Utero-tubal Embryo Transfer og vasectomy i Mouse Model

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Utero-tubal embryo bruker utero-tubal krysset som en barriere for å hindre at embryo utgang som kan oppstå når du utfører livmor overføring. Vasectomized menn er pålagt å skaffe pseudopregnant mottakere for embryo. Begge teknikker blir diskutert.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bermejo-Alvarez, P., Park, K. E., Telugu, B. P. Utero-tubal Embryo Transfer and Vasectomy in the Mouse Model. J. Vis. Exp. (84), e51214, doi:10.3791/51214 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Overføringen av preimplantation embryo til en surrogat Hunnen er et nødvendig steg for produksjon av genmodifiserte mus eller for å studere effektene av epigenetiske forandringer oppsto under preimplantation utvikling på påfølgende fosterutvikling og helse i voksen alder. Bruken av en effektiv og konsistent embryo-overføring er avgjørende for å forbedre genereringen av genetisk modifiserte dyr, og for å bestemme effekten av forskjellige behandlinger på implantasjon rater og overlevelse til termin. Embryoer ved blastocyst stadiet er vanligvis overføres ved livmor overføring, utføre en punktering i livmorveggen for å innføre embryo manipulasjon pipette. Den åpning utført i livmoren ikke lukkes etter at pipetten er trukket tilbake, og embryoene kan for utstrømning til bukhulen på grunn av det positive trykket i livmoren. Punktering kan også produsere en blødning som svekker implantasjon, blokkerer overføring pipette og kan påvirke fosteret development, spesielt når embryo uten zona overføres. Derfor denne teknikken resulterer ofte i svært variable og totale lav embryo overlevelse. Unngå disse negative effektene, utero-tubal embryo dra nytte av utero-tubal krysset som en naturlig barriere som hindrer embryo strøm og unngå punktering av livmorveggen. Vasectomized hanner er nødvendig for å skaffe pseudopregnant mottakere. En teknikk for å utføre vasektomi er beskrevet som et supplement til utero-tubal embryo.

Introduction

Embryo er sannsynligvis den hyppigste kirurgiske inngrepet utført i mus modell. Denne teknikken er svært viktig for å oppnå avkom fra embryoer som er utsatt for in vitro-manipulasjonsteknikker, og derfor utgjør et nødvendig trinn for utvikling av genetisk modifiserte modeller ved pronuclear injeksjon, lentiviral transduksjon eller chimera formasjonen. Dessuten lar teknikken studiet av de utviklingsmessige effekter av ulike fornærmelser oppstår under preimplantation utvikling. Bruken av kunstig befruktning en eller eksponering for unormale konsentrasjoner av ulike stoffer eller metabolitter 2 mai påvirke embryo utvikling som resulterer i implantasjon eller placentation feil og langsiktige effekter i avkommet. En pålitelig og reproduserbar embryo teknikk er avgjørende for å teste de mulige negative effekter av eksperimentell behandling på implantasjon og fosterutvikling i en konsekvent mannner.

Murine preimplantation embryoer kan overføres til en mottaker kvinnelige enten inn i oviduct via ampullae av 0,5 dager etter coitum (DPS) pseudopregnant mottakere (oviduct overføre) 3,4 eller inn i livmoren av 2,5 DPC pseudopregnant mottaker (livmor transfer) 5,6 avhengig av deres utviklingsstadiet. Embryoer ved blastocyststadiet, slik som de som brukes til å generere kimære mus ved injeksjon av embryonale eller indusert pluripotente stamceller, blir vanligvis overført ved uterin overføring. Blastocysts kan også bli overført til egglederen av en 0,5 DPC mottakeren, men det utgjør en mindre fysiologisk test for utviklingsforstyrrende, fordi fosteret gjennomgår diapause og har to dager å komme seg fra den fornærmelse før implantasjon foregår. Uterin overføring omfatter punktering av livmorveggen med en smal nål for å generere en åpning som tillater adgang til et embryo manipulasjon pipette inn i de uterine hulrommet. Aelv om denne teknikken kan gi gode resultater, (dvs. andelen overførte embryoer som utvikler seg til en valp) er overlevelsen til begrepet ofte lav og uforutsigbar 7,8.

