העברת רחם-תובל עובר ועיקור במודל העכבר

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

העברת עובר ברחם, חצוצרות משתמשת בצומת הרחם-חצוצרות כמחסום כדי למנוע את יצוא העובר שעלול להתרחש בעת ביצוע העברה ברחם. זכרים שעוקרו נדרשים להשיג מקבלי pseudopregnant לעוברים. שני הטכניקות הם דנו.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bermejo-Alvarez, P., Park, K. E., Telugu, B. P. Utero-tubal Embryo Transfer and Vasectomy in the Mouse Model. J. Vis. Exp. (84), e51214, doi:10.3791/51214 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

העברת עוברי preimplantation לנקבה פונדקאית היא צעד הנדרש לייצורם של עכברים מהונדסים גנטי או כדי לחקור את ההשפעות של שינויים אפיגנטיים מקורו במהלך פיתוח preimplantation על בריאות פיתוח ומבוגר עוברית שלאחר מכן. השימוש בטכניקת העברת עובר יעילה ועקבית הוא חיונית כדי לשפר את הדור של בעלי חיים מהונדסים גנטי ועל מנת לקבוע את ההשפעה של טיפולים שונים על שיעורי השרשה והישרדות לטווח. עוברים בשלב הבלסטוציסט בדרך כלל מועברים על ידי העברת רחם, ביצוע לנקב בדופן הרחם להציג פיפטה המניפולציה עובר. פתח שבוצע ברחם אינו נסגר לאחר פיפטה בוטלה, והעוברים יכולים יצוא לחלל הבטן עקב הלחץ החיובי של הרחם. לנקב יכול גם לייצר דימום הפוגע בהשתלה, בלוקים טפטפת ההעברה ועלולה להשפיע על עובר דevelopment, במיוחד כאשר עובר ללא Zona מועברים. כתוצאה מכך, טכניקה זו לעתים קרובות תוצאות בשיעורי הישרדות עובר נמוך מאוד משתנים וכוללים. הימנעות השפעות השליליות אלה, העברת עובר ברחם, חצוצרות לנצל את צומת רחם-חצוצרות כמחסום טבעי המונע יצוא עובר ולהימנע מניקוב דופן הרחם. זכרים שעוקרו נדרשים לקבלת מקבלי pseudopregnant. טכניקה לביצוע ניתוח עיקור מתוארת כהשלמה לעוברים ברחם, חצוצרות.

Introduction

חזרת עוברים הוא כנראה ההליך הכירורגי השכיח ביותר שבוצע במודל העכבר. טכניקה זו היא חיונית כדי להשיג צאצאים מעוברים נתון במבחנה טכניקות מניפולציה, ולכן מהווה צעד הכרחי לפיתוח של מודלים מהונדסים גנטי על ידי הזרקת pronuclear, התמרה lentiviral, או היווצרות הכימרה. חוץ מזה, הטכניקה מאפשרת הלימוד של ההשפעות התפתחותיות של עלבונות מגוונים המתרחשים במהלך התפתחות preimplantation. השימוש בטכניקות מלאכותיות רבייה 1 או החשיפה לריכוזים חריגים של חומרים או מטבוליטים 2 שונים עשוי להשפיע על התפתחות עובר וכתוצאה מכישלונות השתלה או placentation והשפעות ארוך טווח בצאצאים. טכניקת חזרת עוברים אמינה לשחזור היא חיונית כדי לבדוק את ההשפעות שליליות האפשרית של טיפול ניסיוני בהשתלה והתפתחות העובר באדם עקבינר.

ניתן להעביר עוברי preimplantation Murine לנקבת נמען או לתוך oviduct באמצעות ampullae פוסט 0.5 ימים coitum הנמענים (DPC) pseudopregnant (העברת oviduct) 3,4 או לתוך הרחם של 2.5 נמען pseudopregnant DPC (העברת רחם) 5,6 בהתאם לשלב ההתפתחותי שלהם. עוברים בשלב הבלסטוציסט, כגון אלו המשמשים ליצירת עכברי chimeric על ידי הזרקה של תאי גזע pluripotent עובריים או מושרה, הם מועברים בדרך כלל על ידי העברת רחם. יכול גם להיות מועבר בלסטוציטים לoviduct של נמען DPC 0.5, אבל היא מהווה מבחן פחות פיסיולוגי למשבשים התפתחותי, כי העובר עובר diapause ויש לו 2 ימים להתאושש מהעלבון לפני ההשתלה מתרחשת. העברה ברחם כרוכה ניקוב דופן הרחם בעזרת מחט צרה על מנת ליצור הפתח המאפשר הגישה של פיפטה מניפולציה עובר לתוך לומן הרחם.lthough טכניקה זו יכולה להניב תוצאות טובות, ההישרדות לטווח (כלומר אחוז העוברים הועברו המתפתחים לגור) היא לעתים קרובות נמוכה ובלתי צפוי 7,8.

ניקוב דופן הרחם כרוך כמה תופעות לוואי מזיקות. ראשית, myometrium היא רקמת vascularized מאוד ולנקבה לעתים קרובות תוצאות דימום קטן. דם עלול לחסום את טפטפת העברת עובר או לפלוש ללומן רחם גרימת מוות עוברי ו / או כישלון השתלה. זה רלוונטי במיוחד כאשר עובר ללא Zona מועברים, כמו תאי הדם והפסולת יכולים לצרף לסטומרים. שנית, הפתיחה שבוצעה אינה חותמת אחרי העוברים הועברו, ולכן הם יכולים לזרום בחזרה דרך פתח ולהיות מגורשים לחלל הבטן, כאשר נפח גדול מדי כבר להכניס לתוך הרחם. העברת העובר ברחם, חצוצרות שתוארו במסמך זה לנצל את צומת הרחם-חצוצרות כדי לספק embryos לתוך הרחם ללא הצורך בניקוב דופן רחם ובכך להימנע מההשלכות השליליות שלה 9.

נקבות נמען pseudopregnant משמשות להעברת עובר מתקבלות על ידי הזדווגות טבעית עם זכרים עוקרו 8. הפרשות המכוננת המיוצרים על ידי זכר סטרילי נדרשות לרחם להפוך פתוח לעוברים שהועברו. כדי להשיג נמען, למקסימום של 2 נקבות של 8 שבועות עד 6 חודשים של גיל מונחים עם זכר שעוקר בשעתי אחר הצהריים. למחרת בבוקר, נשים נבדקות לנוכחות של תקע הזדווגות בנרתיק, סבך של חלבונים קרוש מנוזל הזרע הגברי. כהזדווגות מתרחשת בדרך כלל בחצות, היום של גילוי תוסף נרתיק נחשב 0.5 DPC. למרות שניתן לרכוש זכרים עוקרו מכמה ספקים, ההליך הכירורגי שתואר במסמך זה הוא קל יחסית ואינו דורש כל מכשירים נוספים מהנדרש להעברת עובר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי הטיפול בבעלי חיים פינת Beltsville והשימוש Comittees (BAACUC 11-015) בהתאם משרד החקלאות טיפול בבעלי חיים ושימוש בהנחיות.

1. הרדמה ושיכוך כאבים (משותף לשני פרוצדורות כירורגיות)

  1. לשקול את העכבר ולטעון את חומרי ההרדמה ומשככי כאבים הבאים בשני מזרקים 1 מיליליטר עם 27 מחטי G:
    1. קטמין (0.1 מ"ג / גר ': 0.01 מיליליטר / גרם של פתרון 10 מ"ג / מיליליטר) ו xylazine (0.01 מ"ג / גר': 0.005 מיליליטר / גרם של פתרון 2 מ"ג / מיליליטר).
    2. עצירות (0.1 מיקרוגרם / g: 0.01 מיליליטר של פתרון 0.01 מ"ג / מיליליטר).
  2. לשתק את העכבר על ידי להרים את העורף שלה קרוב ללסתות ככל האפשר עם האגודל ואצבע מורה ומחזיק את הזנב בין האצבעות הקטנות וטבעת.
  3. הזרק תערובת קטמין-Xylazine intraperitoneally. על מנת להימנע מניקוב איברים פנימיים, להחזיק את העכבר עםראשו מעט מתחת לרמה של ירכיה (איור 1 א)
  4. להזריק תת עורי עצירות בעורפו של צוואר אחיזה בין האגודל ואצבע המורה (איור 1).
  5. השאר את העכבר בכלוב (הנקי וללא כל בעל חיים אחרים) על במה חמה.
  6. ברגע שלא מודע, לבדוק על היעדריו של רפלקס האחורי ברגל (נבדק על ידי קמצוץ הבוהן). החל משחה העין כדי למנוע יובש בעיניים ולבדוק על היעדריו של רפלקס palpebral (תרשים 1C).
  7. פרוטוקול זה מספק מטוס כירורגית בהרדמה למינימום של 30 דקות, מספיק כדי לבצע את ההליכים המתוארים להלן (פרוטוקולים 2 ו -3). אם פעמים יותר נדרשות, זריקה נוספת של קטמין + xylazine עם מחצית מהמינון שתואר ב1.1.1 יכולה להיות מיושמת לאחר 30 דקות. שינוי בדפוס נשימה לאחד מהיר ולא סדיר מצביע על loss של מטוס ההרדמה המתאים.

2. ניתוח עיקור

  1. השתמש בגברים עם ביצועי הזדווגות מוכחות.
  2. לעקר מכשירי ניתוח, לנקות את המשטחים שבו ניתוח יבוצע ולנגב אותם עם 70% אתנול.
  3. לבצע הרדמה כמפורט לעיל (פרוטוקול 1), בדיקה לאובדן הרפלקסים.
  4. מניחים את העכבר על במה חמה, להסיר את פרווה עם קוצץ חשמלי מאזור הגחון בין שני קווים רוחביים דמיוניים להציב 0.5 סנטימטר ו2.5 ס"מ מעל הפין (איור 2 א).
  5. לטהר את האזור המגולח ידי ניגוב רציף עם 10% יוד povidone ו70% אתנול.
  6. מניחים את העכבר במצב שכיבה עם הזנב לכיוון המנתח ומכסה במגבת סטרילית עם חור חושף את האזור המגולח. להאיר את אזור הניתוח.
  7. בצע incisio עור אורך 10-15 מ"מn בקו המדיאלי של הבטן, כ 1 סנטימטר מעל לפין. את העור עם רוטב מלקחיים משוננים ולאחר מכן לגזור במספריים (2A דמויות ו2B).
  8. בצע חתך אורכי 5-10 מ"מ בalba Linea. החזק את השרירים עם microdissecting מלקחיים משוננים ולגזור במספריים (איור 2 ג).
  9. תפוס את רפידת שומן האשכים של צד אחד עם מיקרו לנתח מלקחיים משוננים ולמשוך אותו לחשוף את האשך, צינור זרע ויותרת אשך. זרע זרע ממוקם המדיאלי לאשך וזה צינור בחינם להבחין בבירור (לא צמוד לקיר כמו האשך יותרת האשך) עם כלי דם רצו לאורך צד אחד (איור 2 ד).
  10. מחזיק את צינור זרע עם מלקחיים לנתח מיקרו משונן, מלקחיים הלבשה להבה עד שהם הופכים לאדומים (איור 2E ולצרוב את צינור הזרע בשתי נקודות בו זמנית (איור 2F). החתך צריך להסיר את החלק של כ -5 מ"מ ולהשאיר שני יופרדו בצורה ברורה קצוות צרובים (איור 2G).
  11. הזז את האשך, יותרת האשך וצינור זרע חזרה לחלל הבטן.
  12. להמשיך משלב 9 באשך השני.
  13. תפרת את השריר עם תפרים מזרן אופקיים אחד או שניים עשו עם 5/0 תפר נספג (איור 2H).
  14. לתפור את העור עם קוצץ אחד או שניים פצע (איור 2 ט).
  15. זהה את זכר vasectomised (טבעת אוזן, קעקוע אצבע ...), להעביר אותו לכלוב שהונח על במה חמה ולהתבונן עד שהוא מתאושש מהרדמה (מודעת ולשמור על עינת חזה). הזרקה תת עורית מיליליטר 0.5-1 של תמיסת מלח חמימה משפרת מחדשcovery. רשום את מקרים האפשריים המתרחשים בעת העברת כריתת צינור זרע, להוסיף אנטיביוטיקה למי השתייה.
  16. ניתן להסיר קליפים פצע 10 ימים לאחר כריתת צינור זרע עם מסיר גוזז פצע או זוג המלקחיים שיניים. הזכר שעוקר יהיה מוכן להזדווג 2 שבועות לאחר ניתוח.
  17. בדוק את פוריותו של הזכר שעוקר על ידי הזדווגות עם נקבות פורה לפני השימוש בו כדי להשיג נמענים.

3. חזרת עוברים ברחם, חצוצרות

  1. עכבר morulae או בלסטוציטים ניתן להעביר על ידי טכניקה זו לנקבת נמען pseudopregnant ב2.5 DPC.
  2. הכן את פיפטה זכוכית המניפולציה עובר:
    1. ללטש את קצות נימי זכוכית על מנת למנוע נזק לבעל פיפטה.
    2. לרכך את החלק אמצעי של נימי זכוכית על ידי חימום עם להבה עדינה תוך סיבוב מעטהנימים בשתי הידיים באופן סינכרוני. ברגע שסעיף הנימים הופך להיות רך וגמיש (צבע אדום בהיר), לסגת ממנו במהירות מהאש ולמשוך את שני הקצוות כדי לצמצם בקוטר החיצוני שלה ל130-150 מיקרומטר.
    3. חכה לזכוכית להתקרר ולאחר מכן לחתוך אותו בקלילות הבקיע החלק הצר בעיפרון יהלומי נקודה, אבן מחוספסת או פצירה ומושך משני הצדדים. צריכה להיות ההפסקה נקייה ובניצב
  3. ללטש את הקצה על ידי בוער מהר מאוד, והשאיר הפתח 100-130 מיקרומטר. טפטפות יכולה להיות מאוחסנת לשימוש מאוחר יותר.
  4. תקשורת מניפולציה עובר החמה (CZBH או M2, ראה דיון).
  5. לעקר מכשירי ניתוח, לנקות את המשטחים שבו ניתוח יבוצע ולנגב אותם עם 70% אתנול.
  6. לבצע הרדמה כמפורט לעיל (פרוטוקול 1), בדיקה לאובדן הרפלקסים.
  7. שמירה על tהוא העכבר על במה חמה, להסיר את הפרווה עם קוצץ חשמלי מאזור הגב בין הברכיים וצלעות דיסטלי (3A דמויות ו3B).
  8. לטהר את האזור המגולח ידי ניגוב רציף עם 10% יוד povidone ו70% אתנול.
  9. הזז את העוברים מן החממה לתקשורת המניפולציה עובר prewarmed.
  10. הזז את הנמען לבמה חמה מתחת לסטראו ולמקם אותו בעמדה נוטה רוחבי למנתח (בראשה מביט לימין או לצד שמאל של המנתח).
  11. מכסה את האזור במגבת סטרילית עם חור חושף את האזור המגולח ולהאיר את אזור הניתוח.
  12. בצע רוחבי 1 סנטימטר חתך (אנכי) בעור במיקום ממוקם על ⅓ הגולגולת של הקו בין הצלע האחרונה והירכיים ו⅓ הגב של הקו בין הגב והבטן (3A דמויותnd 3B). את העור עם רוטב מלקחיים משוננים ולגזור במספריים (איור 3 ג).
  13. ברגע שהעור נחתך, השחלה (אדום / כתום) או כרית השומן המקיפה את השחלה (לבנה) יכול להיות דמיינו דרך קיר הגוף. בצע שוכל סנטימטר 0.3-0.5 חתך (אנכי) בקיר הגוף על השחלה או כרית שומן במקום שבו החתך לא לחתוך את כל כלי דם גדולים. החזק את השרירים עם מלקחיים משוננים לנתח מיקרו ולגזור במספריים (איור 3D).
  14. להזיז את העכבר כדי לקבל את ראשו פונה כלפי המנתח.
  15. טען את פיפטה עובר המניפולציה (3E איור):
    1. לאפשר תקשורת CZBH לעלות בנימיות דרך החלק הצר של פיפטה המניפולציה עד כ -5 מ"מ של חלק הרחב יותר.
    2. קח את בועת אוויר קטנה (0.2-0.5 מ"מ).
    3. להציג את העוברים (5-10) בכמות מינימאלית של תקשורת (2-4 מ"מ).
    4. קח את עוד בועת אוויר קטנה (0.2-0.5 מ"מ) וכמות קטנה של מדיה (0.5-1 מ"מ).
    5. השאר את פיפטה הזכוכית מחוברת לבעל aspirator פה או למכשיר מופעל ביד, מוכן לצעד 3.17.
  16. תפוס את רפידת השומן המקיפה את השחלה עם מלקחיים משוננים לנתח מיקרו ולמשוך אותו לכיוון ראש העכבר כדי לחשוף את השחלה, oviduct, וחלק קטן של הרחם העליון מחוץ לחלל הבטן (3F דמויות ודור 3).
  17. מחזיק חתיכת הפה aspirator בפה, מוכן לשימוש, תופס את כרית השומן עם מלקחיים משוננים לנתח מיקרו כדי להזיז את oviduct ולחשוף את צומת הרחם-תובל (כלומר היכן oviduct עומד ברחם).
  18. שמירה על צומת הרחם-תובל נגיש, לקחת מלקחיים מעוקלים קלים מיקרו לנתיחה ביד שמאל (אם ימניים) ולמקם אותם ממש מתחתצומת הרחם-תובל תופסת oviduct כ 2 מ"מ מעל חלק זה.
  19. מחזיק את צומת הרחם-חצוצרות עם המלקחיים נתיחה קלים המעוגלים מיקרו, לנקב את סעיף oviduct הקרוב למלקחיים עם מחט G 27 (איור 3H).
  20. הכנס את פיפטה המניפולציה העובר לתוך פתח הופיע עם המחט ומראש לרחם דרך צומת הרחם-תובל (איורים 3I ו3J). ברגע שפיפטה עברה את הצומת ברחם, חצוצרות (איור 3K) הוא מחליק בקלות. לא יתקדם רחוק מאוד אל תוך הרחם כדי למנוע נזק של רירית הרחם (לא יותר מ 3 מ"מ) וחסימת פיפטה על ידי הפסולת.
  21. שחרר את העוברים לתוך הרחם על ידי בעדינות נושבת (איור 3L). שני בועות האוויר חייבים לעבור דרך הרחם. חלק מכלי התקשורת מעל הבועה הראשונהיכול גם להשתחרר אל תוך הרחם, אבל למנוע החדרת אוויר יותר, מכיוון שהוא עלול לעכב השתלה.
  22. הסר את פיפטה רק לאחר העוברים שוחררו אל תוך הרחם.
  23. הזז את oviduct ושחלה חזרה לחלל הבטן על ידי גרירת כרית השומן.
  24. תפרת את השריר עם תפר מזרן אופקי עם 5/0 תפר נספג (איור 3M).
  25. לתפור את העור עם גוזז פצע (איור 3N).
  26. להמשיך משלב 10 בצד השני, אם נדרש.
  27. זהה את הנמען (טבעת אוזן, קעקוע אצבע ...), להעביר אותה לכלוב שלה (שהונח על במה חמה) ולבחון עד שהוא מתאושש מהרדמה (מודעת ולשמור על עינת חזה).
  28. סמן במקרים האפשריים המתרחשים במהלך חזרת עוברים ולהוסיף אנטיביוטיקה למי השתייה. הזרקה תת עורית מיליליטר 0.5-1 של סאלי החמהפתרון ne משפר את ההתאוששות.
  29. ניתן להסיר קליפים פצע 10 ימים לאחר חזרת עוברים עם מסיר גוזז פצע או שני זוגות מלקחיים (איור 3O). הנמען יכול להישקל באותו יום כדי להעריך את ההריון ולהעריך את מספר הגורים. לספק חומר גוזל לנמען 15 ימים לאחר חזרת עוברים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

העברת עובר ברחם, חצוצרות מספקת מתכוון להעביר עוברים אל רחם הימנעות חלק מהסיבוכים הקשורים לעוברים ברחם 2,9,10. בטבלה 1 אנו מראים כמה תוצאת נציג השגנו העברת בלסטוציטים CD1 נתון למיני מניפולציות לנמעני CD1 שונים בעקבות הפרוטוקול המתואר. ההישרדות לטווח (% מעוברים וכתוצאה מגור) או הישרדות לE15 (במקרה של lentivirus נחשף) דומה בין עוברים פשוט בתרבית במבחנה משלב הזיגוטה (IVC), עובר נתון להזרקת iPSC לייצר גורי chimeric ועוברים שהוסרו Zona ונחשפו לlentivirus עבור 7 שעות לפני חזרת עוברים. לכן, חזרת עוברים ברחם, חצוצרות היא טכניקה אמינה להעברת עוברים מסובכים במיוחד כגון אלה חסרי pellucida Zona וטופחו עם lentivirus.

together.within-page = "תמיד"> איור 1
איור 1. הזרקה של חומרי הרדמה ומשככי כאבים.) זריקה intraperitoneal של קטמין-Xylazine. הזרקה תת עורית של יישום עצירות. C) של משחת עיניים ב ').

איור 2
איור 2. . פרוטוקול ניתוח עיקור) נקודת החתך (מתוארת עם "X" אדום) ממוקמת כ 1 סנטימטר מעל לפין; להסיר פרווה מ0.5-2.5 סנטימטר מעל איבר מין (קווים שחורים) חתך שריר B) חתך בעור C)... זרע ד) Vas (חץ שחור) ומבחןתפר (*). E) Flaming של המלקחיים לצריבה. F) הצריבה של צינור הזרע בשתי נקודות בו זמנית. זרע G) Vas מופרד באופן ברור לשני קצוות צרובים. H) תפר שריר.) עור. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3
איור 3. פרוטוקול רחם-תובל העברת עובר A, B) הגבי ותצוגה לרוחב של נקודת החתך (מתוארת עם "X" אדום);. קווים שחורים בין הצלעות והאגן האחרונים (A, B) ובין הגב והבטן (B) תשמש כמדריך. חתך בעור) C. E עמוסה 5 בלסטוציטים מוכן להעברה. F, G) השחלות נציג עם (F) או בלי (lutea corpora) G, מסומן בחצים שחורים. HK) לענין ייצוג , סימולציה של עוברים ברחם, חצוצרות בוצעה טעינת פיפטה מניפולציה זכוכית עם פתרון trypan כחול 0.4%. H) ניקוב oviduct (חץ שחור) קרוב לרחם (*). אני) מבוא של פיפטה המניפולציה עובר לתוך פתח שבוצע בעבר. J) פיפטה המניפולציה העובר מקדמת דרך צומת הרחם-חצוצרות. K) נפח שווה ערך trypan הכחול פתרון שלשוחרר בהעברת עובר כבר גורש בלומן הרחם (חץ שחור). L) כדי לבדוק את הסגר יעיל המיוצר על ידי צומת הרחם-חצוצרות, כלתוכן של פיפטה המניפולציה שוחרר אל תוך הרחם; צומת רחם-חצוצרות (חץ) מעכבת את הזרימה האחורית של פתרון trypan הכחול שוחרר לרחם (*) הסרת קליפ M) תפר שריר N) תפר עור O).... P) 15 ימים לאחר חזרת עוברים לספק חומר גוזל לנמען המלטת Chimeric. Q) הושגה בעקבות טכניקה זו. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

טיפול מספר ההעברות עוברים הועברו גורים נמסרו הישרדות לtERM (%)
IVC 11 110 82 74.5
הזרקת iPSC 3 50 35 70.0
Lentivirus 6 60 44 73.3

טבלת 1. השיגו תוצאות נציג לאחר העברת שלוש קבוצות שונות של עוברי מניפולציות בעקבות העברת עובר ברחם, חצוצרות. 1) עוברים בתרבית במבחנה (IVC) מהשלב הזיגוטה לשלב הבלסטוציסט, 2) בבלסטוציטים vivo מיוצר הוזרק 10 mousדואר iPSC לייצר עכברי chimeric, 3) בvivo מיוצר בלסטוציטים שהוסר Zona והודגרו במשך שעה 7 עם lentivirus להביע GFP. הנתונים מייצגים את מספר הגורים שנולדו מתוך מספר העוברים הועברו מלבד קבוצת lentivirus חשופה, שבו הם מייצגים את מספר עוברי קיימא 10 ימים לאחר חזרת עוברים, כמו הריון לא יאפשר להתקדמות נוספת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ניתוח העיקור הוא טכניקה כירורגית קדימה יחסית ישרה שאינו כרוכה בקשיים גדולים. כאשר חיטוי עם יוד povidone ואתנול לוודא כי השטיפה האחרונה (עם אתנול) מסירה יוד povidone, מכיוון שהוא עלול לגרום לגירוי הצפק. הגישה לצינור זרע גם יכולה להיות מושגת על ידי שק האשכים או ביצוע חתך רוחבי בבטן 8. חתך האשכים כבר המליץ ​​לי רוחבי חתך בבטן עקב החתך הקטן יחסית לצורך ולאחר ניתוח התנהגות 11 מעט טובה יותר. עם זאת, אנו מעדיפים את החתך בבטן מעל צק האשכים מכיוון שהוא מספק גישה קלה יותר וברורה יותר לdeferentia Vasa משני האשכים, המונע מנתחי טירון מצריבת פעמיים את אותו צינור הזרע ומשאיר את צינור זרע פונקציונלי. בין שני טכניקות הבטן, אנו דוגלים חתך אורכי בalba Linea מעל transverסאל כי זה לא לחתוך את כל סיבי שרירי בטן, הימנעות מהפיתוח של בקע בבטן. עם זאת, שניהם עיקור ופרוטוקולי העברת עובר ברחם, חצוצרות יכולים להיות מותאמים לציוד זמין או לאוהבו האישי של החוקר. לדוגמא, מעקר את חרוז זכוכית ניתן להשתמש כדי לחמם את המלקחיים השתמשו כדי לצרוב צינור הזרע. בכל מקרה, זה חיוני כדי לעקוב אחר טכניקת aseptic, כדי לספק הרדמה ושיכוך כאבים נכונה על מנת למקסם את רווחת בעלי חיים, וכדי לעמוד בתקנות מקומיות.

היבט נוסף רגיש לשינויים הוא פרוטוקול ההרדמה. אם הרדמה שאיפה (isoflurane) זמינה, אנו מעודדים את השימוש בו, במקום parenteral הרדמה (להזרקה), כפי שהיא מספקת מטוס הרדמה יציב מאוד והתאוששות מהירה. עם זאת, חשוב לציין כי הרדמה שאיפה עדיין דורשת שימוש במשככי כאבים לכאבי פנים ולאחר ניתוח, שאמור להיות administered לפני הניתוח כpremedication. עצירות היא אופיואידים המספקים שיכוך כאבים לטווח ארוך בעכבר 12. הרדמה parenteral מספקת גם מטוס הרדמה טוב להליכים קצרים כגון כריתת צינור זרע וחזרת עוברים. קטמין-Xylazine הוא שילוב מאוד אמין לניתוח עכבר 13 ואנחנו מעולם לא נצפו כל סיבוכי הרדמה באמצעות השילוב הזה בשיתוף עם premedication עם עצירות. ניתן להשתמש בשילובים parenteral אחרים 12, אבל אנחנו לעודד את השימוש בתערובת נרקוטיים Avertin (tribromoethanol), כפי שרק מנה אחת ניתן לנהל ומאמרים רבים דיווחו על סיבוכים שונים הקשורים לשימוש שלה, כגון גירוי מקומי, שיכוך כאבים עניים, ileus , הידבקויות סיבי בחלל הבטן, הנמק של סיבי שריר subperitoneal ואברי בטן על פני השטח, ואפילו התמותה 14-18.

העברת עובר דורשת ניהול טוב של שני העובריםנמען ד. ככלל לעוברי יונקים, שלב ההתפתחות של העוברים יכול להיות מתקדם יותר משלב pseudopregnancy של הנמען, אך לא להיפך. במילים אחרות, את העוברים יכולים לחכות לאמא, אבל האמא לא יכולה לחכות לעוברים, ולכן טכניקה זו יכולה לשמש כדי להעביר morulae או בלסטוציטים, אבל שלבים לא קודם לכן. העברת עובר ברחם, חצוצרות יכולה להתבצע יומיים לאחר זיהוי של תוסף הנרתיק מהצהריים (2.5 DPC) לערב הלילה (3 DPC), כאשר לצומת הרחם-חצוצרות פתוחה כדי לאפשר את המעבר הטבעי של עוברים מצינור השחלה לקרני רחם. בהתחשב בכך שהעוברים הועברו ייתכן שכבר סבלו מסוג כלשהו של מניפולציה, טיפול בעובר צריך למזער כל נזק נוסף. ניתן למצוא מדריך מצוין למניפולציה עובר עכבר בנאגי ואח'. 8 שתי תקשורת הנפוצה ביותר עכבר המניפולציה עובר, המחזיקה בpH פיסיולוגי באופן קבוע באטמוספרה, הן CZBH 19 וM2 20. אמנם בעוברי עכבר vivo המיוצרים יכול להתגבר על החשיפה לטמפרטורה קרה או pH נורמלי לתקופות ארוכות 21, יש prewarmed תקשורת מניפולציה. אם התקשורת היא prewarmed בצלחת תרבות, להימנע מההתחממות לתקופות ארוכות (יותר מ 40 דקות), כפי שosmolarity של התקשורת יגדל בשל אידוי מים ושיכול להזיק יותר מאשר תקשורת מניפולציה קרה. באופן דומה, הזמן עובר בילה בתוך פיפטה המניפולציה צריך להיות ממוזער בשל הנפח הקטן המצויה בפיפטה.

השימוש בפיפטה מניפולציה עובר נכונה הוא קריטית להצלחתו של הפרוטוקול. טפטפות המניפולציה יכולה להיות עשויה מנימי זכוכית עם קיר זכוכית דק. טפטפות פסטר, המשמשת לעתים קרובות לטיפול בעוברים של בעלי חיים גדולים, גם יכולה להיות מועסק, אך בשל מרחק קצר יותר שלו מהידית ועד לקצה, טפטפות מניפולציה עשויה מזכוכית נימים הן comf יותרortable לתמרן. החשיפה ללהבה והמהירות של משיכת לקבוע את עובי הקיר וקוטר פנימי של פיפטה. למרות שניתן לעשות זאת בקלות על ידי טפטפות המניפולציה יד אחרי אימון, מושך קצת ומיקרו לזייף יכולים לשמש גם. חשוב להשקיע זמן בהפקת כמה טפטפות מניפולציה אופטימלית. צמצם פיפטה המניפולציה צריך להיות רחב יותר מעובר כדי לאפשר זרימה חלקה, אך קטן מספיק כדי לחדור בקלות ולהתקדם דרך צומת הרחם-חצוצרות. אם המעטפת השקופה הוסרה לפני ההעברה, בלסטוציטים בדרך כלל להתרחב לקוטר גדול יותר. במקרה זה, רצוי לעשות טפטפות רחבה יותר עם צמצם רחב יותר (130-180 מיקרומטר) כדי למנוע נזק לתאי trophectoderm. פולני עצה חשובה כדי למנוע נזק לצינור השחלה, דופן רחם ואת העובר - במיוחד אם Zona הוסר, וכדי למנוע את קצה פיפטה מלהיות חסום על ידי פסולת. עם זאת, לאחר הליטוש, הצמצם n צריךot להיות קטן מדי בהשוואה לקוטר הפנימי של פיפטה, כמו ירידה חדה בקוטר תגרום שינויים פתאומיים במהירות זרימה. שופר aspirator מספק זרימת שליטה מדויקת יותר, כמו גם יד תנוחה נוחה יותר בהשוואה למכשירי כף מבוקרת. עם זאת, מכשיר כף מבוקרת ניתן להשתמש במידת הצורך (למשל כאשר מניפולציה עוברים שטופלו lentivirus). לזרימה אופטימלית וכדי למנוע את ההעברה של שמן מינרלים, זה גם מומלץ להשתמש בפיפטה חדשה לעוברים במקום שנהג להעביר את העוברים מהתקשורת והתרבות בתקשורת המניפולציה. לבסוף, תוך הצגת פיפטה דרך צינור השחלה, הנימים צריכים להיות מטופלים באופן ישיר, כלומר. תופס את הזכוכית ולא את ידית הפלסטיק של aspirator, כדי להשיג אחיזה איתנה. הגדלה המשמשת להעברת עובר היא עניין אישי שתלוי בחדות הראייה של המנתח. אנחנו מעדיפים להשתמש בהגדלה נמוכה כדי לקבל שדה ראייה רחב,כך אנו משתמשים בהגדלה סופית 10X (עיני 10X ואובייקטיבי 1X).

המקבלים צריכים להיות לפחות 8 שבועות ושוקלים בין 27-40 גרם. Outbreed עכברים כגון CD1 או השוויצרי וובסטר להציג התנהגות אימהית טובה והם המקבלים מצוינים. מומלץ להגדיר רבייה להשיג נמענים נוספים, כמו אלה שאינם משמשים יתאוששו פעילות רכיבה על אופניים הרגילה שלו בשבועות. למרות שהזדווגו, כמה נקבות לא יכולות להיות lutea corpora (איור 3G) ולכן לא תהיה פתוח לעוברים שהועברו. מסיבה זו, השחלות צריכה להיבדק לנוכחות של corpora lutea, אשר ב2.5 DPC ניתן לזהות בבירור כמבני אדום בהירים בשחלה (איור 3F). במהלך הניתוח זה הוא חשוב כדי למזער את המגע עם מערכת הרבייה על ידי גרירת כרית שומן השחלות במקום; מניפולציה יתר של השחלה והרחם עלולה לגרום לluteolysis. המבוא של manipulatioפיפטה n לoviduct היא הצעד המסובך ביותר של הפרוטוקול. אצל חלק ממקבלים, oviduct הוא מאוד מעוותת ואין למתוח ישר 2 מ"מ מהצומת עם הרחם. במקרה זה לסדר את oviduct ולבצע הניקור בעיקול הראשון. כמפורט לעיל, פיפטה מניפולציה נחמדה באמת עושה את הבדל. ברגע שפיפטה עברה דרך צומת הרחם-תובל, הוא מחליק בקלות. אם לא, פיפטה אולי חרגה מצינור השחלה ולא הגיעה ללומן הרחם. פעם אחת בתוך הרחם, אם התקשורת לא זורמת, הזז את פיפטה מעט החוצה או פנימה ולנסות שוב. אם זה עדיין לא זורם, פיפטה סתומה, מוציא אותו מהרחם, שחרר את התוכן בצלחת עם תקשורת מניפולציה ולטעון מחדש את אותו הדבר או אחרת פיפטה. משלוח בדרך כלל מתקיים 17 ימים לאחר חזרת עוברים. כדי למנוע קניבליזם, לספק גוזל חומר 2 ימים מראש ולא ניתן לשנות את הכלוב בימים הראשונים לאחר לידה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מהמחלקה למדעי בעלי חיים ועופות לBT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine VEDCO Ketaved ANADA 200-257 To be ordered by a licensed veterinarian.
Xylazine Lloyd Laboratories Anased NADA #139-236 To be ordered by a licensed veterinarian.
Buprenorphine Generic NDC 400-42-010-01 To be ordered by a licensed veterinarian.
Eye ointment Novartis Genteal
Antibiotic Pfizer Clavamox NADA #55-101. Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.
Dressing serrated forceps ROBOZ RS-8120 Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.
Microdissecting serrated forceps ROBOZ RS-5137 These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred.
Slight curved micro dissection forceps ROBOZ RS-5136 This model is particularly useful to hold the oviduct.
Scissors ROBOZ RS-5880 Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
27 G needles Beckton-Dickinson 305136 Smaller needles (30 G) can be also used. 25 G may be a bit too big.
Clip applier MiKRon 42763
9 mm Clips MiKRon 427631
Clip remover MiKRon 7637 Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.
Suture needle holder ROBOZ RS-7820
Suture Dowist Gell 5-0 Dexon S 7204-21 Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.
Glass capillaries VWR 100 ul calibrated pipettes 53432-921 It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 µm filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in Nagy et al.8
Burner KISAG AG Typ 2002 Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.
Stereomicroscope Leica MZFLIII This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot. 
Fiber optics ilumination Dolan Jenner Fiber lite To iluminate the surgical area. There are different systems available.
Warm stages American scope http://store.amscope.com/tcs-100.html These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.
Culture dishes for embryo manipulation Falcon 353001 351008 may be also used; they made narrower drops.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fernandez-Gonzalez, R., et al. Long-term effect of in vitro culture of mouse embryos with serum on mRNA expression of imprinting genes, development, and behavior. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 101, 5880-5885 (2004).
  2. Bermejo-Alvarez, P., Roberts, R. M., Rosenfeld, C. S. Effect of glucose concentration during in vitro culture of mouse embryos on development to blastocyst, success of embryo transfer, and litter sex ratio. 79, 329-336 (2012).
  3. Tarkowski, A. K. Experiments on the development of isolated blastomers of mouse eggs. Nature. 184, 1286-1287 (1959).
  4. Whittingham, D. G. Fertilization of mouse eggs in vitro. Nature. 220, 592-593 (1968).
  5. McLaren, A., Biggers, J. D. Successful development and birth of mice cultivated in vitro as early as early embryos. Nature. 182, 877-878 (1958).
  6. McLaren, A., Michie, D. Studies on the transfer of fertilized mouse eggs to uterine foster-mothers. I. Factors affecting the implantation and survival of native and transferred eggs. J. Exp. Biol. 33, 394-416 (1956).
  7. Goto, Y., et al. The fate of embryos transferred into the uterus. J. Assist. Reprod. Gen. 10, 197-201 (1993).
  8. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2003).
  9. Chin, H. J., Wang, C. K. Utero-tubal transfer of mouse embryos. Genesis. 30, 77-81 (2001).
  10. Ramirez, M. A., Fernandez-Gonzalez, R., Perez-Crespo, M., Pericuesta, E., Gutierrez-Adan, A. Effect of stem cell activation, culture media of manipulated embryos, and site of embryo transfer in the production of F0 embryonic stem cell mice. Biol. Reprod. 80, 1216-1222 (2009).
  11. Miller, A. M., Wright-Williams, S. L., Flecknell, P. A., Roughan, J. V. A comparison of abdominal and scrotal approach methods of vasectomy and the influence of analgesic treatment in laboratory mice. Lab. Anim. 46, 304-310 (2012).
  12. Flecknell, P. A. Laboratory Animal Anaesthesia. Academic Press. Oxford, UK. (2009).
  13. Erhardt, W., Hebestedt, A., Aschenbrenner, G., Pichotka, B., Blumel, G. A comparative study with various anesthetics in mice (pentobarbitone ketamine-xylazine,carfentanyl-etomidate). Res. Exp. Med. 184, 159-169 (1984).
  14. Tarin, D., Sturdee, A. Surgical anaesthesia of mice: evaluation of tribromo-ethanol, ether, halothane and methoxyflurane and development of a reliable technique. Lab. Anim. 6, 79-84 (1972).
  15. Zeller, W., Meier, G., Burki, K., Panoussis, B. Adverse effects of tribromoethanol as used in the production of transgenic mice. Lab. Anim. 32, 407-413 (1998).
  16. Lieggi, C. C., et al. Efficacy and safety of stored and newly prepared tribromoethanol in ICR mice. Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 44, 17-22 (2005).
  17. Lieggi, C. C., et al. An evaluation of preparation methods and storage conditions of tribromoethanol. Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 44, 11-16 (2005).
  18. Meyer, R. E., Fish, R. E. A review of tribromoethanol anesthesia for production of genetically engineered mice and rats. Lab. Anim. 34, 47-52 (2005).
  19. Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biol. Reprod. 42, 432-440 (1990).
  20. Quinn, P., Barros, C., Whittingham, D. G. Preservation of hamster oocytes to assay the fertilizing capacity of human spermatozoa. J. Reprod. Fertil. 66, 161-168 (1982).
  21. Dios Hourcade, de, Perez-Crespo, J., Serrano, M., Gutierrez-Adan, A., A,, Pintado, B. In vitro and in vivo development of mice morulae after storage in non-frozen conditions. Reprod. Biol. Endocrinol. 10, 62 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics