordern die Verwendung von höherenTemperaturen empfehlen wir den Austausch des Mediums in der Abbildungskammer entweder ständig unter Verwendung einer Perfusionssystem oder manuell mit einem Rohr und einer Spritze zwischen zwei Zeitpunkten.

Kritische Schritte

Die kritischen Schritte im Prozess der Montage sind die Probenaufnahme der Probe in das Rohr und das Einführen des Agarose-Stopfen. Die Einlass definiert die Anfangsposition des Embryos, die umständlich nachträglich ändern ist. Mehrere Proben sollten zu montieren sein und die Montagequalität sollte mit einem Stereomikroskop beobachtet werden. Wenn die Probe Orientierung nicht zufriedenstellend ist, die Änderung der Geschwindigkeit von der Erstellung der Probe und die Vermeidung von Folgebewegungen der Kolben kann helfen, wie dies oft verdreht den Embryo. Die 1,5%-Agarose-Stopfen erforderlich ist, um eine Leckage des 0,1%-igen Agarose vermeiden. Die Oberfläche des Stopfens im Inneren des Rohres sollte flach auf den Probenorientierung während der Entwicklung nicht zu beeinflussen. Um eine gute Surf erreichenace, unterschiedliche Dicken der Schichten Agarose müssen getestet werden und das Rohr muss in der Agarose normal zu der Oberfläche gebracht werden. Drehen der Röhre ein wenig und ziehen den Schlauch heraus sorgfältig frei den Stecker aus der Schüssel. Die Qualität der Befestigung sollte mit einem Stereomikroskop geprüft werden vor der Bilderzeugung.

Multiview-Bild

Ein großer Vorteil der Lichtbogen-Mikroskopie ist Multiview-Bildgebung, die Fähigkeit, um die Probe zu drehen, zu erwerben z-Stapel aus verschiedenen Blickwinkeln und in der Folge zu registrieren und verschmelzen sie. Eine etablierte Methode, um die z-Stacks im 3D-Raum zu registrieren ist Wulst-basierte Registrierung unter Verwendung von fluoreszierenden Kügelchen die Probe umgebenden als Treuhänder 17 Marker. Dieses Verfahren beruht jedoch auf einem festen Einbettungsmedium, wie 1,5% Agarose und scheint daher mit der mehrschichtige Montage hier vorge unvereinbar. Aber mehrere alternative Lösungen zu arbeiten, je nach Anwendung. Erstens kann die fluoreszierende Kügelchenin der Agarose-Stecker, der in das Sichtfeld während der Erfassung werden muss aufgenommen werden. Zweitens können die Tischpositionen vor den eigentlichen Versuche unter Verwendung eines 1,5% Agarose-Säule, die mit fluoreszierenden Kügelchen kalibriert werden. Drittens können alternative Marker, wie Fluoreszenz Kerne verwendet, um die Position der Z-Stapel relativ zueinander zu identifizieren.

Verdunstung

Typische Lichtschnittmikroskopie Setups einen offenen Probenkammer, die unvermeidlich führt zur Verdampfung des Mediums. Da das Medium ist essentiell für das Überleben der Probe, um die Verdampfung des Montagemedium zu beschränken und für die richtige Brechungsindex zwischen der Optik und der Probe, empfehlen wir unter einer oder mehreren der folgenden Maßnahmen, um Verdunstung zu verhindern. Erstens kann das Medium in der Kammer ständig ein Perfusionssystem ausgetauscht werden. Zweitens kann das Medium manuell nachgefüllt werden. Drittens kann die Kammer mit einem Deckel oder einer flexiblen Folie abgedeckt werden.

Das Polymer FEP wurde entwickelt, um eine große Vielzahl von Chemikalien zu widerstehen und ist daher robust, chemisch inert und undurchlässig für Gas. Im Fall von mehrschichtigen Montage Sauerstoff kann nur durch die Agarose-Stopfen und dem Agarose-Luft-Grenzfläche zu durchdringen, aber es bleibt zu zeigen, wenn die Sauerstoffzufuhr in mehrschichtigen Montage ist erheblich niedriger im Vergleich zu den Einbau in 1,5% Agarose-Polymer ohne Stützrohr. Da die Montage in 1,5% Agarose kann nur für etwa zwei Stunden verwendet werden, bevor der Zebrafisch Morphologie mehrschichtigen Montage betroffen sein scheint, die überlegene Gesamtlösung für die Langzeitabbildungs ​​sein.

Abbilden früheren Entwicklungsstufen

Multilayer-Montage ist nun unsere Standard-Einbettungstechnik für Zeitraffer-Mikroskopie von Lichtbogen Zebrafisch älter als 24 hpf zu werden. Außer, dass wir auch die Polymerrohren für die Bildgebung von früher Embryonen zu verwenden. Die Embryos bleiben in ihrer Chorion und in einer FEP-Röhre mit einem Innendurchmesser von 1 mm angeordnet und mit E3 gefüllt. Der Zebrafisch kann frei innerhalb des Chorion entwickelt und kann immer noch gut mit Hilfe von Licht-Mikroskopie Blatt abgebildet werden.

Ausblick

Die vorgestellte Mehrschichtprobe Montage entfesselt das volle Potential der Lichtblatt-Mikroskopie für Echtzeit-Entwicklungsbiologie mit Zebrafisch. Es kann leicht für andere Mikroskopietechniken wie optischen Projektionstomographie (OPT) und andere Organismen angenommen werden. Wir glauben, dass die Standard-Größe FEP Schläuche sind nur die ersten Schritte in Richtung Probe Montagetechniken für die spezifischen Bedürfnisse zugeschnitten sind.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Wir danken der Max-Planck-Gesellschaft, das Human Frontier Science Program (HFSP) und der Boehringer Ingelheim Fonds für die Finanzierung und Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes Bola S 1815-04 0.8/1.6 mm inner/outer diameter, other sizes available
Omnifix-F Solo 1 ml Syringe B. Braun Melsungen AG 9161406 V
Sterican Single-Use Cannula, blunt B. Braun Melsungen AG 9180109 0.8 mm x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube
50 ml Polypropylene Centrifuge Tube Corning 430829
1 M NaOH
0.5 M NaOH 
70% EtOH
Methylcellulose Sigma M0387 supplied as powder
E3 medium (for zebrafish embryos)
1.5 ml Reaction Tube Eppendorf 3810X
Agarose, low gelling temperature Sigma A9414 supplied as powder
Petri Dish Greiner 633180 plastic, 94 mm x 16 mm
Tricaine Sigma E10521 synonyms:  Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate 
10X/0.3 W Microscope Objective Lens Leica HCX APO L
EMCCD Camera Andor Technology iXon 885 EMCCD

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References

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