الرحم-البوقي نقل الأجنة وقطع القناة الدافقة في نموذج الفأر

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Summary

يستخدم-الرحم البوقي نقل الأجنة في الرحم الوصل الأنبوبي كحاجز لمنع تدفق الجنين التي قد تحدث عند تنفيذ نقل الرحم. ويلزم الذكور أجريت لهم هذه العمليات للحصول على المتلقين pseudopregnant لنقل الأجنة. وتناقش كل من التقنيات.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bermejo-Alvarez, P., Park, K. E., Telugu, B. P. Utero-tubal Embryo Transfer and Vasectomy in the Mouse Model. J. Vis. Exp. (84), e51214, doi:10.3791/51214 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

نقل الأجنة الإناث سابق للانغراس إلى بديل هو خطوة لازمة لإنتاج الفئران المعدلة وراثيا أو لدراسة الآثار المترتبة على تعديلات جينية نشأت أثناء التطور سابق للانغراس على التنمية وتعليم الكبار صحة الجنين اللاحقة. استخدام تقنية فعالة ومتسقة نقل الأجنة أمر بالغ الأهمية لتعزيز جيل من الحيوانات المعدلة وراثيا وتحديد تأثير العلاجات المختلفة على معدلات البقاء على قيد الحياة لغرس والمدى. وعادة ما يتم نقل الأجنة في مرحلة الكيسة عن طريق التحويل الرحم، وأداء ثقب في جدار الرحم لإدخال ماصة التلاعب الجنين. فتحة أجريت في الرحم لا يغلق بعد أن تم سحب ماصة، ويمكن للأجنة تدفق إلى تجويف البطن بسبب الضغط الايجابي من الرحم. ثقب يمكن أن تنتج أيضا من نزيف في أن يضعف زرع، وكتل ماصة نقل ويمكن أن تؤثر الجنين دالتطور، وخاصة عندما يتم نقل الأجنة دون زونا. بالتالي، هذا الأسلوب غالبا ما يؤدي إلى انخفاض معدلات بقاء الجنين متغير جدا والشاملة. تجنب هذه الآثار السلبية، البوقي-الرحم نقل الأجنة الاستفادة من مفرق-الرحم البوقي كحاجز طبيعي أن يعرقل تدفق الجنين وتجنب ثقب في جدار الرحم. ويلزم الذكور أجريت لهم هذه العمليات للحصول على المتلقين pseudopregnant. يوصف تقنية لإجراء عملية قطع قناة المني كتكملة لنقل الجنين داخل الرحم، الأنبوبي.

Introduction

نقل الأجنة وربما كان إجراء العمليات الجراحية الأكثر شيوعا التي تؤدى في نموذج الفأر. هذه التقنية أمر ضروري للحصول على ذرية من الأجنة في المختبر تعرض لتقنيات التلاعب، وبالتالي، يشكل خطوة ضرورية لتطوير نماذج المعدلة وراثيا عن طريق الحقن pronuclear، تنبيغ lentiviral، أو تشكيل الوهم. الى جانب ذلك، هذه التقنية تسمح دراسة الآثار التنموية من الشتائم المتنوعة التي تحدث أثناء تطور سابق للانغراس. استخدام تقنيات الاستنساخ الاصطناعي 1 أو التعرض لتركيزات غير طبيعية من المواد او نواتج 2 مختلفة قد تؤثر تطور الجنين مما يؤدي إلى زرع أو المشيمة الفشل والآثار على المدى الطويل في النسل. وهناك تقنية نقل الأجنة موثوق بها وقابلة للتكرار أمر حاسم لاختبار الآثار السلبية المحتملة لعلاج تجريبي على غرس ونمو الجنين في رجل متسقةنير.

يمكن نقل الأجنة سابق للانغراس الفئران الإناث إلى المتلقي إما إلى قناة البيض عن طريق الأمبولات من 0.5 أيام تال للجماع (DPC) المتلقين pseudopregnant (نقل قناة البيض) أو 3،4 في الرحم من 2.5 DPC pseudopregnant المتلقي (نقل الرحم) 5،6 اعتمادا على مرحلة نموهم. الأجنة في مرحلة الكيسة الأريمية، مثل تلك المستخدمة لتوليد الفئران خيالية عن طريق الحقن للخلايا الجنينية الجذعية المحفزة أو المستحثة، وعادة ما ينقل عن طريق التحويل الرحم. يمكن أيضا نقل مثانات بلاستولية إلى قناة البيض من 0.5 DPC المتلقي، لكنه يشكل اختبارا أقل الفسيولوجية لاختلال التنموية، وذلك لأن الجنين يخضع لفترة البيات ولها 2 أيام للتعافي من الإهانة قبل أن يتم زرع مكانها. نقل الرحم ينطوي على ثقب جدار الرحم بإبرة الضيقة من أجل توليد الفتحة التي تسمح للحصول على التلاعب ماصة الجنين في تجويف الرحم. Although هذه التقنية يمكن أن تحقق نتائج جيدة، والبقاء على قيد الحياة لمدة (أي النسبة المئوية للأجنة نقل أن تتطور إلى الجرو) غالبا ما تكون منخفضة وغير متوقعة 7،8.

ثقب في جدار الرحم يستتبع بعض الآثار الجانبية الضارة. الأولى، عضل الرحم هو نسيج أوعية دموية للغاية وثقب في كثير من الأحيان يؤدي إلى نزف صغيرة. الدم قد منع ماصة نقل الأجنة أو تغزو التجويف الرحمي يسبب الوفاة الجنينية و / أو فشل الزرع. وهذا هو ذات الصلة ولا سيما عندما يتم نقل الأجنة دون زونا، مثل خلايا الدم والحطام يمكن أن نعلق على عن Blastomeres. الثانية، وفتح يؤديها لا ختم بعد أن تم نقل الأجنة، بحيث يمكن أن تتدفق مرة أخرى من خلال فتحة ويطرد إلى تجويف البطن عندما يكون حجم كبير جدا وقد ندخل في الرحم. نقل-الرحم الجنين البوقي الموصوفة هنا الاستفادة من مفرق-الرحم الأنبوبي لتسليم EMBRيوس في الرحم من دون الحاجة إلى ثقب جدار الرحم وتجنب العواقب السلبية 9 بذلك.

ويتم الحصول على الإناث المتلقي pseudopregnant تستخدم لنقل الأجنة عن طريق التزاوج مع الذكور الطبيعية أجريت لهم هذه العمليات 8. يطلب من الإفرازات المنوية التي ينتجها الذكور العقيمة لالرحم لتصبح تقبلا لنقل الأجنة. للحصول على المستلم، يتم وضع حد أقصى قدره 2 الإناث من 8 أسابيع إلى 6 أشهر من العمر مع رجل أجريت لهم هذه العمليات في فترة ما بعد الظهر. في صباح اليوم التالي، ويتم التحقق من الإناث لوجود سد الجماع المهبلي، أجمة من البروتينات متخثر من السائل المنوي من الذكور. كما يحدث التزاوج عادة خلال منتصف الليل، ويعتبر اليوم من الكشف عن المكونات المهبلي ليكون 0.5 DPC. على الرغم من أن الذكور أجريت لهم هذه العمليات يمكن شراؤها من بعض البائعين، وإجراء العمليات الجراحية الموصوفة هنا من السهل نسبيا ولا تتطلب أي أدوات إضافية مما هو مطلوب لنقل الأجنة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل بلتسفيل المساحة رعاية الحيوان واستخدام Comittees (BAACUC 11-015) وفقا لوزارة الزراعة الأميركية رعاية الحيوان واستخدام المبادئ التوجيهية.

1. التخدير وتسكين (المشتركة لكلا العمليات الجراحية)

  1. تزن الماوس وتحميل التخدير والمسكنات التالية في اثنين 1 مل المحاقن مع الإبر 27 G:
    1. الكيتامين (0.1 ملغ / غ: 0.01 مل / غرام من حل 10 ملغ / مل) وزيلازين (0.01 ملغ / غ: 0.005 مل / غرام من حل 2 ملغ / مل).
    2. البوبرينورفين (0.1 ميكروغرام / غرام: 0.01 مل من محلول 0.01 ملغ / مل).
  2. لشل حركة الماوس عن طريق التقاط القفا من عنقه أقرب إلى فكي ممكن مع الإبهام والسبابة وعقد الذيل بين القليل وخاتم الأصابع.
  3. حقن الكيتامين زيلازين-خليط الغشاء البريتونى. من أجل تجنب ثقب الأعضاء الداخلية، مع الاستمرار على الماوس معرئيسها أقل قليلا من مستوى الوركين لها (الشكل 1A)
  4. حقن تحت الجلد البوبرينورفين في القفا من الرقبة عقد بين الإبهام والسبابة (الشكل 1B).
  5. ترك الماوس في القفص (نظيفة ودون أي حيوان آخر) على مسرح الحارة.
  6. مرة واحدة وعيه، والتحقق من عدم وجود منعكس القدم الخلفية (فحصها من قبل قرصة أخمص قدميه). تطبيق مرهم العين لتجنب جفاف العين وللتحقق من عدم وجود منعكس الجفن (الشكل 1C).
  7. يوفر هذا البروتوكول طائرة التخدير الجراحي مدة لا تقل عن 30 دقيقة، ما يكفي لتنفيذ الإجراءات الموضحة أدناه (البروتوكولات 2 و 3). إذا كانت هناك حاجة أوقات أطول، حقنة إضافية من الكيتامين زيلازين + مع نصف الجرعة الموصوفة في 1.1.1 يمكن تطبيقها بعد 30 دقيقة. إن التغيير في نمط التنفس لواحدة بشكل أسرع وعدم انتظام يدل على الصغرىق ق الطائرة التخدير المناسبة.

2. قطع القناة الدافقة

  1. استخدام الذكور مع أداء التزاوج التي أثبتت جدواها.
  2. تعقيم الأدوات الجراحية، وتنظيف الأسطح حيث سيتم إجراء الجراحة وتصفيتهم مع الايثانول 70٪.
  3. أداء التخدير كما هو مفصل سابقا (بروتوكول 1)، والتحقق من فقدان ردود الفعل.
  4. ضع الماوس على مسرح الحارة، وإزالة الفراء مع كليبرز الكهربائية من منطقة بطني بين خطين مستعرضة وهمية وضعت 0.5 سم و 2.5 سم فوق القضيب (الشكل 2A).
  5. تطهير منطقة حلق بواسطة المسح متتابعة مع 10٪ البوفيدون اليود والايثانول 70٪.
  6. ضع الماوس في موقف ضعيف مع ذيله نحو الجراح والغطاء بمنشفة العقيمة مع وجود ثقب تعريض منطقة حلق. إلقاء الضوء على منطقة العمليات الجراحية.
  7. إجراء 10-15 ملم طولية incisio الجلدن في خط وسطي من البطن، وحوالي 1 سم فوق القضيب. عقد الجلد مع ملقط مسنن خلع الملابس ثم قطع مع مقص (أرقام 2A و 2B).
  8. إجراء 5-10 ملم شق طولي في ألبا الخط. عقد العضلات مع ملقط مسنن microdissecting وقطع مع مقص (الشكل 2C).
  9. انتزاع لوحة الدهنية الخصية من جانب واحد مع الدقيقة تشريح ملقط مسنن وتسحبه لفضح الخصية، البربخ والأسهر. يقع الأسهر الإنسي إلى الخصية وذلك عبارة عن أنبوب الحرة تمييزها بوضوح (لا تعلق على جدار الخصية مثل البربخ) مع الأوعية الدموية ممتدة على طول جانب واحد (الشكل 2D).
  10. عقد الأسهر مع ملقط مسنن تشريح الصغرى، ملقط خلع الملابس اللهب حتى إلى اللون الأحمر (الشكل 2E ويكوي الأسهر في نقطتين في آن واحد (الشكل 2F). خفض يجب إزالة جزء من حوالي 5 ملم وترك اثنين يفصل بوضوح الغايات أكتوي (الشكل 2G).
  11. نقل الخصية، البربخ والأسهر يعود إلى تجويف البطن.
  12. ننطلق من الخطوة رقم 9 في الخصية الأخرى.
  13. خياطة العضلات مع واحد أو اثنين من غرز فراش الأفقية المصنوعة من 5/0 خياطة للامتصاص (الشكل 2H).
  14. خياطة الجلد مع واحد أو اثنين كليبرز الجرح (الشكل 2I).
  15. تحديد الذكور vasectomised (حلقة الأذن، الوشم إصبع ...)، نقله القفص وضعها على المسرح دافئة ومراقبة حتى يتعافى من التخدير (واعية والحفاظ على الاستلقاء القصية). A 0.5-1 الحقن تحت الجلد مل من محلول ملحي دافئ يحسن إعادةcovery. تسجيل حوادث ممكن تحدث أثناء نقل قطع القناة الدافقة، إضافة المضادات الحيوية إلى مياه الشرب.
  16. مقاطع الجرح يمكن إزالتها بعد 10 يوما قطع القناة الدافقة مع مزيل الجرح مجز أو زوج من ملقط الأسنان. فإن الذكور أجريت لهم هذه العمليات تكون جاهزة للتزاوج 2 أسابيع بعد الجراحة.
  17. اختبار العقم من الذكور أجريت لهم هذه العمليات عن طريق التزاوج مع الإناث الخصبة قبل استخدامه للحصول على المتلقين.

3. الرحم-البوقي نقل الأجنة

  1. الماوس morulae أو مثانات بلاستولية يمكن نقلها بواسطة هذه التقنية إلى المتلقي pseudopregnant الإناث عند 2.5 DPC.
  2. إعداد الجنين الزجاج التلاعب ماصة:
    1. تلميع نصائح من الشعيرات الدموية الزجاج من أجل تجنب إتلاف حامل ماصة.
    2. تخفيف جزء منتصف الزجاج الشعرية عن طريق تسخين بلهب غرامة في حين تناوب قليلاالشعرية بكلتا يديه بشكل متزامن. مرة واحدة يصبح المقطع الشعري لينة وطيعة (لون الضوء الأحمر)، سحبها بسرعة من اللهب وسحب طرفي لتضييق قطرها الخارجي إلى 130-150 ميكرون.
    3. انتظر الزجاج ليبرد ثم قطع عليه بتسجيله طفيفة الجزء الضيق مع قلم رصاص الماس نقطة، حجر جلخ أو ملف الأظافر وسحب من كلا الجانبين. يجب أن تكون نظيفة وكسر عمودي
  3. تلميع غيض من قبل المشتعلة بسرعة كبيرة، وترك فتحة 100-130 ميكرون. ويمكن تخزين الماصات لاستخدامها لاحقا.
  4. دافئ وسائل الاعلام التلاعب الجنين (CZBH أو M2، انظر المناقشة).
  5. تعقيم الأدوات الجراحية، وتنظيف الأسطح حيث سيتم إجراء الجراحة وتصفيتهم مع الايثانول 70٪.
  6. أداء التخدير كما هو مفصل سابقا (بروتوكول 1)، والتحقق من فقدان ردود الفعل.
  7. حفظ رانه الماوس على مسرح الحارة، وإزالة الفراء مع كليبرز الكهربائية من المنطقة الظهرية بين الركبتين والأضلاع البعيدة (أرقام 3A 3B و).
  8. تطهير منطقة حلق بواسطة المسح متتابعة مع 10٪ البوفيدون اليود والايثانول 70٪.
  9. نقل الأجنة من الحاضنة إلى prewarmed وسائل الاعلام التلاعب الجنين.
  10. نقل المتلقي إلى مرحلة دافئة تحت stereomicroscope ووضعه في موقف المعرضة أفقيا للجراح (مع رئيسها تتطلع إلى الجانب الأيمن أو الأيسر من جراح).
  11. تغطية المنطقة بمنشفة العقيمة مع وجود ثقب تعريض منطقة حلق وإلقاء الضوء على منطقة العمليات الجراحية.
  12. إجراء 1 سم مستعرضة (العمودي) شق في الجلد في بقعة تقع على الجمجمة ⅓ من الخط الفاصل بين الضلع الماضي والوركين و⅓ الظهرية من الخط الفاصل بين الظهر والبطن (أرقام 3A لالثانية 3B). عقد الجلد مع ملقط مسنن خلع الملابس وقطع مع مقص (الشكل 3C).
  13. مرة واحدة وقد تم قطع الجلد، والمبيض (أحمر / برتقالي) أو لوحة الدهنية المحيطة المبيض (أبيض) يمكن تصور من خلال جدار الجسم. إجراء 0.3-0.5 سم مستعرضة (العمودي) شق في جدار الجسم على المبيض أو وسادة الدهنية في مكان حيث لا يقطع شق أي الأوعية الدموية الكبيرة. عقد العضلات مع ملقط تشريح الصغرى مسننة وقطع مع مقص (الشكل 3D).
  14. تحريك الماوس ليكون رئيسها يواجه نحو الجراح.
  15. تحميل التلاعب ماصة الجنين (الشكل 3E):
    1. السماح لوسائل الإعلام CZBH ليصعد بواسطة الشعرية من خلال الجزء الضيق من ماصة التلاعب حتى حوالي 5 ملم من الجزء الأوسع.
    2. يستغرق فقاعة الهواء الصغيرة (0.2-0.5 ملم).
    3. يعرض الأجنة (5-10) فيالحد الأدنى من وسائل الإعلام (2-4 ملم).
    4. تناول فقاعة أخرى صغيرة الهواء (0.2-0.5 ملم) وكمية صغيرة من وسائل الاعلام (0.5-1 مم).
    5. ترك ماصة الزجاج التي تعلق على حامل الشافطة أو الفم إلى الجهاز اليد التي تديرها، وعلى استعداد لخطوة 3.17.
  16. انتزاع لوحة الدهنية المحيطة المبيض مع ملقط تشريح الصغرى مسننة وتسحبه نحو الرأس الماوس لفضح المبيض، قناة البيض، وجزء صغير من الرحم العلوي من تجويف البطن (أرقام 3F و3G).
  17. عقد قطعة الشافطة الفم في الفم، وعلى استعداد لاستخدامها، والاستيلاء على وسادة الدهنية مع ملقط تشريح الصغرى مسننة لنقل قناة البيض وفضح مفترق-الرحم البوقي (أي حيث يلتقي قناة البيض الرحم).
  18. الحفاظ على مفترق-الرحم البوقي يمكن الوصول إليها، واتخاذ طفيف منحني ملقط تشريح الصغرى مع يدك اليسرى (إذا كان الحق وسلم) ووضعها تحت فقطملتقى-الرحم البوقي الاستيلاء على قناة البيض حوالي 2 مم فوق ذلك الجزء.
  19. عقد ملتقى-الرحم الأنبوبي مع ملقط تشريح طفيف المنحنية الدقيقة، ثقب الباب قناة البيض على مقربة من ملقط مع 27 G إبرة (الشكل 3H).
  20. إدراج الجنين التلاعب ماصة في فوهة يؤديها مع الإبرة والتقدم إلى الرحم من خلال تقاطع-الرحم الأنبوبي (أرقام 3I و3J). مرة واحدة وقد مرت ماصة للالبوقي تقاطع الرحم (الشكل 3K) أنه ينزلق بسهولة. لا تقدم بعيدا جدا في الرحم لمنع الضرر بطانة الرحم (لا يزيد عن 3 ملم) وماصة حجب من قبل الحطام.
  21. الافراج عن الأجنة إلى الرحم عن طريق النفخ بلطف (الشكل 3L). يجب على كل من فقاعات الهواء تمر عبر الرحم. بعض وسائل الإعلام أعلاه فقاعة الأولىويمكن أيضا أن تطلق في الرحم، ولكن تجنب إدخال المزيد من الهواء، لأنها قد تعيق التوطين.
  22. إزالة ماصة فقط بعد أن تم الإفراج الأجنة في الرحم.
  23. نقل قناة البيض والمبيض إلى تجويف البطن عن طريق الاستيلاء على لوحة الدهنية.
  24. خياطة العضلات مع مرتبة غرزة أفقية مع 5/0 خياطة للامتصاص (الشكل 3M).
  25. خياطة الجلد مع المقص الجرح (الشكل 3N).
  26. ننطلق من الخطوة 10 على الجانب الآخر إذا لزم الأمر.
  27. تحديد المستلم (حلقة الأذن، الوشم إصبع ...)، نقله إلى قفصه (وضعت على المرحلة الدافئة) ومراقبة حتى يتعافى من التخدير (واعية والحفاظ على الاستلقاء القصية).
  28. علق حوادث ممكن تحدث أثناء نقل الأجنة وإضافة المضادات الحيوية إلى مياه الشرب. A 0.5-1 مل من الحقن تحت الجلد سالي الحارةالحل شمال شرق يحسن الانتعاش.
  29. مقاطع الجرح يمكن إزالتها بعد 10 يوما نقل الأجنة مع مزيل الجرح مجز أو اثنين من أزواج من ملقط (الشكل 3O). يمكن أن يكون وزنه المتلقي في ذلك اليوم لتقييم الحمل وتقدير عدد الجراء. توفير المواد عشش إلى المتلقي بعد 15 يوما نقل الأجنة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يوفر-الرحم البوقي نقل الأجنة وسيلة لنقل الأجنة إلى الرحم تجنب بعض المضاعفات المرتبطة إلى الرحم نقل الأجنة 2،9،10. في الجدول 1 نظهر بعض النتائج التي حصلنا عليها ممثل نقل مثانات بلاستولية CD1 يتعرضون لأنواع مختلفة من التلاعب إلى المستلمين CD1 بعد بروتوكول صفها. بقاء لمدة (٪ من الأجنة الناتجة في الجرو) أو البقاء على قيد الحياة إلى E15 (في حالة الفيروسة البطيئة التعرض) مشابه بين الأجنة مجرد مثقف في المختبر من مرحلة البيضة الملقحة (IVC)، الأجنة يتعرضون للحقن التوجيهية لتوليد الجراء خيالية والأجنة التي كان زونا على إزالتها وتعرضوا لالفيروسة البطيئة لمدة 7 ساعة قبل نقل الأجنة. وبالتالي، الرحم، البوقي نقل الأجنة هي تقنية يمكن الاعتماد عليها لنقل الأجنة معقدة بصفة خاصة، مثل تلك التي تفتقر الشفافة زونا وحضنت مع الفيروسة البطيئة.

together.within صفحة = "دائما"> الشكل 1
الشكل 1. حقن التخدير والمسكنات. A) حقن داخل الصفاق من الكيتامين-زيلازين. B) الحقن تحت الجلد من البوبرينورفين. C) تطبيق مرهم العين.

الرقم 2
الشكل 2. يتم وضع بروتوكول قطع القناة الدافقة A) والنقطة شق (يصور مع "X" حمراء) حوالي 1 سم فوق القضيب؛ إزالة الفراء 0،5-2،5 سم فوق القضيب (الخطوط السوداء) شق B) شق الجلد C) العضلات.. القناة الناقلة D) فاس (السهم الأسود) واختبارو(*). E) المشتعلة من ملقط لالكي. F) الكي من الأسهر في نقطتين في آن واحد. القناة الناقلة G) فاس فصل بوضوح إلى طرفي أكتوي. H) خياطة العضلات الأول) خياطة الجلد. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 3
الرقم 3. الرحم-البوقي بروتوكول نقل الأجنة A، B) وعرض الظهرية الجانبية للنقطة شق (يصور مع "X" حمراء)؛ خطوط سوداء بين الضلع الماضي والوركين (A، B) وبين الظهر والبطن (B) بمثابة دليل. C) شق الجلد. E) ماصة الزجاج التلاعب الأجنة محملة 5 مثانات بلاستولية جاهزة للنقل. F، G) المبيضين الممثل مع (F) أو بدون (G) الأجسام الصفراء، وأشار مع السهام السوداء. هونج كونج) لأغراض التمثيل ، تم إجراء محاكاة ل-الرحم البوقي نقل الأجنة تحميل ماصة الزجاج التلاعب مع 0.4٪ التريبان الأزرق الحل. H) البزل من قناة البيض (السهم الأسود) على مقربة من الرحم (*). I) مقدمة من ماصة التلاعب في الجنين فتحة تؤديها سابقا. J) السلف ماصة التلاعب الجنين عن طريق الرحم البوقي تقاطع. K) تم طرد A حجم التريبان الأزرق حل يعادل التي تم إصدارها في نقل الأجنة في تجويف الرحم (السهم الأسود). L) ل اختبار كفاءة إغلاق تنتجها تقاطع-الرحم الأنبوبي، جميعوأطلق سراح محتوى ماصة التلاعب في الرحم؛-الرحم البوقي تقاطع (السهم) يعوق تدفق الخلفي من حل التريبان الأزرق تطلق في الرحم (*) إزالة M) خياطة العضلات N) خياطة الجلد O) كليب.. P) 15 يوما بعد نقل الأجنة توفير المواد عشش إلى المستلم. س) القمامة همي الحصول التالية هذه التقنية. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

علاج عدد التحويلات نقل الأجنة الجراء تسليمها البقاء على قيد الحياة لرإدارة مخاطر المؤسسات (٪)
IVC 11 110 82 74.5
حقن التوجيهية 3 50 35 70.0
الفيروسة البطيئة 6 60 44 73.3

الجدول 1. النتائج التي تم الحصول عليها بعد نقل ممثل ثلاث مجموعات مختلفة من الأجنة التلاعب التالية-الرحم البوقي نقل الأجنة. 1) أجنة مثقف في المختبر (IVC) من مرحلة البيضة الملقحة إلى مرحلة الكيسة الأريمية، 2) في الجسم الحي ينتج مثانات بلاستولية حقنوا 10 مذكرات التفاهمالبريد التوجيهية لتوليد الفئران خيالية، 3) في الجسم الحي ينتج مثانات بلاستولية التي كان زونا على إزالتها وحضنت لمدة 7 ساعة مع الفيروسة البطيئة معربا عن GFP. تمثيل البيانات في عدد من الجراء ولدت من عدد الأجنة المنقولة باستثناء مجموعة الفيروسة البطيئة المكشوفة، حيث يمثل عدد الأجنة قابلة للحياة بعد 10 يوما نقل الأجنة، والحمل وعدم السماح لمزيد من التقدم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

قطع القناة الدافقة هو تقنية جراحية على التوالي إلى الأمام نسبيا التي لا تنطوي على صعوبات كبيرة. عندما التعقيم مع فيوسيدين والإيثانول تأكد من غسل الماضي (مع الإيثانول) يزيل البوفيدون اليود، لأنها قد تهيج الغشاء البريتوني. ويمكن أيضا الوصول إلى الأسهر أن يتحقق عن طريق كيس الصفن أو إجراء شق عرضي في البطن 8. وقد أوصى شق الصفن لمستعرضة شق البطن بسبب شق أصغر نسبيا اللازمة وأفضل قليلا السلوك بعد العملية الجراحية 11. ومع ذلك، ونحن نفضل شق البطن على الصفن لأنه يوفر وصول أسهل وأكثر وضوحا في الأوعية الناقلة للمني من كلا الخصيتين، ومنع الجراحين المبتدئين من كيها مرتين نفس الأسهر وترك وعاء وظيفية القناة الناقلة. بين كل من التقنيات في البطن، ونحن نؤيد شق طولي في ألبا الخط على transverسال لأنه لا قطع أي الألياف العضلية في البطن، وتجنب تطور الفتق في البطن. ومع ذلك، على حد سواء قطع القناة الدافقة وبروتوكولات نقل الأجنة داخل الرحم، البوقي يمكن تكييفها لالمعدات المتاحة أو لأمثال الشخصية للباحث. على سبيل المثال، وهو معقم الزجاج حبة يمكن استخدامها لتسخين ملقط يستخدم ليكوي الأسهر. في أي حال، لا بد من اتباع الأسلوب العقيم، لتوفير التخدير وتسكين المناسبة من أجل تحقيق أقصى قدر من الرفق بالحيوان، والامتثال للوائح المحلية.

جانب آخر عرضة للتعديلات هو البروتوكول التخدير. إذا التخدير الاستنشاق (isoflurane و) هو متاح، ونحن نشجع على استخدامه بدلا من الحقن (حقن) التخدير، كما أنه يوفر الطائرة التخدير مستقرة جدا والانتعاش السريع. ومع ذلك، فمن المهم أن أذكر أن التخدير الاستنشاق لا يزال يتطلب استخدام مسكن للآلام داخل وما بعد الجراحة، والتي ينبغي أن تكون الهيئة الإداريةstered قبل الجراحة كما تخدير. البوبرينورفين الأفيونية هي التي توفر للوعي في المدى الطويل الماوس 12. يوفر التخدير بالحقن أيضا طائرة مخدر جيدة لإجراءات قصيرة مثل قطع القناة الدافقة ونقل الأجنة. الكيتامين-زيلازين هو مزيج موثوق بها للغاية لعملية جراحية الماوس 13 و لاحظنا أبدا أي مضاعفات التخدير باستخدام هذا المزيج بالتزامن مع تخدير مع البوبرينورفين. تركيبات بالحقن أخرى يمكن استخدام 12، ولكن نحن لا نشجع استخدام خليط المخدرة AVERTIN (ثلاثي بروم إيثانول)، كجرعة واحدة فقط يمكن إدارة وأفادت مقالات متعددة مضاعفات المتنوعة المرتبطة باستخدامه مثل تهيج موضعي، وضعف وعي، العلوص ، التصاقات ليفية في تجويف البطن، ونخر من الألياف العضلية تحت الصفاق وأعضاء البطن السطحية، وحتى وفيات 14-18.

يتطلب نقل الأجنة الإدارة الجيدة لكلا الأجنة ود المتلقي. كقاعدة عامة لنقل الأجنة في الثدييات، والمرحلة التنموية من الأجنة يمكن أن يكون أكثر تقدما من مرحلة حمل كاذب للمتلقي، ولكن ليس العكس. وبعبارة أخرى، يمكن للأجنة الانتظار للأم، ولكن الأم لا يمكن أن تنتظر للأجنة، لذلك هذه التقنية يمكن استخدامها لنقل morulae أو مثانات بلاستولية، ولكن ليس في وقت سابق المراحل. -الرحم البوقي نقل الأجنة يمكن أن يؤديها بعد يومين من الكشف عن المكونات المهبلية من الظهر (2.5 DPC) إلى مساء ليلة (3 DPC)، عندما تقاطع-الرحم البوقي مفتوحة للسماح بمرور الطبيعي للأجنة من قناة البيض لقرون الرحم. معتبرا ان نقل الأجنة قد عانوا من نوع من التلاعب، ويجب التعامل مع الجنين تقليل أي مزيد من الضرر. دليلا ممتازا للماوس التلاعب الجنين يمكن العثور عليها في ناجي وآخرون. 8 الفأر الأكثر استخداما وسائل الاعلام التلاعب الجنين اللتين عقد درجة الحموضة الفسيولوجية في العادية فيmosphere، هي CZBH 19 و 20 M2. على الرغم من أن في الجسم الحي ينتج أجنة الفئران يمكن التغلب على التعرض لدرجات الحرارة الباردة أو الرقم الهيدروجيني غير طبيعية لفترات طويلة 21، ينبغي prewarmed وسائل الاعلام التلاعب. إذا تم prewarmed وسائل الإعلام في صحن الثقافة، وتجنب ارتفاع درجة حرارة لفترات طويلة (أكثر من 40 دقيقة)، كما الأسمولية من وسائل الإعلام ستزيد بسبب تبخر المياه والتي يمكن أن تكون أكثر ضررا من وسائل الاعلام التلاعب الباردة. وبالمثل، في الوقت الذي تنفق الأجنة داخل ماصة التلاعب يجب أن يكون الحد الأدنى نظرا لحجم صغير موجودة في ماصة.

استخدام السليم ماصة التلاعب الجنين هو أمر حاسم لنجاح البروتوكول. ماصات التلاعب يمكن أن تكون مصنوعة من الزجاج الشعيرات الدموية مع جدار زجاجي رقيق. ويمكن أيضا ماصات باستور، وغالبا ما تستخدم لمعالجة الأجنة الحيوانية الكبيرة، واستخدامها، ولكن نظرا لابتعاده أقصر من المقبض إلى الحافة، ماصات التلاعب مصنوعة من الزجاج الشعيرات الدموية هي أكثر COMFortable للمناورة. التعرض للهب وسرعة سحب تحديد سمك الجدار والقطر الداخلي للماصة. على الرغم من الماصات يمكن التلاعب به بسهولة باليد بعد بعض الممارسة، ساحبة والصغرى فورج يمكن أن تستخدم أيضا. فمن المهم لاستثمار الوقت في إنتاج العديد من الماصات التلاعب الأمثل. يجب أن تكون الفتحة ماصة التلاعب أوسع من جنين للسماح التدفق السلس، ولكن صغيرة بما يكفي لاختراق بسهولة والتقدم من خلال تقاطع-الرحم الأنبوبي. إذا تمت إزالة المنطقة الشفافة قبل نقل، مثانات بلاستولية عادة إلى توسيع قطرها أكبر. في هذه الحالة، فإنه من المستحسن لجعل ماصات أوسع مع فتحة أوسع (130-180 ميكرون) لتجنب أي ضرر للخلايا الأديم الظاهر الغاذي. البولندية غيض من المهم لتجنب إتلاف قناة البيض، جدار الرحم والجنين - وخاصة إذا تمت إزالة زونا، وتجنب غيض ماصة من يتم حظره من قبل الحطام. ومع ذلك، بعد تلميع، ينبغي الفتحة نبعد التمديد تكون صغيرة جدا مقارنة مع القطر الداخلي للماصة، وانخفاض حاد في قطر سوف تسبب تغيرات مفاجئة في سرعة التدفق. يوفر المعبرة الشافطة عنصر تحكم تدفق أكثر دقة، فضلا عن موقف أكثر راحة اليد مقابل الأجهزة التي تسيطر عليها اليد. ومع ذلك، يمكن استخدام جهاز التحكم ناحية إذا لزم الأمر (على سبيل المثال عند التعامل مع الأجنة المعالجة الفيروسة البطيئة). لتدفق الأمثل وتجنب نقل الزيوت المعدنية، كما أنه من المستحسن استخدام ماصة جديدة لنقل الجنين بدلا من أن تستخدم لنقل الأجنة من وسائل الإعلام والثقافة الى وسائل الاعلام التلاعب. أخيرا، في حين أن إدخال ماصة من خلال قناة البيض، وينبغي التعامل مع الشعرية مباشرة، مثال. الاستيلاء على الزجاج وليس من البلاستيك مقبض من الشافطة، للحصول على احكام قبضتهم. التكبير تستخدم لنقل الأجنة هي مسألة الشخصية التي تعتمد على البصر من الجراح. ونحن نفضل استخدام التكبير المنخفض لديك حقل بصرية واسعة،لذلك نحن نستخدم 10X التكبير النهائي (10X بصري والهدف 1X).

وينبغي أن يكون المستلمين لا يقل عن 8 أسابيع من العمر وتزن ما بين 27-40 غرام. Outbreed الفئران مثل CD1 أو بستر السويسرية عرض سلوك الأمهات جيدة ويتلقون ممتازة. فإنه من المستحسن لاقامة التربية للحصول على المتلقين اضافية، وتلك التي لا تستخدم سيتعافى نشاطها الدراجات العادية في غضون أسبوعين. على الرغم من تزاوج، قد لا يكون بعض الإناث الصفراء المجاميع (الشكل 3G) وبالتالي لن تكون تقبلا لنقل الأجنة. لهذا السبب، يجب فحص المبايض لوجود أجسام الصفراء، والتي عند 2.5 DPC يمكن تحديدها بشكل واضح عن الهياكل الحمراء الزاهية في المبيض (الشكل 3F). خلال عملية جراحية من المهم للحد من الاتصال مع الجهاز التناسلي عن طريق الاستيلاء على المبيض وسادة الدهنية بدلا من ذلك؛ التلاعب المفرط من المبيض والرحم قد يؤدي إلى إنحلال الجسم الأصفر. مقدمة من تلاعبن ماصة في قناة البيض هي الخطوة الأكثر تعقيدا من البروتوكول. في بعض المتلقين، قناة البيض هو الملتوية للغاية وليس هناك 2 ملم على التوالي تمتد من تقاطع مع الرحم. في هذه الحالة ترتيب قناة البيض وإجراء ثقب في أول منعطف. كما هو مفصل أعلاه، لطيفة التلاعب ماصة يجعل حقا الفرق. مرة واحدة وقد مرت ماصة من خلال تقاطع-الرحم الأنبوبي، فإنه ينزلق بسهولة. إذا لم يحدث ذلك، ماصة قد انحرفت عن قناة البيض وعدم التوصل إلى تجويف الرحم. مرة واحدة داخل الرحم، إذا لم تتدفق وسائل الإعلام، نقل ماصة قليلا خارج أو داخل وحاول مرة أخرى. إذا كان لا يزال لا تتدفق، وانسداد ماصة، اخراجه من الرحم، والإفراج عن المحتويات في طبق مع وسائل الاعلام التلاعب وإعادة تحميل نفس أو غيرها من ماصة. تسليم عادة ما يحدث 17 يوما بعد نقل الأجنة. لمنع أكل لحوم البشر، وتوفير المواد عشش 2 أيام مقدما وليس لتغيير القفص خلال الأيام الأولى بعد الولادة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من جانب صناديق من قسم علوم الحيوان والطيور لBT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine VEDCO Ketaved ANADA 200-257 To be ordered by a licensed veterinarian.
Xylazine Lloyd Laboratories Anased NADA #139-236 To be ordered by a licensed veterinarian.
Buprenorphine Generic NDC 400-42-010-01 To be ordered by a licensed veterinarian.
Eye ointment Novartis Genteal
Antibiotic Pfizer Clavamox NADA #55-101. Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.
Dressing serrated forceps ROBOZ RS-8120 Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.
Microdissecting serrated forceps ROBOZ RS-5137 These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred.
Slight curved micro dissection forceps ROBOZ RS-5136 This model is particularly useful to hold the oviduct.
Scissors ROBOZ RS-5880 Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
27 G needles Beckton-Dickinson 305136 Smaller needles (30 G) can be also used. 25 G may be a bit too big.
Clip applier MiKRon 42763
9 mm Clips MiKRon 427631
Clip remover MiKRon 7637 Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.
Suture needle holder ROBOZ RS-7820
Suture Dowist Gell 5-0 Dexon S 7204-21 Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.
Glass capillaries VWR 100 ul calibrated pipettes 53432-921 It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 µm filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in Nagy et al.8
Burner KISAG AG Typ 2002 Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.
Stereomicroscope Leica MZFLIII This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot. 
Fiber optics ilumination Dolan Jenner Fiber lite To iluminate the surgical area. There are different systems available.
Warm stages American scope http://store.amscope.com/tcs-100.html These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.
Culture dishes for embryo manipulation Falcon 353001 351008 may be also used; they made narrower drops.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fernandez-Gonzalez, R., et al. Long-term effect of in vitro culture of mouse embryos with serum on mRNA expression of imprinting genes, development, and behavior. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 101, 5880-5885 (2004).
  2. Bermejo-Alvarez, P., Roberts, R. M., Rosenfeld, C. S. Effect of glucose concentration during in vitro culture of mouse embryos on development to blastocyst, success of embryo transfer, and litter sex ratio. 79, 329-336 (2012).
  3. Tarkowski, A. K. Experiments on the development of isolated blastomers of mouse eggs. Nature. 184, 1286-1287 (1959).
  4. Whittingham, D. G. Fertilization of mouse eggs in vitro. Nature. 220, 592-593 (1968).
  5. McLaren, A., Biggers, J. D. Successful development and birth of mice cultivated in vitro as early as early embryos. Nature. 182, 877-878 (1958).
  6. McLaren, A., Michie, D. Studies on the transfer of fertilized mouse eggs to uterine foster-mothers. I. Factors affecting the implantation and survival of native and transferred eggs. J. Exp. Biol. 33, 394-416 (1956).
  7. Goto, Y., et al. The fate of embryos transferred into the uterus. J. Assist. Reprod. Gen. 10, 197-201 (1993).
  8. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2003).
  9. Chin, H. J., Wang, C. K. Utero-tubal transfer of mouse embryos. Genesis. 30, 77-81 (2001).
  10. Ramirez, M. A., Fernandez-Gonzalez, R., Perez-Crespo, M., Pericuesta, E., Gutierrez-Adan, A. Effect of stem cell activation, culture media of manipulated embryos, and site of embryo transfer in the production of F0 embryonic stem cell mice. Biol. Reprod. 80, 1216-1222 (2009).
  11. Miller, A. M., Wright-Williams, S. L., Flecknell, P. A., Roughan, J. V. A comparison of abdominal and scrotal approach methods of vasectomy and the influence of analgesic treatment in laboratory mice. Lab. Anim. 46, 304-310 (2012).
  12. Flecknell, P. A. Laboratory Animal Anaesthesia. Academic Press. Oxford, UK. (2009).
  13. Erhardt, W., Hebestedt, A., Aschenbrenner, G., Pichotka, B., Blumel, G. A comparative study with various anesthetics in mice (pentobarbitone ketamine-xylazine,carfentanyl-etomidate). Res. Exp. Med. 184, 159-169 (1984).
  14. Tarin, D., Sturdee, A. Surgical anaesthesia of mice: evaluation of tribromo-ethanol, ether, halothane and methoxyflurane and development of a reliable technique. Lab. Anim. 6, 79-84 (1972).
  15. Zeller, W., Meier, G., Burki, K., Panoussis, B. Adverse effects of tribromoethanol as used in the production of transgenic mice. Lab. Anim. 32, 407-413 (1998).
  16. Lieggi, C. C., et al. Efficacy and safety of stored and newly prepared tribromoethanol in ICR mice. Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 44, 17-22 (2005).
  17. Lieggi, C. C., et al. An evaluation of preparation methods and storage conditions of tribromoethanol. Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 44, 11-16 (2005).
  18. Meyer, R. E., Fish, R. E. A review of tribromoethanol anesthesia for production of genetically engineered mice and rats. Lab. Anim. 34, 47-52 (2005).
  19. Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biol. Reprod. 42, 432-440 (1990).
  20. Quinn, P., Barros, C., Whittingham, D. G. Preservation of hamster oocytes to assay the fertilizing capacity of human spermatozoa. J. Reprod. Fertil. 66, 161-168 (1982).
  21. Dios Hourcade, de, Perez-Crespo, J., Serrano, M., Gutierrez-Adan, A., A,, Pintado, B. In vitro and in vivo development of mice morulae after storage in non-frozen conditions. Reprod. Biol. Endocrinol. 10, 62 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics