细胞表面和内蛋白质的现场培养神经细胞的抗体后喂养差异化标记

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Neuroscience

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Summary

我们描述了一种方法,以使用特定的多克隆抗体对表位的细胞外活神经元的表面上的标记蛋白。蛋白结合的抗体在细胞表面上,并随后通过胞吞作用内在化可以从蛋白质上残留进行区分,或在培养过程中贩卖到,该表面。

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Carrodus, N. L., Teng, K. S. L., Munro, K. M., Kennedy, M. J., Gunnersen, J. M. Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons. J. Vis. Exp. (84), e51139, doi:10.3791/51139 (2014).

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Abstract

为了证明在培养的神经元的推定的跨膜受体的细胞表面定位,我们标记的蛋白活神经元的表面上与针对该蛋白的细胞外部分中的特定一抗。鉴于受体被贩卖到和从该表面,如果细胞被透化固定后那么这两个细胞表面和内部蛋白质将用相同的标记的第二抗体来检测。在这里,我们适于用来研究蛋白质运输(“抗体馈送”)进行差分时的抗体温育步骤和蛋白质,要么留在细胞表面上或在此期间被贩卖到表面已被内化通过内吞作用标签蛋白的方法。区分蛋白质的这两个池的能力成为可能通过阻断过夜与步高浓度未标记的二抗的初始incubatio后注册成立Ñ​​unpermeabilized神经元用荧光标记的第二抗体。经过封闭步骤,通透允许检测的内在池与标有不同的荧光团的荧光二抗神经元。使用这种技术,我们能够获得关于这一推定受体的亚细胞定位的重要信息,揭示它,的确,贩卖到细胞表面的神经元。这种技术广泛适用于各种细胞类型和细胞表面蛋白,从而提供一个合适的抗体的细胞外表位是可用的。

Introduction

在建立新发现的蛋白质的功能,有问题的蛋白质的亚细胞定位和贩运的调查可以提供有关蛋白质1,2的可能作用/ s的重要线索。显影皮层3的转录组的生物信息学分析为我们提供了基因在小鼠脑corticogenesis表现出改变的表达的列表。然后我们通过基因敲除的方法,以证实这些基因之一,sez6编码的蛋白质,具有在神经元发育的关键作用。我们观察到癫痫相关基因6,或Sez6,蛋白质位于开发树突和也存在于树突棘,在接收和集成的兴奋性信号的树突特殊结构。此外,当这种蛋白质缺乏,树突和兴奋性突触不能形成正确4。该蛋白质的可能优势亚型具有transmembran的特征Ë受体虽然,当免疫标记蛋白的亚细胞分布进行了检查,共聚焦显微镜或免疫电镜大多数,如果不是全部,信号的出现与在体树突车厢很少,或者没有,蛋白质标记在质膜上的小囊泡在细胞表面。

为了明确地表明,该推定受体与预测的大胞外结构域被贩卖到质膜上,我们使用我们已经生成的蛋白的胞外部分,以在细胞表面标记蛋白的抗血清,通过了活细胞的方法。通过组合这种“抗体馈送”的方法与差异标记的第二抗体的两个应用程序通过一个广泛的阻挡工序和透化步骤分开,我们能够确定蛋白质的区分两种不同的池通过结合到荧光标记的二级抗体轴承不同fluoresc耳鼻喉科标签。因此,我们能够区分在从蛋白质的抗体温育步骤,要么留在细胞表面上或在此期间被贩卖到表面已被内化由细胞内吞作用的蛋白质。使用这种方法,我们建立了所感兴趣的蛋白被贩卖到和从细胞表面的神经元。因此,这种相对快速和简单的技术证明比传统的免疫细胞化学方法或预嵌入免疫电镜更多的信息,尽管我们使用了相同的兔多克隆抗血清对所有这些技术的事实。该技术一般适用于任何跨膜蛋白提供了良好的抗体识别的细胞外结构域的表位是可用的。该技术已被以前用于研究谷氨酸受体的GluR1亚基5的受体转运。

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Protocol

1。大鼠海马神经元培养

  1. 准备盖玻片(硼硅玻璃):
    1. 在100%乙醇洗涤。
    2. 在紫外光照射下空气干燥。
    3. 大衣与聚-D-赖氨酸(0.5毫克/毫升的0.15M硼酸盐缓冲液,4℃过夜°C)。
    4. 在第二天(培养的天)的PBS洗涤3次,然后涂以层粘连蛋白(2.5微克/毫升,天然小鼠层粘连蛋白)+ 5%体积/体积的热灭活的胎牛血清(FCS)的PBS稀释为2小时,在37°C。
  2. 解剖胚胎18天(E18)大鼠海马和收集到PBS含有钙和镁,在冰上冷却。注意:所有涉及动物实验方案已获墨尔本大学动物伦理委员会批准。
  3. 根据制造商的指示准备从木瓜蛋白酶解离试剂盒的木瓜蛋白酶和DNA酶I的解决方案。
    1. 加入50微升的DNase I溶液至1ml木瓜蛋白酶溶液。
    2. 注意:一旦首先制备的木瓜蛋白酶溶液和DNA酶I溶液可以分别分配到等分试样(0.5 ml和25微升等份为木瓜蛋白酶和DNA酶I,分别)并储存于-20℃直至需要。
  4. 去除尽可能多的PBS,尽量与在37℃下1毫升木瓜蛋白酶/ DNA酶I溶液15-20分钟孵育海马(来自胚胎的1升)。轻轻一抖管在孵化期的两倍,混合内容。
  5. 直至细胞分散,得到很少,如果有的话用火焰抛光的硅化的巴斯德移液管10-15X磨碎的海马组织轻轻地(避免气泡的产生),未解离的组织块仍然存在。
  6. 仔细层解离的细胞悬液在一个3毫升坐垫的4%w / v的牛血清白蛋白(BSA)的Hanks平衡盐溶液加添加剂(HBSS +,见第1.6.1节)。
    1. 由无搅拌溶解BSA在室温下准备这一步梯度液含有2mM的CaCl 2,1mM的MgSO 4干燥,4毫米的NaHCO 3和40mM的葡萄糖(HBSS +),然后无菌过滤并储存于4℃。环在HBSS
  7. 离心机,XG 100,在台式离心机具有水平转子7分钟。
  8. 去除上清小心不要吸细胞沉淀。
  9. 轻轻悬浮沉淀的细胞用火焰抛光(硅氧烷)巴斯德吸管(或1毫升蓝枪头)在1ml完整的Neurobasal培养基(含2%B27,0.5 2mM L-谷氨酰胺补充有1%FCS)中。
  10. 使用血球计数两个10微升等份(注:只计算相亮细胞作为“活的”细胞)。
  11. 板对预先制备镀膜玻璃盖玻片(0.75-1×10 5 /18毫米盖玻片在12孔板)初级神经元。紧接在电镀前,吸从盖玻片上多余的层粘连蛋白/血清溶液,并替换为初级神经元培养基(见下文)。注:所需要的n需要盖玻片的茶色被预先确定为盖玻片制备当天开始之前,培养物(参见步骤1.1)。
  12. 培养的大鼠原代E18海马神经元在体外 (DIV)的Neurobasal培养基,2%B27,0.5 2mM L-谷氨酰胺补充有1%FCS(热灭活的)长达21天。在7 DIV和此后每周进行半换液。抗有丝分裂氟脱氧尿苷/尿嘧啶核苷被添加在7 DIV; 1/1,000稀释的每个核苷10mM的股票),以防止神经胶质增生。

2。抗体孵育与Live神经元

  1. 在培养的第一周,神经元树突开发乔木和2-3周,神经元已经成熟到足以被接受突触6,7。
    1. 在选定的实验时间点/秒,适用于一抗一式三份含有盖玻片上小学胚胎神经元井。加抗体的等分试样直接加入的培养基在原代神经元为所需的最终稀释度注:在本例中,提出了针对该蛋白的重组分泌形式的兔多克隆抗血清,稀释1/500,加入2微升到1毫升培养培养基中公;一个离心10分钟,13,000 XG,RT可以合并之前,采取抗体等分,因为这会擦除任何颗粒物质,可以帮助降低背景。
    2. 对于免疫前血清对照,添加免疫前血清的等效量(以相同的最终稀释度)。如果没有免疫前血清是可用的,加Neurobasal培养基或PBS的等效体积(无一抗控制)。另外,如果合适的初级抗体可识别该蛋白质的胞内区/秒,该抗体可以被添加到一个控制以及为了测试表面染色的特异性。
    3. 返回到细胞培养孵化1-4小时(此潜伏期可以根据经验确定)。在我们的experimeNTS,所述抗体是存在的整个期间,虽然实验设计可以结合抗体的一个脉冲之后进行后洗出的另一潜伏期(一个脉冲追踪实验),以评估内化的时间进程。
      可选的步骤:此温育可以进行在室温下或什至在冰上如果有必要减缓基底蛋白内化的速率。如果在非CO 2的受控环境中进行的,该介质应改为一个不碳酸氢盐添加抗体/抗血清之前进行缓冲。注意:成熟的神经元培养(> 14天,特别是培养的小鼠胚胎神经元)不耐受全媒介的变化以及。
  2. 我们已经使用的孵育时间为1小时,2小时,并具有良好的效果4小时的这一次抗体内化步骤虽然最佳的时间将取决于大量的感兴趣的蛋白质,以及蛋白质运输中的CEL的动态根据研究LS。
    注:代表结果中显示的双彩色图像的细胞培养箱获得1小时的潜伏期在37℃。
  3. 温育所需的时间后,吸脱含有抗体的培​​养基。在室温下用PBS轻轻,但很快,一旦洗井。

3。二次抗体应用到固定,Unpermeabilized细胞

  1. 修复神经元在磷酸盐缓冲液pH 7.2 4%多聚甲醛,5分钟,在室温下注:为达到最佳效果,使用新鲜制备的固定剂;交替使用已经存储了在-20℃下和完全解冻修正,以便没有沉淀的多聚甲醛是显而易见。注意:多聚甲醛固定液应准备,并在通风橱中进行处理。
  2. 从井(转移到通风柜液体废物容器)拆下固定,冲洗3次,用PBS。
    1. 可选步骤:如果需要,以节省抗体试剂,盖玻片可以从12孔板用镊子小心地取出并放在单元侧时,上封口膜的片材布置的一次性培养皿的底部上。
    2. 解决方案可以被轻轻地吸移到盖玻片,使它们不解决水浸过的盖玻片的边缘上的封口膜完全覆盖。
    3. 此技术适用于短期孵育(1-2小时),但是更长的孵育( 例如过夜),应在湿润的腔室中进行。可替换地,盖玻片可以放回12孔板的过夜培养和足够体积的孔中应加入以确保盖玻片不干燥。
  3. 为30分钟,在室温下用在PBS中的5%BSA(:不添加洗涤剂在此阶段封闭溶液,因为它是重要的细胞不透注)块。
  4. 为了继续进行DETEC前表面标记蛋白内化蛋白化,应用第一个荧光标记2°抗体的选择。
    注意:在这里描述的例子中,初级抗血清对重组分泌的同种型4中提出兔(住宅内抗体)。因此,对于第一个二次抗体来检测的跨膜同种型的胞外区unpermeabilized神经元的表面上,我们用驴抗兔Dylight 649(在PBS中稀释含有5%BSA的1/200)。建议在离心机在使用前稀释的二级抗体溶液(10分钟,13,000×g离心,RT)。
  5. 孵育的盖玻片为2小时,在室温下进行。
  6. 洗盖玻片(井),2个5分钟,用PBS。

4。阻断与过量的未标记2°抗体

  1. 用未标记的2°抗体的高浓度(> 0.1毫克/毫升)阻断unpermeabilized神经元。
    1. 未标记的2°抗体应该对物种得到提升,其中初级抗体升高(在这种情况下兔)温育在室温下过夜。
    2. 此协议,AffiniPure F AB片段山羊抗兔IgG(H + L)中的用量为0.13毫克/毫升的浓度。
      注:过夜培养被认为是作为一个较短的潜伏期(2小时),关键是不够的初级抗体,该抗体未完全被标记的二次抗体结合的完全阻塞。
  2. 洗盖玻片(井),2个5分钟,用PBS。
  3. 在此之后封闭步骤,后固定细胞用磷酸盐缓冲液(pH7.2)中5分钟,在室温下4%多聚甲醛。去除固定液(固定液转移到通风柜液体废物容器)后,用PBS(2X)冲洗。

5。第二次将荧光共轭2°抗体的通透性及应用

  1. 通透并阻断细胞用含有0.1%的Triton-X-100在室温坦佩5%BSA的PBSrature 30分钟。
  2. 除去封闭液(注意不要让盖玻片干不出来)。添加第二个荧光标记的2°抗体标记有不同的荧光团。
    1. 注意:它必须有可能从先前所用的1区分这种荧光团标记,这取决于在共聚焦显微镜中使用的激发/发射过滤器(见下文)。
    2. 在这个协议提出的例子中,一个的Alexa Fluor 488 - 标记的驴抗兔2°抗体被用于(在PBS中的1/200,5%BSA和0.1%的Triton-X-100)。孵育2小时,在室温下再取出2°抗体溶液。
  3. 洗涤盖玻片3×5分钟,用PBS,最后用去离子水短暂洗涤。

6。安装和成像

  1. 贴装盖玻片载玻片上用含水安装含有中等抗淬灭( 例如 VECTASHIELD)并晾干。存放在暗处,在4℃下运timal保存荧光信号强度。
  2. 图片上的免疫染色共聚焦显微镜细胞。
    1. 合适的激发和发射滤波器,用于检测2荧光信号必须是可用的。
    2. 如果不同的实验条件进行比较(例如,内化去极化8,9或控制条件下的速率),确保所有复制从各种条件盖玻片成像相同的图像采集参数。感兴趣的标准区域或从得到的图像中的泪点的属性( 例如,数量,大小)的集成密度然后可以使用标准图像分析软件( 例如 ,斐济/ ImageJ的,的Metamorph)进行测定。

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Representative Results

这里提出的双色荧光免疫染色技术是在活细胞标记的跨膜蛋白的细胞外结构域可使用( 图1中示意性地示出)。在潜伏期,免疫球蛋白结合抗原表位访问和蛋白质分子的人口比例,与抗体结合在一起,被内吞。此外,新合成的蛋白质可通过向前贩卖到达细胞表面,并回收蛋白质分子可能返回至质膜10。

这种方法已被优化,两个不同的蛋白池,细胞表面的检测和内化,使用相同的第一抗体特异于蛋白质研究之中。通过施加一个荧光标记的二级抗体之前透化固定细胞,蛋白质在定影时定位于细胞表面,可检测到。雷神的结合ough封闭步骤,以禁止任何约束性,但没有约束的初始二次抗体剩余蛋白第一抗体复合物表面的允许随后的检测(与缀合到不同的荧光二抗)的孵育过程中被内吞的蛋白质 - 抗体复合物期( 图1)。

用这种方法得到的双色标记的代表性的图像示于图2。长的持续时间(过夜培养)的分块步骤有关的未标记的第二抗体,其目的是饱和的任何剩余的表面蛋白/初级抗体复合物结合的掺入,被证明是非常重要的这种方法的成功与否。在此封闭步骤之前与未标记的透化的第二抗体的效率被证明不存在双重染色的泪点的(除了标有箭头的小单元的它显示出垂死细胞的形态特征,出现大数和稠合; 图2)。的条件以及它们的组合的两个标记的第二抗体的优化可能是必要的和无第一抗体的条件是一个重要的控制。虽然工作了这个协议,我们发现,这是不可能完全阻止某些标记的二抗的非特异性结合,特别是与阻断时间超过此处所描述的孵育过夜短。

的内在蛋白质的单色标记培养的神经元( 图3)的例子突出蛋白质的特征点状染色模式在内涵体车厢10,11。为了证实该抗体喂养孵化过程中内化了的蛋白质和显示点状染色主要定位于核内体,神经元表达的早期/再循环内体标记(转铁的mCherry;转铁蛋白受体-MCH)12透后进行免疫染色。的点状的染色与TFR-MCH表达的广泛重叠,如图4所示。

图1
图1。示意图显示现场培养神经元的抗体喂奶后细胞表面的双色标签和内在蛋白点击这里查看大图

图2
图2。啦乱棍细胞表面蛋白(青色,EXT)和内化蛋白(绿色; INT),在体外培养的大鼠海马神经元与合并后的图像(MERGE)一起双重染色(箭头)只存在于一个细胞,这是显然不健康观察。比例尺= 10微米。 点击这里查看大图

图3
图3。单色(内在蛋白)的高功率视图免疫染色显示细胞内吞蛋白的典型点状图案。比例尺= 10微米。 点击这里查看大图


图4表示的荧光标记的循环核内体(对于转铁蛋白受体的mCherry融合蛋白,转铁蛋白受体-MCH的表达构建体,用阳离子脂质体2000 [Invitrogen公司]根据制造商的说明书转染的神经元的树突状乔木的一个区域)转染后的第二天,神经细胞被染色(透化后),可被内吞蛋白(候选受体),表示与核内体回收隔室重叠。比例尺= 20微米。 点击这里查看大图

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Discussion

这里所描述的技术是互补的细胞表面生物素化(由阿兰西维亚-CARCAMO 等人评论)12,它是所选择的用于保存关于内化蛋白的亚细胞定位信息的方法,提供一个合适的初级抗体,以一个胞表位是可用的。此外,蛋白质运输/内化的定量随着时间的推移可以执行(由整个活细胞温育与第一抗体固定盖玻片在不同时间),而不需要制备蛋白提取物。

染色强度或数量与泪点中的感兴趣区域的大小(例如,在离体细胞的一组距离锥体神经元的胞体或近端顶端树突的顶端区域)中的共焦图象,可以测量和比较在不同条件下(例如,刺激了对基础水平8,9)。内化受体SIGNAL强度然后可以归一化到该表面受体。可选地,该技术可以适用于受体再循环回到细胞表面通过包含一个汽提步骤,以从细胞表面除去剩余的抗体随后的温育,以允许内化以前,抗体结合的蛋白质,返回的定量表面13。

使用这种方法,我们能够确认,Sez6,感兴趣的推定的膜受体,达到并定位于细胞表面的神经元。因此,这种技术成功,其中比较常用的免疫荧光或免疫电子显微镜(预嵌入免疫)协议先前已经失败。尽管根据该蛋白的一级氨基酸序列的预测,其存在于细胞表面的确切的证据已经很难获得。我们检测到nonpermeabilized细胞表面上的蛋白质是如distinc容易看见吨泪点具有相似的特征,对于与体树突和轴突隔室存在细胞内。一种可能的解释这种表面点状染色是抗体的结合可能会刺激国际化,因此,使聚集的货物在新生的网格蛋白小窝14的检测。内化蛋白泪点的染色模式与早期/循环内涵体记者TFR-mCherry的重叠借给间接支持这一概念。此外,我们有证据(未发表),该蛋白的比例存在于脂筏也占了其表面上的成簇分布。

虽然我们已经集中了对神经元的注意力在当前协议中,我们观察到免疫反应性蛋白质的摄取(可能代表了蛋白质的分泌和/或裂解的版本)中的神经胶质细胞形态外形酷似星形胶质细胞的证据。这一发现是欢迎有兴趣的ST中,首先,因为它表明,该方法可以适用于的分泌的因子(例如,在共培养物),其次,在旁分泌效应的研究,因为它意味着,该方法将适用于其它类型的细胞。

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Disclosures

作者宣称,他们有没有竞争的财务权益。

Acknowledgments

作者感谢Teele Palumaa与数字的援助。从国家健康和医学研究委员会,澳大利亚资助计划资助1008046。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS with Ca and Mg Invitrogen 14040182
Neurobasal medium Invitrogen 21103-049
B27 supplement Invitrogen 17504-044
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation PDS
Bovine Serum Albumin  Sigma Aldrich Australia A9418
Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red Invitrogen (Gibco) 14175-079
Poly-D-Lysine Sigma Aldrich Australia P0899
Natural mouse laminin Invitrogen 23017-015 Thaw on ice prior to making aliquots
Fetal bovine serum HyClone Thermo Fisher
Fluorodeoxyuridine Sigma Aldrich Australia F0503
Uridine Sigma Aldrich Australia U3003
18 mm Round glass coverslips Menzel Gläser CB00180RA1
VECTASHIELD aqueous mounting medium Vector Laboratories H1400
Donkey anti-rabbit Dylight 649  Jackson ImmunoResearch Laboratories 711-495-152
AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L)  Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-007-003
Paraformaldehyde Sigma Aldrich Australia P6148 TOXIC - handle in fume hood
Triton-X-100 Sigma Aldrich Australia T8787
Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody Invitrogen - Molecular Probes A21206

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References

  1. Lewis, T. L. Jr, Mao, T., Arnold, D. B. A role for myosin VI in the localization of axonal proteins. PLoS Biol. 9, (2010).
  2. von Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
  3. Gunnersen, J. M., Augustine, C., Spirkoska, V., Kim, M., Brown, M., Tan, S. -S. Global analysis of gene expression patterns in developing mouse neocortex using serial analysis of gene expression. Mol. Cell. Neurosci. 19, 560-573 (2002).
  4. Gunnersen, J. M., Kim, M. H., et al. Sez-6 proteins affect dendritic arborization patterns and excitability of cortical pyramidal neurons. Neuron. 56, 621-639 (2007).
  5. Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. Syntaxin-4 Defines a Domain for Activity-Dependent Exocytosis in Dendritic Spines. Cell. 141, 524-535 (2010).
  6. Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures. Brain Res. 1359, 44-55 (2010).
  7. Grabrucker, A., Vaida, B., Bockmann, J., Boeckers, T. M. Synaptogenesis of hippocampal neurons in primary cell culture. Cell Tissue Res. 338-341 (2009).
  8. Vaillant, A. R., Zanassi, P., Walsh, G. S., Aumont, A., Alonso, A., Miller, F. D. Signaling mechanisms underlying reversible, activity-dependent dendrite formation. Neuron. 34, 985-998 (2002).
  9. Park, M., Penick, E. C., Edwards, J. G., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Recycling endosomes supply AMPA receptors for LTP. Science. 305, 1972-1975 (2004).
  10. Kennedy, M. J. &, Ehlers, M. D. Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 29, 325-362 (2006).
  11. Lasiecka, Z. M., Yap, C. C., Caplan, S., Winckler, B. Neuronal early endosomes require EHD1 for L1/NgCAM trafficking. J. Neurosci. 30, 16485-16497 (2010).
  12. Arancibia-Cárcamo, I. L., Fairfax, B. P., Moss, S. J., Kittler, J. T. Studying the localization, surface stability and endocytosis of neurotransmitter receptors by antibody labeling and biotinylation approaches. The Dynamic Synapse: Molecular Methods in Ionotropic Receptor Biology. Kittler, J. T., Moss, S. J. CRC Press. Boca Raton, FL. (2006).
  13. Petrini, E. M., Lu, J., Cognet, L., Lounis, B., Ehlers, M. D., Choquet, D. Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation). Neuron. 63, 92-105 (2009).
  14. Reider, A., Wendland, B. Endocytic adaptors – social networking at the plasma membrane. J. Cell Sci. 124, 1613-1622 (2011).

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