Punktering av livmorveggen innebærer noen skadelige bivirkninger. For det første er myometrium et sterkt vaskularisert vev og dets punktering resulterer ofte i en lite blødning. Blod kan blokkere embryo pipette eller invadere livmor lumen forårsaker embryonale død og / eller implantasjon svikt. Dette er spesielt relevant når embryo uten zona overføres, som blodceller og rusk kan feste til blastomeres. For det andre, tillater åpningen utføres ikke segl etter at embryoene er blitt overført, slik at de kan strømme tilbake gjennom åpningen og bli utvist til bukhulen når et for stort volum er introdusere inn i livmoren. Den utero-tubal embryo beskrevet her dra nytte av utero-tubal veikryss å levere embryos inn i livmoren uten behov for punktering av livmorveggen, og derved unngå de uheldige konsekvenser 9.

De pseudopregnant mottaker hunner som brukes for embryo oppnås ved naturlig paring med vasectomized hanner åtte. Den banebrytende sekret som produseres av en steril mann er nødvendig for livmoren å bli mottakelig for de overførte embryoer. For å få en mottaker, er maksimalt to hunner av åtte uker til seks måneders alder plassert med en vasectomized mann i ettermiddag. Den følgende morgen, blir hunn kontrolleres for tilstedeværelsen av en vaginal copulation plugg, en klump av koagulerte proteiner fra den mannlige seminal væske. Som parring forekommer vanligvis i løpet midnatt, er dagen for vaginal plug deteksjon anses å være 0,5 DPC. Selv vasectomized hanner kan kjøpes fra noen leverandører, er den kirurgiske prosedyren beskrevet her forholdsvis enkel, og krever ikke noen ekstra instrumenter enn det som kreves for embryo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøk ble godkjent av Beltsville området Animal Care og bruk komiteer (BAACUC 11-015) i samsvar med USDA Animal Care og bruk retningslinjene.

En. Anestesi og analgesi (felles for begge kirurgiske prosedyrer)

  1. Vei musen og laste inn følgende anestesi og smertestillende i to 1 ml sprøyter med 27 G kanyler:
    1. Ketamin (0,1 mg / g: 0,01 ml / g av en 10 mg / ml oppløsning) og xylazin (0,01 mg / g: 0,005 ml / g av en 2 mg / ml løsning).
    2. Buprenorfin (0,1 ug / g: 0,01 ml av en 0,01 mg / ml løsning).
  2. Immobilisere musen ved å plukke opp nakkeskinnet så nær kjevene som mulig med tommelen og pekefingeren og holder halen mellom den lille og ringfinger.
  3. Injisere Ketamin-Xylazin blanding intraperitonealt. For å unngå punktering indre organer, hold muse meddens hode litt under nivået til hoftene (figur 1A)
  4. Injisere Buprenorfin subkutant i nakkeskinnet tak mellom tommelen og pekefingeren (Figur 1b).
  5. La mus i buret (ren og uten andre dyr) i et varmt stadium.
  6. Når bevisstløs, sjekk for fraværet av bakre foten refleks (kontrolleres av tå klype). Påfør øyesalve for å unngå tørrhet i øyet og for å sjekke om fravær av øyelokksrefleks (figur 1C).
  7. Denne protokollen gir en kirurgisk anestesi plan i minst 30 minutter, nok til å utføre de fremgangsmåter som er beskrevet nedenfor (Protokoller 2 og 3). Hvis lengre tid er nødvendig, kan en ytterligere injeksjon av ketamin + xylazin med halvparten av den dosering som er beskrevet i 1.1.1 påføres etter 30 min. En endring i pustemønsteret til en raskere og uregelmessig man angir loss av riktig anestesi planet.

2. Vasektomi

  1. Bruk en mann med en bevist parring ytelse.
  2. Sterilisere kirurgiske instrumenter, rengjøre overflater der operasjonen blir utført og tørk dem med 70% etanol.
  3. Utfør anestesi som tidligere beskrevet (Protokoll en), sjekker for tap av reflekser.
  4. Plasser musen på en varm scene, fjerne pels med elektriske klippere fra ventralområdet mellom to imaginære tverrgående linjer plasseres 0,5 cm og 2,5 cm over penis (figur 2a).
  5. Sanitize det barberte området ved sekvensiell visking med 10% povidonjodid og 70% etanol.
  6. Plasser musen i liggende stilling med halen mot kirurgen og lokket med en steril håndkle med et hull utsette det barberte området. Belyse den kirurgiske området.
  7. Utfør en 10-15 mm i lengde hud incision i den mediale linje av buken, omtrent 1 cm over penis. Hold i huden med dressing taggete pinsett og deretter kuttet med saks (figurene 2A og 2B).
  8. Utfør en 5-10 mm langsgående snitt i linea alba. Hold muskelen med microdissecting taggete tang og klippe med saks (Figur 2C).
  9. Ta tak i testiklene adipose pute av en side med micro dissekere taggete pinsett og trekk det å eksponere testikkel, sædlederen og bitestikkel. Sædleder ligger medial til testiklene og det er en klart identifiserbar gratis tube (ikke tilknyttet testis veggen som epididymis) med et blodkar som går langs en ​​side (figur 2D).
  10. Holde sædlederen med en mikro dissecting taggete tang, flamme dressing tang før de blir røde (Figur 2E cauterize sædlederen i to punkter på en gang (figur 2F). Kuttet skal fjerne en del av ca 5 mm og la to klart adskilte cauterized ender (Figur 2G).
  11. Flytt testikkel, bitestikkel og sædlederen tilbake til bukhulen.
  12. Fortsett fra trinn 9 i den andre testikkelen.
  13. Sy muskelen med ett eller to vannrette madrass masker laget med 5/0 absorberbare sutur (figur 2H).
  14. Sy huden med en eller to viklede klippere (figur 2i).
  15. Identifiser sterilisert mannlig (øre ring, finger tatovering ...), flytte den buret plassert på en varm scene og observere før den gjenoppretter fra anestesi (bevisst og opprettholde sternal recumbency). En 0,5-1 ml subkutan injeksjon av varm saltløsning forbedrer gjencovery. Registrer de mulige tilfeller oppstår under vasektomi overføring, legge antibiotika til drikkevann.
  16. Sår klemmene kan bli fjernet 10 dager etter vasektomi med et sår clipper fjerner eller et par tenner tang. Den vasectomized male vil være klar til å parre to uker etter operasjonen.
  17. Test ufruktbarhet av vasectomized mannlige ved å parre med fruktbare hunner før du bruker den til å få mottakere.

Tre. Utero-tubal Embryo Transfer

  1. Mus morulae eller blastocysts kan overføres ved denne teknikken til en pseudopregnant mottaker kvinnelig på 2,5 DPC.
  2. Forbered embryo manipulasjon glass pipette:
    1. Polere tips av glasskapillærer for å unngå skade på pipetteholder.
    2. Bløt et midtre parti av glasskapillære ved oppvarming med en fin flamme mens litt roterendekapillær med begge hender synkront. Når kapillærdel blir myk og formbar (lys rød farge), trekke det tilbake raskt fra flammen og trekk begge ender for å begrense dens ytre diameter til 130-150 mikrometer.
    3. Vent på glasset for å kjøle seg ned, og deretter klippe det av lett å oppnå den smale del med en diamant-punkt blyant, slipstein eller neglefil og trekke fra begge sider. Pausen skal være rent og vinkelrett
  3. Polsk tuppen av svært raskt flammende, etterlot seg en 100-130 mikrometer blenderåpning. Pipetter kan lagres for senere bruk.
  4. Varm embryo manipulasjon media (CZBH eller M2, se diskusjon).
  5. Sterilisere kirurgiske instrumenter, rengjøre overflater der operasjonen blir utført og tørk dem med 70% etanol.
  6. Utfør anestesi som tidligere beskrevet (protokoll 1), sjekker for tap av reflekser.
  7. Holde than mus på en varm scene, fjerne pels med elektriske klippere fra rygg området mellom knærne og distale ribbeina (Tall 3A og 3B).
  8. Sanitize det barberte området ved sekvensiell visking med 10% povidonjodid og 70% etanol.
  9. Flytt embryoene fra inkubatoren til prewarmed embryo manipulasjon media.
  10. Flytt mottakeren til en varm scene under stereomikroskop og plassere den i liggende stilling lateralt til kirurgen (med hodet ute til høyre eller venstre side av kirurg).
  11. Dekk til med et sterilt håndkle med et hull utsette det barberte området og belyse det kirurgiske området.
  12. Utfør et 1 cm tverrgående (vertikalt) snitt i huden på et sted som ligger på kranie ⅓ av linjen mellom siste ribbein og hofter og rygg ⅓ av linjen mellom ryggen og magen (Tall 3A etnd 3B). Hold huden med dressing taggete tang og klippe med saks (Figur 3C).
  13. Når huden har blitt kuttet, kan eggstokken (rød / orange) eller adipose pad rundt eggstokken (hvit) bli visualisert gjennom kroppsveggen. Utfør et 0,3-0,5 cm tverrgående (vertikalt) snitt i kroppen veggen over eggstokken eller adipose pad på et sted hvor snittet ikke kutte noen store blodkar. Hold muskelen med mikro dissecting taggete tang og klippe med saks (Figur 3D).
  14. Beveg musen for å ha hodet vendt mot kirurgen.
  15. Laste embryo manipulasjon pipette (figur 3E):
    1. Tillat CZBH medier til å stige ved kapillaritet gjennom det smale parti av manipulasjon pipette til omtrent 5 mm i den større del.
    2. Ta opp en liten luftboble (0,2-0,5 mm).
    3. Introduser embryoene (5-10) ien minimal mengde medium (2-4 mm).
    4. Ta opp en liten luftboble (0,2-0,5 mm) og en liten mengde av mediet (0,5-1 mm).
    5. La glasset pipette festet til munningen aspirator holderen eller til den hånddrevet enhet, klar for trinn 3.17.
  16. Ta tak i fettpute rundt eggstokken med mikro dissecting taggete pinsett og dra det mot musehodet å eksponere eggstokken, egglederen, og en liten del av den øvre livmoren ut av bukhulen (Tall 3F og 3G).
  17. Holder aspiratoren munnstykke i munnen, klar til å brukes, ta tak i adipose pad med mikro dissecting taggete pinsett til å flytte oviduct og utsett utero-tubal veikryss (dvs. der oviduct møter livmoren).
  18. Holde utero-tubal krysset tilgjengelig, ta små buede mikro disseksjon tang med venstre hånd (hvis høyrehendt) og plassere dem like nedenfordet utero-tubal krysset gripe oviduct om 2 mm over den delen.
  19. Holde utero-tubal krysset med de små buede mikro disseksjon tang, punktere oviduct delen nær pinsett med en 27 G kanyle (Figur 3H).
  20. Sett embryo manipulasjon pipetten inn i åpningen utført med nål ogvidere til livmoren gjennom utero-tubal krysset (figur 3I og 3J). Når pipetten har passert utero-tubal krysset (Figur 3K) det glir lett. Ikke fremgang veldig langt inn i livmoren for å forhindre livmor skade (ikke mer enn 3 mm) og pipette blokkering av rusk.
  21. Slipp embryoene inn i livmoren ved å forsiktig blåse (Figur 3L). Begge luftbobler må passere gjennom livmoren. Noen av media over den første boblenkan også bli sluppet inn i livmoren, men unngå å introdusere mer luft, som det kan hindre implantasjon.
  22. Fjern pipetten like etter embryoer har blitt sluppet inn i livmoren.
  23. Flytt oviduct og eggstokk tilbake til bukhulen ved å gripe adipose pad.
  24. Sutur muskelen med en horisontal madrass sting med 5/0 absorberbare sutur (Figur 3M).
  25. Sutur huden med et sår Clipper (Figur 3N).
  26. Fortsett fra trinn 10 på den annen side hvis det er nødvendig.
  27. Identifisere mottaker (øre ring, finger tatovering ...), flytte den til buret sitt (plassert på en varm scene) og observere før den gjenoppretter fra anestesi (bevisst og opprettholde sternal recumbency).
  28. Kommentere mulige tilfeller oppstår under embryo og legge antibiotika til drikkevann. En 0,5-1 ml subkutan injeksjon av varm saline løsningen forbedrer utvinning.
  29. Sår klipp kan fjernes 10 dager etter at embryo med et sår clipper fjerner eller to par av tang (Figur 3o). Mottakeren kan veies på den dagen for å vurdere graviditet og anslå antall unger. Gi lunt materialet til mottakeren 15 dager etter embryo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Utero-tubal embryo gir et middel for å overføre embryo i livmoren unngå noen av komplikasjoner knyttet til livmor embryo 2,9,10. I tabell 1 viser vi noen representativt resultat vi har oppnådd overføre CD1 blastocysts utsatt for ulike typer manipulasjoner til CD1 mottakere følge protokollen beskrevet. Overlevelsen til sikt (% av embryoer som resulterer i en pup) eller overlevelsen til E15 (i tilfelle av lentivirus eksponert) er lik for embryoer bare dyrket in vitro fra zygote trinn (IVC), embryoer som utsettes for iPSC injeksjon for å generere kimære pups og embryoer som hadde sine zona fjernet og ble eksponert for lentivirus for syv timer før embryo. Derfor er utero-tubal embryo en pålitelig teknikk for å overføre embryoer spesielt komplisert slik som de mangler zona pellucida og ruges med lentivirus.


Figur 1. Injeksjon av bedøvelse og smertestillende. A) intraperitoneal injeksjon av Ketamin-Xylazin. B) Subkutan injeksjon av buprenorfin. C) Bruk av øyesalve.

Fig. 2
Figur 2. . Vasektomi protokoll A) Snittet punkt (avbildet med en rød "X") legges ut ca 1 cm over penis, fjerne pels 0,5 til 2,5 cm over penis (svarte linjer) B) Skin snitt C) Muscle innsnitt... D) Sædleder (svart pil) og tester (*). E) Flaming av pinsett for kauterisering. F) Cauterization av sædlederen i to punkter på en gang. G) Sædleder tydelig delt i to cauterized ender. H) Muscle sutur. jeg) Skin sutur. Klikk her å se større bilde.

Figur 3
Figur 3. Utero-tubal embryo protokoll A, B) Dorsal og lateral utsikt over snittet punktet (avbildet med en rød "X");. Sorte linjer mellom det siste ribbeinet og hofter (A, B) og mellom ryggen og magen (B) tjene som en guide. C) Skin innsnitt. E) Embryo manipulasjon glass pipette lastet med fem blastocysts klar til å bli overført. F, G) Representative eggstokkene med (F) eller uten (G) corpora lutea, angitt med svarte piler. HK) For representasjons , en simulering av utero-tubal embryo ble utført lasting et glass manipulasjon pipette med 0,4% trypanblått løsning. H) Punktering av egglederen (svart pil) nær livmor (*). jeg) Innføring av embryo manipulasjon pipette inn åpningen utført tidligere. J) Embryoet manipulasjon pipette avanserer gjennom utero-tubal veikryss. K) Et volum av trypanblått løsning tilsvarende det som slippes i et embryo er utvist i livmor lumen (svart pil). L) Til teste effektiv nedleggelse produsert av utero-tubal veikryss, all deninnhold av manipulasjon pipette ble sluppet inn i livmoren, utero-tubal veikryss (pil) hindrer tilbake flyten av trypanblått løsning utgitt inn i livmoren (*) M) Muscle sutur N) Skin sutur O) Clip fjerning.... P) 15 dager etter at embryo gir lunt materiale til mottakeren. Q) Chimerisk kullet innhentet etter denne teknikken. Klikk her for å se større bilde.

Behandling Antall overføringer Overførte embryoer Pups levert Survival til term (%)
IVC 11 110 82 74.5
iPSC injeksjon 3 50 35 70,0
Lentivirus 6 60 44 73.3

Tabell 1. Representative resultater oppnådd etter å ha overført tre forskjellige grupper av manipulerte embryoer følgende utero-tubal embryo. 1) embryo dyrkes in vitro (IVC) fra zygote scenen til blastocyst stadiet, 2) In vivo produsert blastocysts injisert med 10 mouse iPSC å generere kimære mus, 3) In vivo produserte blastocyster som hadde sine zona fjernet og inkubert i 7 timer med en lentivirus uttrykker GFP. Dataene representerer antall avkom som er født av antallet overførte embryoer med unntak av lentivirus utsatt gruppe, hvor de representerer antall levedyktige fostre 10 dager etter embryo, som drektighet ikke var mulig å komme videre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vasektomi er en relativt rett frem kirurgisk teknikk som ikke involverer store vanskeligheter. Når desinfiserende med povidonjodid og etanol sørge for at siste vask (med etanol) fjerner povidonjodid, da det kan irritere bukhinnen. Tilgangen til vas deferens kan også oppnås ved pungen eller utfører en tverrgående snitt i buken 8.. Scrotal snitt har blitt anbefalt å avkuttingssk jær abdominal snitt på grunn av den relativt mindre snitt trengte og litt bedre postoperativ atferd 11. Men vi foretrekker den abdominal snitt over scrotal fordi det gir en enklere og mer oversiktlig tilgang til vasa deferentia fra begge testiklene, hindre uerfarne kirurger fra cauterizing to ganger de samme sædlederen og forlate en funksjonell sædlederen. Mellom begge mage teknikker favoriserer at det langsgående snitt i linea alba over transversal fordi den ikke kutte noen abdominal muskel fiber, unngå utvikling av mage brokk. Imidlertid kan både vasektomi og utero-tubal embryo transfer protokoller være tilpasset utstyret tilgjengelig, eller til de personlige liker av forskeren. For eksempel kan en glassperle sterilisator brukes til å varme tang som benyttes for å etse vas deferens. I alle fall er det viktig å følge en aseptisk teknikk, for å gi riktig anestesi og analgesi for å maksimere dyrevelferd, og for å være i samsvar med lokale forskrifter.

Et annet aspekt utsatt for modifikasjoner er anestesi-protokollen. Hvis inhalasjonsanestesi (isofluran) er tilgjengelig, oppfordrer vi dets bruk i stedet for parenteral (injiserbare) anestesi, da det gir en svært stabil anestesi flyet og rask gjenoppretting. Imidlertid er det viktig å fastslå at inhalasjonsanestesi fremdeles krever bruk av et analgetikum for intra-og post-opera smerte, som bør være administered før operasjonen som premedikasjon. Buprenorfin er et opioid som gir langsiktig analgesi i mus 12. Parenterale anestesi gir også en god bedøvelse plan for korte prosedyrer som vasektomi og embryo. Ketamin-Xylazin er en svært pålitelig kombinasjon for mus kirurgi 13, og vi har aldri observert noen anestesi komplikasjoner ved denne kombinasjonen sammen med premedisinering med buprenorfin. Andre parenterale kombinasjoner kan benyttes 12, men vi fraråder bruken av det narkotisk blanding avertin (tribromoethanol), som bare en enkelt dose kan administrere og flere artikler har rapportert om forskjellige komplikasjoner forbundet med dets bruk som lokal irritasjon, dårlig analgesi, ileus , fibrøse sammenvoksninger i bukhulen, nekrose av subperitoneal muskelfibre og abdominal organer overflate, og selv dødelighet 14-18.

Embryo krever god styring av både embryoer end mottakeren. Som en generell regel for pattedyr embryo, kan det utviklingsstadiet av embryoene være mer avansert enn den pseudopregnancy stadium av mottakeren, men ikke motsatt. Med andre ord, kan embryoene vente på moren, men moren kan ikke vente på embryoene, så denne teknikken kan brukes til å overføre morulae eller blastocysts, men ikke tidligere stadier. Utero-tubal embryo kan utføres to dager etter påvisning av vaginal plug fra formiddagen (2,5 DPC) til kveld-natt (3 DPC), når utero-tubal krysset er åpen for å tillate naturlig transitt av embryoer fra oviduct til livmor horn. Tatt i betraktning at de overførte embryoer kanskje allerede har lidd av noen form for manipulasjon, bør embryo håndtering minimere ytterligere skade. Kan finnes en utmerket guide for mus embryo manipulasjon i Nagy et al. 8 De to mest brukte muse embryo manipulasjon media, som holder en fysiologisk pH i vanlig påmosphere, er CZBH 19 og M2 20. Selv in vivo produsert mus embryoer kan overvinne eksponering for kald temperatur eller unormal pH i lange perioder 21, bør manipulasjon media bli forvarmet. Hvis media blir forvarmet i en kultur fatet, unngå oppvarming i lange perioder (mer enn 40 min), som osmolariteten av media vil øke på grunn av vann fordampning og som kan være mer skadelig enn kald manipulasjon media. Likeledes bør den tid embryoene brukt inne i manipulasjon pipette bli minimalisert på grunn av det lille volumet til stede i pipetten.

Bruken av en skikkelig embryo manipulasjon pipette er avgjørende for suksessen til protokollen. Manipulerings pipetter kan være laget av glasskapillærer med en tynn glassvegg. Pasteur pipetter, ofte brukt for å håndtere store dyr embryo, kan også benyttes, men på grunn av sin kortere avstand fra håndtaket til spissen, manipulasjon pipetter laget av glass kapillærer er mer comfortable å manøvrere. Eksponering for flammen og hastighet for å trekke bestemme veggtykkelsen og den indre diameter av pipetten. Selv manipulasjon pipetter kan lett gjøres for hånd etter litt øvelse, avtrekker-og mikro-smie kan også anvendes. Det er viktig å investere tid i å produsere flere optimale manipulasjon pipetter. Manipulering pipette blenderåpning bør være bredere enn et embryo til å tillate en jevn flyt, men liten nok til å kunne trenge inn og komme seg gjennom utero-tubal veikryss. Hvis zona pellucida er fjernet før overføringen, blastocysts vanligvis ekspandere til en større diameter. I dette tilfellet, er det tilrådelig å gjøre bredere pipetter med en større blenderåpning (130-180 mm) for å unngå skade på trophectoderm celler. Tips polish er viktig å unngå å skade oviduct, livmorveggen og embryo - spesielt hvis zona har blitt fjernet, og for å unngå pipettespissen fra å bli blokkert av rusk. Men etter polering, bør åpningen not være for liten i forhold til den indre diameter av pipetten, som en skarp reduksjon i diameter vil forårsake brå endringer i strømningshastighet. Denne aspirator munnstykket gir en mer presis strømningskontroll, så vel som en mer komfortabel håndstilling i forhold til hånd-styrte enheter. Ikke desto mindre kan en håndstyrt enhet brukes hvis nødvendig (for eksempel ved manipulering av lentivirus-behandlede embryoer). For en optimal strømning og for å unngå overføring av mineralolje, er det også tilrådelig å bruke en ny pipette for embryo-overføring i stedet for den som brukes til å bevege embryoene fra kulturmediet til manipulering media. Til slutt, mens introdusere pipetten gjennom egglederen, kapillær skal håndteres direkte, altså. gripe glasset og ikke plasthåndtaket i aspiratoren, for å oppnå et fast grep. Forstørrelsen som brukes for embryo-overføring er en personlig forhold som er avhengig av synsskarphet av kirurgen. Vi foretrekker å bruke en svak forstørrelse å ha et bredt synsfelt,så vi bruker en 10X endelig forstørrelse (10X okular og 1X objektiv).

Mottakerne bør være minst 8 uker gammel og veier mellom 27-40 g. Outbreed mus som CD1 eller sveitsiske Webster vise en god mors oppførsel og er gode mottakere. Det er lurt å sette opp avl for å få ekstra mottakere, som de som ikke brukes vil gjenopprette normal sykling aktivitet i to uker. Til tross for at paret kan noen kvinner ikke har corpora lutea (figur 3G), og derfor ikke vil være mottakelige for de overførte embryoer. Av denne grunn bør eggstokkene kontrolleres for tilstedeværelsen av corpora lutea, som på 2,5 kan DPC være tydelig identifisert som lyse rødt strukturer i eggstokken (Figur 3F). I løpet av operasjonen er det viktig å minimalisere kontakten med skjede ved å gripe ovarial adipose puten i stedet; dreven manipulering av eggstokk-og livmor kan resultere i luteolysis. Innføringen av Manipulation pipette inn i egglederen er den mest kompliserte delen av protokollen. I enkelte mottakere, er oviduct veldig vridd og det er ikke en 2 mm rett strekning fra krysset med livmoren. I så fall sørge egglederen og utfører punktering i det første bend. Som beskrevet ovenfor, en fin manipulasjon pipette virkelig gjør en forskjell. Når pipetten har passert gjennom utero-tubal veikryss, glir den lett. Hvis den ikke gjør det, kan pipetten har avveket fra egglederen og ikke nådd livmor lumen. Når du er inne i livmoren, hvis mediene ikke flyte, flytte pipette litt ut eller inn og prøv på nytt. Hvis det fortsatt ikke flyter, er pipetten tett, ta det ut fra livmoren, slipper innholdet i fatet med manipulasjon media og legg den samme eller en annen pipette. Levering skjer vanligvis 17 dager etter embryo. For å hindre kannibalisme, gi nestling materialet to dager i forveien og ikke endre buret i løpet av de første dagene etter fødselen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av midler fra Institutt for husdyr-og Avian Sciences til BT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine VEDCO Ketaved ANADA 200-257 To be ordered by a licensed veterinarian.
Xylazine Lloyd Laboratories Anased NADA #139-236 To be ordered by a licensed veterinarian.
Buprenorphine Generic NDC 400-42-010-01 To be ordered by a licensed veterinarian.
Eye ointment Novartis Genteal
Antibiotic Pfizer Clavamox NADA #55-101. Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.
Dressing serrated forceps ROBOZ RS-8120 Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.
Microdissecting serrated forceps ROBOZ RS-5137 These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred.
Slight curved micro dissection forceps ROBOZ RS-5136 This model is particularly useful to hold the oviduct.
Scissors ROBOZ RS-5880 Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
27 G needles Beckton-Dickinson 305136 Smaller needles (30 G) can be also used. 25 G may be a bit too big.
Clip applier MiKRon 42763
9 mm Clips MiKRon 427631
Clip remover MiKRon 7637 Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.
Suture needle holder ROBOZ RS-7820
Suture Dowist Gell 5-0 Dexon S 7204-21 Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.
Glass capillaries VWR 100 ul calibrated pipettes 53432-921 It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 µm filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in Nagy et al.8
Burner KISAG AG Typ 2002 Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.
Stereomicroscope Leica MZFLIII This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot. 
Fiber optics ilumination Dolan Jenner Fiber lite To iluminate the surgical area. There are different systems available.
Warm stages American scope http://store.amscope.com/tcs-100.html These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.
Culture dishes for embryo manipulation Falcon 353001 351008 may be also used; they made narrower drops.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fernandez-Gonzalez, R., et al. Long-term effect of in vitro culture of mouse embryos with serum on mRNA expression of imprinting genes, development, and behavior. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 101, 5880-5885 (2004).
  2. Bermejo-Alvarez, P., Roberts, R. M., Rosenfeld, C. S. Effect of glucose concentration during in vitro culture of mouse embryos on development to blastocyst, success of embryo transfer, and litter sex ratio. 79, 329-336 (2012).
  3. Tarkowski, A. K. Experiments on the development of isolated blastomers of mouse eggs. Nature. 184, 1286-1287 (1959).
  4. Whittingham, D. G. Fertilization of mouse eggs in vitro. Nature. 220, 592-593 (1968).
  5. McLaren, A., Biggers, J. D. Successful development and birth of mice cultivated in vitro as early as early embryos. Nature. 182, 877-878 (1958).
  6. McLaren, A., Michie, D. Studies on the transfer of fertilized mouse eggs to uterine foster-mothers. I. Factors affecting the implantation and survival of native and transferred eggs. J. Exp. Biol. 33, 394-416 (1956).
  7. Goto, Y., et al. The fate of embryos transferred into the uterus. J. Assist. Reprod. Gen. 10, 197-201 (1993).
  8. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2003).
  9. Chin, H. J., Wang, C. K. Utero-tubal transfer of mouse embryos. Genesis. 30, 77-81 (2001).
  10. Ramirez, M. A., Fernandez-Gonzalez, R., Perez-Crespo, M., Pericuesta, E., Gutierrez-Adan, A. Effect of stem cell activation, culture media of manipulated embryos, and site of embryo transfer in the production of F0 embryonic stem cell mice. Biol. Reprod. 80, 1216-1222 (2009).
  11. Miller, A. M., Wright-Williams, S. L., Flecknell, P. A., Roughan, J. V. A comparison of abdominal and scrotal approach methods of vasectomy and the influence of analgesic treatment in laboratory mice. Lab. Anim. 46, 304-310 (2012).
  12. Flecknell, P. A. Laboratory Animal Anaesthesia. Academic Press. Oxford, UK. (2009).
  13. Erhardt, W., Hebestedt, A., Aschenbrenner, G., Pichotka, B., Blumel, G. A comparative study with various anesthetics in mice (pentobarbitone ketamine-xylazine,carfentanyl-etomidate). Res. Exp. Med. 184, 159-169 (1984).
  14. Tarin, D., Sturdee, A. Surgical anaesthesia of mice: evaluation of tribromo-ethanol, ether, halothane and methoxyflurane and development of a reliable technique. Lab. Anim. 6, 79-84 (1972).
  15. Zeller, W., Meier, G., Burki, K., Panoussis, B. Adverse effects of tribromoethanol as used in the production of transgenic mice. Lab. Anim. 32, 407-413 (1998).
  16. Lieggi, C. C., et al. Efficacy and safety of stored and newly prepared tribromoethanol in ICR mice. Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 44, 17-22 (2005).
  17. Lieggi, C. C., et al. An evaluation of preparation methods and storage conditions of tribromoethanol. Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 44, 11-16 (2005).
  18. Meyer, R. E., Fish, R. E. A review of tribromoethanol anesthesia for production of genetically engineered mice and rats. Lab. Anim. 34, 47-52 (2005).
  19. Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biol. Reprod. 42, 432-440 (1990).
  20. Quinn, P., Barros, C., Whittingham, D. G. Preservation of hamster oocytes to assay the fertilizing capacity of human spermatozoa. J. Reprod. Fertil. 66, 161-168 (1982).
  21. Dios Hourcade, de, Perez-Crespo, J., Serrano, M., Gutierrez-Adan, A., A,, Pintado, B. In vitro and in vivo development of mice morulae after storage in non-frozen conditions. Reprod. Biol. Endocrinol. 10, 62 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics