Utero-Tubenembryotransfer und Vasektomie im Maus-Modell

Biology

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Summary

Utero-Eileiter-Embryo-Transfer verwendet die utero-Eileiter-Kreuzung als Barriere, um den Embryo Abfluss, die bei der Durchführung von Uterus Übertragung auftreten können, zu verhindern. Vasektomierten Männchen sind erforderlich, um pseudo-Empfänger für Embryotransfer erhalten. Beide Techniken werden diskutiert.

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Bermejo-Alvarez, P., Park, K. E., Telugu, B. P. Utero-tubal Embryo Transfer and Vasectomy in the Mouse Model. J. Vis. Exp. (84), e51214, doi:10.3791/51214 (2014).

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Abstract

Die Übertragung der Präimplantationsembryonen zu einem Surrogat Frau ist ein erforderlicher Schritt für die Herstellung von genetisch veränderten Mäusen, um zu studieren oder die Auswirkungen von epigenetischen Veränderungen während Präimplantations Entwicklung bei zukünftigen Entwicklung des Fötus und Erwachsene Gesundheit entstanden ist. Die Verwendung einer wirksamen und kohärenten Embryo-Transfer-Technik ist entscheidend, um die Erzeugung von gentechnisch veränderten Tieren zu verbessern und die Wirkung der verschiedenen Behandlungen auf Implantationsraten und Überlebenszeit zu bestimmen. Embryos im Blastozysten-Stadium in der Regel durch Uterus Übertragung übertragen, Ausführen einer Punktion in der Uteruswand, die Embryomanipulation Pipette einzuführen. Die in der Gebärmutter durchgeführt Öffnung nicht schließen, nachdem die Pipette wurde zurückgezogen, und die Embryonen können Abfluss in die Bauchhöhle durch den Überdruck der Gebärmutter. Die Punktion kann auch produzieren eine Blutung, die Implantation beeinträchtigt, blockiert die Transferpipette und können Embryo d beeinflussenntwicklung, vor allem, wenn Embryonen ohne zona übertragen werden. Folglich ist diese Technik oft zu sehr variabel und insgesamt niedrigen Embryo-Überlebensraten. Die Vermeidung dieser negativen Auswirkungen, Eileiter-utero-Embryo-Transfer nutzen die utero-Eileiter-Kreuzung als eine natürliche Barriere, die Embryo Abfluss behindert und vermeiden Sie die Punktion der Gebärmutterwand. Vasektomierten Männer werden für den Erhalt schein Empfänger erforderlich. Eine Technik zur Vasektomie durchführen wird als Ergänzung zu den utero-Eileiter-Embryo-Transfer beschrieben.

Introduction

Embryotransfer ist wahrscheinlich der häufigste chirurgische Eingriff im Mausmodell durchgeführt. Diese Technik ist wesentlich, Nachkommen von Embryonen in vitro Manipulation Techniken unterworfen wurde, und daher stellt ein notwendiger Schritt für die Entwicklung von genetisch modifizierten Modelle von Vorkern-Injektion lentiviralen Transduktion oder Chimärenbildung. Außerdem ermöglicht die Technik die Untersuchung der Auswirkungen auf die Entwicklung von diversen Beleidigungen während der Präimplantations-Entwicklung auftreten. Die Verwendung von künstlichen Reproduktionstechniken 1 oder der Einwirkung von abnormalen Konzentrationen verschiedener Stoffe oder Stoffwechsel 2. Mai Embryonalentwicklung was Implantation oder Plazenta Ausfälle und langfristigen Auswirkungen bei den Nachkommen beeinflussen. Eine zuverlässige und reproduzierbare Embryo-Transfer-Technik ist entscheidend, um die möglichen negativen Auswirkungen der experimentellen Behandlung bei der Implantation und der fetalen Entwicklung in einem konsistenten Menschen testenner.

Murine Präimplantationsembryonen auf einen weiblichen Empfänger entweder in den Eileiter über den Ampullen von 0,5 Tage nach coitum (DPC) pseudo-Empfänger (Eileiter-Transfer) oder 3,4 in die Gebärmutter von 2,5 dpc schein Empfänger (Gebärmutter-Transfer) 5,6 übertragen werden je nach Entwicklungsstadium. Embryonen im Blastozystenstadium, wie sie verwendet werden, um chimäre Mäuse zu erzeugen, durch Injektion von embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen, sind in der Regel durch die Uterus Übertragung übertragen. Blastozysten können auch in den Eileiter einer 0,5 dpc Empfänger übertragen werden, aber es stellt eine weniger physiologischen Test für Entwicklungs Disruptoren, weil der Embryo durchläuft Diapause und hat 2 Tage, um von der Beleidigung zu erholen, bevor die Implantation stattfindet. Gebärmutter Übertragung beinhaltet Stechen der Uteruswand mit einem schmalen Nadel, um eine Öffnung, die den Zugang eines Embryo-Pipette in das Uteruslumen ermöglicht erzeugen. Abwohl diese Technik gute Ergebnisse (dh der Anteil der übertragenen Embryonen, die zu einem Welpen entwickeln) ist das Überleben zu Begriff oft niedrig und unberechenbar 7,8.

Die Punktion der Uteruswand bringt einige nachteilige Nebenwirkungen. Erstens ist Myometrium ein stark vaskularisierten Gewebes und seine Punktion führt oft zu einer geringen Blutung. Blut kann die Embryotransfer Pipette blockieren oder dringen in die Uteruslumen verursacht embryonalen Tod und / oder Implantation Versagen. Dies ist besonders relevant, wenn Embryonen ohne zona übertragen werden, da die Blutzellen und Ablagerungen können zu den Blastomeren befestigen. Zweitens ist die Öffnung nicht verschließen durchgeführt, nachdem die Embryonen übertragen wurden, so dass sie durch die Öffnung fließen kann und zurück in die Bauchhöhle ausgestoßen wird, wenn ein zu großes Volumen hat, in den Uterus eingeführt worden ist. Die beschriebene utero-Eileiter-Embryo-Transfer hier die Vorteile der utero-Eileiter-Kreuzung, um die embr liefernYos in den Uterus ohne die Notwendigkeit der Punktion der Uteruswand und damit die Vermeidung ihrer nachteiligen Folgen 9.

Die pseudo-Empfänger für Frauen Embryotransfer verwendet werden, durch natürliche Paarung mit Männchen vasektomierten 8 erhalten. Die Samensekret durch eine sterile Männchen produziert werden für die Gebärmutter erforderlich empfänglich für die Embryonen übertragen zu werden. Um einen Empfänger zu erhalten, werden maximal 2 Weibchen von 8 Wochen bis 6 Monaten mit einem männlichen vasektomierten in den Nachmittag gelegt. Am nächsten Morgen sind Frauen für das Vorhandensein einer vaginalen Kopulation Stecker, einem Klumpen geronnenen Proteinen aus der männlichen Samenflüssigkeit überprüft. Als während der Mitternachts Paarung erfolgt in der Regel, wird der Tag der vaginalen Plug-Erkennung als 0,5 dpc sein. Obwohl vasektomierten Männer können von einigen Händlern erworben werden kann, ist die hier beschriebene chirurgische Verfahren relativ einfach und erfordert keine zusätzliche Instrumente als für Embryotransfer erforderlich.

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Protocol

Alle Tierversuche wurden von der Beltsville Bereich Animal Care und Verwenden Gremien (BAACUC 11-015) in Übereinstimmung mit USDA Animal Care und Verwenden Richtlinien genehmigt.

1. Anästhesie und Analgesie (gemeinsam für beide Chirurgische Verfahren)

  1. Wiegen Sie die Maus, und laden Sie die folgenden Anästhetika und analgetische in zwei 1 ml Spritzen mit 27 G Nadeln:
    1. Ketamin (0,1 mg / g: 0,01 ml / g einer 10 mg / ml) und Xylazin (0,01 mg / g: 0,005 ml / g eines 2 mg / ml Lösung).
    2. Buprenorphin (0,1 ug / g: 0,01 ml einer 0,01 mg / ml Lösung).
  2. Immobilisieren, die Maus, indem Sie den Genick seines Halses so nah an den Backen wie möglich mit dem Daumen und Zeigefinger und hielt den Schwanz zwischen die kleinen und Ringfinger.
  3. Inject Ketamin-Xylazin intraperitoneal Mischung. Um zu vermeiden, Punktion inneren Organe, halten Sie die Maus mitden Kopf leicht unter dem Niveau der Hüften (1A)
  4. Inject Buprenorphin subkutan in das Genick des Hals halten zwischen Daumen und Zeigefinger (Abbildung 1B).
  5. Lassen Sie die Maus in den Käfig (sauber und ohne jedes andere Tier) an einem warmen Bühne.
  6. Sobald bewusstlos, überprüfen Sie für das Fehlen der hinteren Fussreflex (von Zehe Prise überprüft). Bewerben Augensalbe zur Trockenheit des Auges zu vermeiden und um das Fehlen von Augenlidreflexe (Abbildung 1C) zu überprüfen.
  7. Dieses Protokoll stellt eine chirurgische Anästhesieebene für mindestens 30 Minuten, ausreichend, um die unten beschriebenen Verfahren durchzuführen (der Protokolle 2 und 3). Wenn längere Zeiten benötigt werden, kann eine zusätzliche Injektion von Ketamin + Xylazin mit der Hälfte der in 1.1.1 beschriebenen Dosierungs nach 30 Minuten angewendet werden. Eine Änderung des Atmungsmusters zu einem schnelleren und einem unregelmäßigen zeigt die loss der richtigen Narkose-Ebene.

2. Vasektomie

  1. Verwenden Sie einen Mann mit einem bewährten Paarungsverhalten.
  2. Sterilisieren chirurgische Instrumente, reinigen Sie die Oberflächen, auf denen Operationen durchgeführt werden, und wischen Sie sie mit 70% Ethanol.
  3. Führen Anästhesie wie vorher beschrieben (Protokoll 1), die Überprüfung für den Verlust der Reflexe.
  4. Legen Sie die Maus auf eine warme Phase, entfernen Fell mit elektrischen Haarschneider aus dem ventralen Bereich zwischen zwei imaginären Querlinien platziert 0,5 cm und 2,5 cm über dem Penis (2A).
  5. Desinfizieren die rasierte Fläche von sequentiellen Wischen mit 10% Povidon-Jod und 70% Ethanol.
  6. Platzieren Sie die Maus in Rückenlage mit dem Schwanz gegen den Chirurgen und die Abdeckung mit einem sterilen Tuch mit einem Loch Aussetzen der rasierten Bereich. Beleuchten den OP-Bereich.
  7. Führen Sie eine 10-15 mm Längs Haut incision in der Mittellinie des Bauches, etwa 1 cm über dem Penis. Halten Sie die Haut mit Dressing gezahnten Pinzette und dann mit einer Schere (2A und 2B).
  8. Führen Sie eine 5-10 mm Längsschnitt in der Linea alba. Halten Sie den Muskel mit microdissecting gezackten Zange und schnitt mit der Schere (Abbildung 2C).
  9. Besorgen Sie sich die Hodenfettpolster von einer Seite mit Mikro Sezieren gezackten Zange und ziehen Sie es auf Hoden freizulegen, Samenleiter und Nebenhoden. Samenleiter wird medial der Hoden entfernt und es ist ein deutlich unterscheidbar kostenlos Rohr (nicht an die Wand wie die Hoden befestigt Nebenhoden) mit einem Blutgefäß entlang einer Seite (Abbildung 2D) läuft.
  10. Halten Sie die Samenleiter mit einer Mikrozange gezahnt Seziersaal, Flammkornzange, bis sie rot (2E ätzen die Samenleiter (2F). Der Schnitt sollte ein Teil von etwa 5 mm zu entfernen und zwei klar voneinander getrennt cauterized Enden (2G).
  11. Bewegen Sie die Hoden, Nebenhoden und Samenleiter zurück in die Bauchhöhle.
  12. Fahren Sie mit Schritt 9 in der anderen Hoden.
  13. Naht der Muskel mit einer oder zwei horizontalen Matratze Stiche mit 5/0 resorbierbares Nahtmaterial (2H) gefertigt.
  14. Naht der Haut mit einem oder zwei Wunde Knipser (2I).
  15. Identifizieren Sie die vasektomierten (Ohrring, Finger Tattoo ...), verschieben Sie den Käfig an einem warmen Bühne platziert und beobachten, bis er aus der Narkose erholt sich (bewusst und pflegen Brustlage). Ein 0,5-1 ml subkutane Injektion von warmen Kochsalzlösung verbessert die WiederErholung. Notieren Sie die möglichen Vorfälle während Vasektomie Übertragung auftreten, fügen Antibiotikum, das Trinkwasser.
  16. Wundclips können 10 Tage nach der Vasektomie mit einer Wunde Klipper-Entferner oder ein Paar Zähne Pinzette entfernt werden. Die vasektomierten männlichen bereit zu 2 Wochen nach der Operation paaren.
  17. Testen Sie die Unfruchtbarkeit der männlichen vasektomierten durch Paarung mit fruchtbaren Weibchen, bevor Sie es an die Empfänger zu erhalten.

3. Utero-Eileiter-Embryo Transfer

  1. Maus Morulae oder Blastozysten können durch diese Technik zu einer pseudo weiblichen Empfänger bei 2,5 dpc übertragen werden.
  2. Bereiten Embryo Manipulation Glaspipette:
    1. Reinigen Sie die Spitzen der Glaskapillaren, um eine Beschädigung der Pipettenhalter.
    2. Erweichen Sie einen Mittelteil der Glaskapillare durch Erhitzen mit einem feinen Flamme, während leichtes Drehendie Kapillare mit beiden Händen synchron. Sobald die Kapillare Abschnitt wird weich und formbar (hellrot), zurückziehen es schnell von der Flamme und ziehen beide Enden an seinem Außendurchmesser auf 130-150 um einzugrenzen.
    3. Warten Sie, bis das Glas abgekühlt ist, und dann schneiden Sie es durch leichtes erzielte den schmalen Teil mit einer Diamant-Punkt-Bleistift, Schleifstein oder Nagelfeile und Ziehen von beiden Seiten. Die Pause sollte sauber und senkrecht sein
  3. Polieren Sie die Spitze durch sehr schnell flammenden, so dass eine Öffnung um 100-130. Pipetten für die spätere Verwendung gespeichert werden.
  4. Warm Embryo Manipulation Medien (CZBH oder M2, siehe Diskussion).
  5. Sterilisieren chirurgische Instrumente, reinigen Sie die Oberflächen, auf denen Operationen durchgeführt werden, und wischen Sie sie mit 70% Ethanol.
  6. Führen Anästhesie wie vorher beschrieben (Protokoll 1), die Überprüfung für den Verlust der Reflexe.
  7. Keeping ter Maus auf eine warme Phase, Pelz entfernen mit elektrischen Haarschneider aus dem dorsalen Bereich zwischen den Knien und den distalen Rippen (3A und 3B).
  8. Desinfizieren die rasierte Fläche von sequentiellen Wischen mit 10% Povidon-Jod und 70% Ethanol.
  9. Bewegen Sie die Embryonen aus dem Inkubator auf die vorgewärmten Embryo Manipulation Medien.
  10. Bewegen Sie den Empfänger an einen warmen Bühne unter dem Stereomikroskop und legen Sie sie in Bauchlage seitlich an den Chirurgen (mit seinem Kopf auf der Suche nach der rechten oder linken Seite des Chirurgen).
  11. Decken Sie den Bereich mit einem sterilen Tuch mit einem Loch Aussetzen der rasierten Fläche und beleuchten den OP-Bereich.
  12. Führen Sie eine 1 cm quer (vertikal) Schnitt in der Haut an einer Stelle, an der Schädel ⅓ der Linie zwischen der letzten Rippe und der Hüfte und der dorsalen ⅓ der Linie zwischen der Rückseite und der Bauch (Fig. 3A eine befindetnd 3B). Halten Sie die Haut mit Dressing gezackten Zange und schnitt mit der Schere (3C).
  13. Sobald die Haut geschnitten worden ist, kann Ovar (rot / orange) oder die Fettpolster um den Eierstock (weiß) durch die Körperwand visualisiert werden. Führen Sie eine 0,3-0,5 cm quer (vertikal) Einschnitt in der Körperwand über den Eierstock-oder Fettpolster an einer Stelle, wo der Schnitt keine großen Blutgefäß geschnitten. Halten Sie die Muskeln mit Mikrosektions gezackt Pinzette und schneiden mit der Schere (Abbildung 3D).
  14. Bewegen Sie die Maus zu haben, den Kopf zugewandten Chirurgen.
  15. Laden Sie die Embryo-Pipette (3E):
    1. Ermöglichen CZBH Medien durch Kapillarwirkung durch den engen Abschnitt der Manipulation Pipette aufsteigen, bis etwa 5 mm des breiteren Teils.
    2. Nehmen Sie eine kleine Luftblase (0,2-0,5 mm).
    3. Führen Sie die Embryonen (5-10) ineine minimale Menge von Medien (2-4 mm).
    4. Nehmen Sie eine weitere kleine Luftblase (0,2-0,5 mm) und eine kleine Menge von Medien (0,5-1 mm).
    5. Lassen Sie die Glaspipette bis zur Mündung Sauger Halter oder zum Handgerät, bereit für Schritt 3.17 angebracht.
  16. Besorgen Sie sich die Fettpolster rund um den Eierstock mit Mikrosektions gezackte Zange und ziehen Sie sie auf den Maus-Kopf, um die Eierstöcke, Eileiter und einen kleinen Teil der oberen Gebärmutter aus der Bauchhöhle (3F und 3G) aus.
  17. Halten Sie die Saugvorrichtung Mundstück in den Mund, bereit zu werden, greifen die Fettpolster mit Mikrosektions gezackte Zange, um die Eileiter zu bewegen und setzen die utero-Eileiter-Kreuzung (dh wo die Eileiter erfüllt die Gebärmutter).
  18. Halten Sie die utero-Eileiter-Kreuzung zugänglich, nehmen Sie leichte gebogene Pinzette Mikrodissektion mit der linken Hand (bei Rechtshänder) und legen Sie sie direkt unterdie utero-Eileiter-Kreuzung packte den Eileiter etwa 2 mm über dem Teil.
  19. Halten Sie die utero-Eileiter-Verbindung mit den leicht gebogenen Mikro Dissektion Pinzetten, Punktion der Eileiter Abschnitt in der Nähe der Zange mit einem 27-G-Nadel (3H).
  20. Legen Sie die Embryo-Pipette in die Öffnung mit der Nadel und in die Gebärmutter durch die Eileiter-utero-Kreuzung durchgeführt (Abb. 3I und 3J). Sobald die Pipette die utero-Eileiter-Kreuzung (3K) reichte es gleitet leicht. Sehr weit voran Sie nicht in die Gebärmutter Endometrium-Schäden (nicht mehr als 3 mm) und Pipetten Blockierung durch die Trümmer zu verhindern.
  21. Lassen Sie die Embryonen in die Gebärmutter durch sanft weht (Abbildung 3 l). Beide Luftblasen durch die Gebärmutter passieren. Einige der Medien über der ersten Blasenkann auch in den Uterus freigegeben werden, aber die Einführung von mehr Luft zu vermeiden, da es die Implantation zu verhindern.
  22. Nehmen Sie die Pipette kurz nach Embryonen in die Gebärmutter freigegeben.
  23. Bewegen Sie den Eileiter und zurück in die Bauchhöhle von Eierstock greifen die Fettpolster.
  24. Naht der Muskel mit einer horizontalen Matratzenstich mit 5/0 resorbierbares Nahtmaterial (Abbildung 3M).
  25. Nähen Sie die Haut mit einer Wunde Klipper (Abbildung 3 N).
  26. Gehen vom Schritt 10 auf der anderen Seite, falls erforderlich.
  27. Identifizieren Sie den Empfänger (Ohrring, Finger Tattoo ...), verschieben Sie sie in seinem Käfig (an einem warmen Bühne platziert) und beobachten, bis er aus der Narkose erholt sich (bewusst und pflegen Brustlage).
  28. Kommentieren die möglichen Vorfälle während Embryotransfer auftritt und fügen Antibiotikum, das Trinkwasser. Ein 0,5-1 ml subkutane Injektion von warmen saline Lösung verbessert die Wiederherstellung.
  29. Wundclips können 10 Tage nach Embryotransfer mit einer Wunde Klipper-Entferner oder zwei Pinzetten (Abbildung 3 O) entfernt werden. Der Empfänger kann an diesem Tag, um eine Schwangerschaft zu beurteilen und schätzen die Zahl der Jungtiere abgewogen werden. Geben eingebettet Material an den Empfänger 15 Tage nach Embryotransfer.

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Representative Results

Utero-Eileiter-Embryo-Transfer bietet eine mittlere Embryonen in die Gebärmutter vermeiden einige der Komplikationen an der Gebärmutterembryotransfer 2,9,10 verbunden zu übertragen. In Tabelle 1 zeigen wir einige repräsentative Ergebnis, das wir erhalten haben, die Übertragung CD1 Blastozysten, verschiedene Arten von Manipulationen CD1 Empfänger unterzogen nach dem beschriebenen Protokoll. Das Überleben zu Begriff (% der Embryonen, was zu einer Welpe) oder das Überleben bis E15 (im Fall von Lentiviren ausgesetzt) ​​ist ähnlich einfach zwischen Embryonen in vitro aus Stadium der Zygote (IVC) kultiviert, Embryonen zu iPSC Injektion unterzogen, um chimären Welpen erzeugen und Embryonen, die ihre zona entfernt hatten und zu lentivirus 7 Stunden vor dem Embryotransfer ausgesetzt. Daher ist utero-Tubenembryotransfer eine zuverlässige Technik, um Embryonen besonders kompliziert, wie diejenigen, denen Zona pellucida und mit Lentiviren inkubiert übertragen.


Fig. 1 ist. Die Injektion von Anästhetika und Analgetika. A) Die intraperitoneale Injektion von Ketamin-Xylazin. B) Die subkutane Injektion von Buprenorphin. C) Anwendung der Augensalbe.

Figur 2
2. . Vasektomie Protokoll A) Der Schnitt Punkt (mit einem roten "X" dargestellt) liegt ca. 1 cm oberhalb des Penis gelegt; Fell entfernen 0,5-2,5 cm über Penis (schwarze Linien) B) Hautschnitt C) Muskel Einschnitt... D) Samenleiter (schwarzer Pfeil) und Testist (*). E) Flaming der Zange für Verätzungen. F) Kauterisation der Samenleiter in zwei Punkte auf einmal. G) Samenleiter klar in zwei Enden verödet getrennt. H) Muskelnaht. I) Hautnaht. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Fig. 3
3. Utero-Eileiter-Embryo-Transfer-Protokoll A, B) Rücken und Seitenansicht der Einschnittstelle (mit einem roten "X" dargestellt). Schwarze Linien zwischen der letzten Rippe und Hüfte (A, B) und zwischen Rücken und Bauch (B) dienen als Leitfaden. C) Hautschnitt. E) Embryonenmanipulation Glaspipette mit 5 Blastozysten um übertragen zu werden geladen. F, G) Vertreter der Eierstöcke mit (F) oder ohne (G) Gelbkörper, angegeben mit schwarzen Pfeilen. HK) Für Repräsentationszwecke eine Simulation des utero-Eileiter-Embryo-Transfer durchgeführt wurde das Laden einer Glaspipette mit Manipulation 0,4% Trypanblau-Lösung. H) Die Punktion der Eileiter (schwarzer Pfeil) in der Nähe der Gebärmutter (*). I) Einführung des Embryos Manipulation Pipette in die Öffnung zuvor durchgeführt. J) Der Embryo Manipulation Pipette Fortschritte durch die utero-Eileiter-Kreuzung. K) Ein Volumen von Trypanblau-Lösung gelten, die in einem Embryotransfer freigegeben wurde in das Uteruslumen (schwarzer Pfeil ausgewiesen worden). L), um testen die effiziente Schließung durch die utero-Eileiter-Kreuzung hergestellt, die ganzeInhalt der Manipulation Pipette in die Gebärmutter freigesetzt; utero-Eileiter-Übergang (Pfeil) verhindert den Rückfluss der in die Gebärmutter freigesetzt Trypanblau-Lösung (*) M) Muskelnaht N) Hautnaht O) Clip Entfernung.... P) 15 Tage nach dem Embryotransfer bieten eingebettet Material an den Empfänger. Q) Chimäre Wurf nach dieser Technik erhalten. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Behandlung Anzahl der Übertragungen Embryonen übertragen Pups geliefert Survival-term (%)
IVC 11 110 82 74,5
iPSC Injektion 3 50 35 70.0
Lentiviren 6 60 44 73,3

Tabelle 1. Repräsentative Ergebnisse nach der Übertragung von drei verschiedenen Gruppen von manipulierten Embryonen nach utero-Tubenembryotransfer erhalten. 1) Embryos in vitro kultiviert (IVC) vom Stadium der Zygote bis zum Blastozystenstadium, 2) In vivo produziert Blastozysten injiziert mit 10 mouse iPSC um chimäre Mäuse zu erzeugen, 3) In vivo produziert Blastozysten, die ihre zona entfernt hatten und für 7 Stunden mit einer Lentivirus-GFP exprimieren, inkubiert. Die Daten stellen die Anzahl von Jungtieren aus der Anzahl von Embryonen mit Ausnahme des Lentivirus exponierte Gruppe, wo sie die Anzahl lebensfähiger Föten repräsentieren 10 Tage nach Embryotransfer, wie Schwangerschaft nicht erlauben, weitere Fortschritte übertragen geboren.

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Discussion

Die Vasektomie ist eine relativ einfach Operationstechnik, die keine großen Schwierigkeiten verbunden ist. Wenn Desinfektion mit Povidon-Jod und Ethanol stellen Sie sicher, dass der letzte Waschanlage (mit Ethanol) entfernt Povidoniod, da es das Bauchfell reizen. Der Zugang zu Samenleiter kann auch durch den Hodensack oder Durchführen einer transversalen Schnitt in den Bauch 8 erreicht werden. Scrotal Einschnitt wurde empfohlen, Bauchschnitt durch den vergleichsweise kleineren Schnitt benötigt und etwas bessere postoperative Verhalten 11 quer. Wir bevorzugen jedoch den Bauchschnitt über die Hoden weil es bietet eine einfachere und klarere Zugriff auf die Samenleiter von beiden Hoden, verhindert Anfänger Chirurgen aus Ausbrennen zweimal die gleichen Samenleiter und Verlassen eines Funktionssamenleiter. Zwischen den beiden Bauch Techniken favorisieren wir den Längsschnitt in der Linea alba über die TRANSVERsal, weil es nicht schneiden jede Bauchmuskelfaser, die Vermeidung der Entwicklung von Unterleibsbrüche. Allerdings können sowohl Vasektomie und utero-Eileiter-Embryo-Transfer-Protokolle zur Verfügung stehenden Ausrüstung oder den persönlichen Vorlieben des Forschers angepasst werden. Beispielsweise kann ein Glasperlen Sterilisator verwendet, die verwendet werden, um die Samenleiter ätzen Zange erwärmen. In jedem Fall ist es wichtig, eine aseptische Technik zu folgen, um die richtige Anästhesie und Analgesie, um den Tierschutz zu maximieren, und mit den lokalen Vorschriften entsprechen.

Ein weiterer Aspekt anfällig für Änderungen ist die Anästhesie-Protokoll. Wenn Inhalationsanästhesie (Isofluran) verfügbar ist, empfehlen wir die Verwendung anstelle von parenterale (injizierbare) Anästhesie, da es eine sehr stabile Anästhesie-Ebene und eine schnelle Wiederherstellung. Allerdings ist es wichtig zu sagen, dass Inhalationsanästhesie die Verwendung eines Analgetikum zur intra-und post operatory Schmerzen, die Verwal sollte bedarf nochvor der Operation als Prämedikation stered. Buprenorphin ist ein Opioid-Analgetika, die langfristig in der Maus 12 bereitzustellen. Parenteral Anästhesie bietet auch eine gute Narkose Ebene für kurze Eingriffe wie Vasektomie und Embryotransfer. Ketamin-Xylazin ist eine sehr zuverlässige Kombination für Maus-Chirurgie 13, und wir haben nie irgendwelche Narkosekomplikationen beobachtet Verwendung dieser Kombination in Verbindung mit Prämedikation mit Buprenorphin. Andere parenterale Kombinationen verwendet werden können 12, aber wir raten von der Verwendung des narkotischen Mischung Avertin (Tribromethanol), da nur eine einzige Dosis verabreichen kann und mehrere Artikel wurden diverse Komplikationen mit seiner Verwendung wie lokale Reizung, schlechte Analgesie, Darmverschluss berichtet Faser Verwachsungen in der Bauchhöhle, Nekrose subperitonealen Muskelfasern und Bauchorgane Oberfläche und sogar die Sterblichkeit 14-18.

Embryotransfer erfordert ein gutes Management der beiden Embryonen eind Empfänger. Als allgemeine Regel für Säugetierembryotransfer kann das Entwicklungsstadium der Embryonen weiter fortgeschritten als die Scheinträchtigkeit Stufe der Empfänger, aber nicht das Gegenteil sein. In anderen Worten, die Embryonen für die Mutter warten, aber die Mutter kann nicht warten, bis die Embryonen, so dass diese Technik kann verwendet werden, um Morulae oder Blastozysten zu übertragen, aber nicht früher Stadien. Zwei Tage nach der Erfassung der Vaginalpfropf von Mittag (2,5 dpc) an Abend-Nacht (3 DPC), wenn die Eileiter-utero-Übergang ist offen, um die natürlichen Transit von Embryonen aus dem Eileiter erlauben können Utero-Eileiter-Embryo-Transfer durchgeführt werden Gebärmutterhörner. In Anbetracht, dass die Embryonen übertragen werden, können bereits aus einer Art von Manipulation erlitten haben, sollten Embryo Handling weiteren Schaden zu minimieren. Eine hervorragende Anleitung für Maus-Embryo-Manipulation kann in Nagy et al. 8 Die beiden am häufigsten verwendeten Maus-Embryo-Manipulation Medien, die einen physiologischen pH-Wert regelmäßig zu haltenAtmosphäre, sind CZBH 19 und 20 M2. Obwohl in vivo produzierten Embryonen der Maus können Sie die Belichtung auf Kälte oder abnorme pH-Wert für lange Zeiträume 21 zu überwinden, sollten Manipulation Medien vorgewärmt werden. Wenn Medien in der Kulturschale vorgewärmt, zu vermeiden Erwärmung für längere Zeit (mehr als 40 min), als die Osmolarität der Medien wird durch Wasserverdampfung zu erhöhen und dass mehr schädlich als kalte Manipulation Medien sein kann. Ebenso sollte die Zeit, die Embryonen in der Manipulation Pipette verbrachte aufgrund der geringen Volumen in der Pipette vorhanden minimiert werden.

Die Verwendung eines geeigneten Embryo-Pipette ist entscheidend für den Erfolg des Protokolls. Manipulation Pipetten aus Glas Kapillaren mit einem dünnen Glaswand hergestellt werden. Pasteurpipetten, die oft verwendet werden, um große Tierembryonen behandeln, können ebenfalls verwendet werden, aber wegen ihrer geringeren Abstand vom Griff zur Spitze, sind Manipulationen Pipetten von Glaskapillaren gemacht comfortable zu manövrieren. Die Exposition gegenüber der Flamme und Ziehgeschwindigkeit bestimmen die Wanddicke und der Innendurchmesser der Pipette. Obwohl Manipulation Pipetten können leicht von Hand nach etwas Übung, Abzieher und Mikro-Schmiede kann auch verwendet werden können. Es ist wichtig, sich Zeit in der Herstellung mehrere optimale Manipulation Pipetten investieren. Die Manipulation Pipettenöffnung sollte breiter als ein Embryo sein, um einen reibungslosen Ablauf zu ermöglichen, aber klein genug, um leicht durchdringen und Fortschritte durch das utero-Eileiter-Kreuzung. Wenn Zona pellucida hat vor der Übertragung entfernt, Blastozysten Regel zu einem größeren Durchmesser zu erweitern. In diesem Fall ist es ratsam, größere Pipetten mit einer größeren Blende (130-180 um) zu machen, um Schäden an den Trophektoderm Zellen zu vermeiden. Tipp Lack ist wichtig, um eine Beschädigung der Eileiter, Gebärmutterwand und den Embryo - vor allem, wenn zona wurde entfernt, und die Pipettenspitze nicht durch Trümmer blockiert zu vermeiden. Jedoch nach dem Polieren, sollte die Öffnung not zu klein sein, verglichen mit dem Innendurchmesser der Pipette, als eine scharfe Abnahme des Durchmessers wird abrupte Änderungen in der Strömungsgeschwindigkeit führen. Die Wasserstrahlpumpe Mundstück sorgt für eine präzise Durchflussregelung sowie eine bequemere Handstellung im Vergleich zu handgeführte Geräte. Dennoch kann eine handgeführte Gerät verwendet bei Bedarf (zum Beispiel bei der Bearbeitung von Lentiviren-behandelten Embryonen) werden. Für eine optimale Strömung und die Übertragung von Mineralöl zu vermeiden, empfiehlt es sich auch um eine neue Pipette zum Embryotransfer statt dessen werden die Embryos aus dem Kulturmedium, um die Manipulation zu bewegen Medien verwenden. Schließlich, während die Einführung der Pipette durch den Eileiter, die Kapillare sollte direkt behandelt werden, dh. Greifen Sie das Glas und nicht das Kunststoffgriff der Saugvorrichtung, um einen festen Griff zu bekommen. Der Embryotransfer verwendet Vergrößerung eine persönliche Angelegenheit, die auf die Sehschärfe des Chirurgen abhängt. Wir bevorzugen es, mit geringer Vergrößerung zu verwenden, um ein breites Sichtfeld haben,so verwenden wir eine endgültige 10X Vergrößerung (10X Okular und 1X Ziel).

Die Empfänger sollten mindestens 8 Wochen alt und wiegen zwischen 27-40 g. Outbreed Mäuse wie CD1 oder Swiss Webster zeigen eine gute mütterliche Verhalten und sind ausgezeichnete Empfänger. Es ist ratsam, die Einrichtung Zucht extra Empfänger zu erhalten, wie diejenigen, die nicht genutzt wird seine normale Zyklusaktivität in zwei Wochen zu erholen. Trotz gefügt werden einige Frauen nicht Corpora lutea (Fig. 3G) und wird daher nicht empfänglich für die Embryonen übertragen werden. Aus diesem Grund sollte die Eierstöcke auf die Anwesenheit von Corpora lutea, die bei 2,5 dpc deutlich als helle rote Strukturen im Eierstock (3F) identifiziert werden, überprüft werden. Während der Operation ist es wichtig, den Kontakt mit dem Genitaltrakt von Eierstock statt erregenden Fettpolster zu minimieren; übermäßige Manipulation der Eierstöcke und der Gebärmutter in der Luteolyse zur Folge. Die Einführung des manipulation Pipette in den Eileiter der komplizierteste Schritt des Protokolls. In einigen Empfängern ist die Eileiter sehr verdreht und es ist nicht ein 2 mm gerade Strecke von der Kreuzung mit der Gebärmutter. In diesem Fall ordnen Sie die Eileiter und führen Sie die Punktion in der ersten Kurve. Wie oben beschrieben, eine schöne Manipulation Pipetten wirklich einen Unterschied macht. Sobald der Pipette durch die utero-Eileiter-Kreuzung passiert, gleitet sie leicht. Wenn dies nicht der Fall, kann die Pipette aus dem Eileiter abgewichen ist und nicht das Uteruslumen erreicht. Einmal in der Gebärmutter, wenn die Medien nicht fließt, bewegen Sie die Pipette etwas aus oder in und versuchen Sie es erneut. Wenn es immer noch nicht fließen, wird die Pipette verstopft ist, nehmen Sie es heraus aus der Gebärmutter, lassen Sie den Inhalt in die Schüssel mit Manipulation Medien und laden Sie die gleichen oder andere Pipette. Lieferung erfolgt in der Regel 17 Tage nach Embryotransfer. Um Kannibalismus zu verhindern, bieten eingebettet Material 2 Tage im Voraus und nicht den Käfig in den ersten Tagen nach der Geburt zu ändern.

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Disclosures

Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch Mittel aus der Abteilung für Tier-und Vogel Wissenschaften BT unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine VEDCO Ketaved ANADA 200-257 To be ordered by a licensed veterinarian.
Xylazine Lloyd Laboratories Anased NADA #139-236 To be ordered by a licensed veterinarian.
Buprenorphine Generic NDC 400-42-010-01 To be ordered by a licensed veterinarian.
Eye ointment Novartis Genteal
Antibiotic Pfizer Clavamox NADA #55-101. Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.
Dressing serrated forceps ROBOZ RS-8120 Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.
Microdissecting serrated forceps ROBOZ RS-5137 These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred.
Slight curved micro dissection forceps ROBOZ RS-5136 This model is particularly useful to hold the oviduct.
Scissors ROBOZ RS-5880 Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
27 G needles Beckton-Dickinson 305136 Smaller needles (30 G) can be also used. 25 G may be a bit too big.
Clip applier MiKRon 42763
9 mm Clips MiKRon 427631
Clip remover MiKRon 7637 Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.
Suture needle holder ROBOZ RS-7820
Suture Dowist Gell 5-0 Dexon S 7204-21 Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.
Glass capillaries VWR 100 ul calibrated pipettes 53432-921 It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 µm filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in Nagy et al.8
Burner KISAG AG Typ 2002 Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.
Stereomicroscope Leica MZFLIII This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot. 
Fiber optics ilumination Dolan Jenner Fiber lite To iluminate the surgical area. There are different systems available.
Warm stages American scope http://store.amscope.com/tcs-100.html These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.
Culture dishes for embryo manipulation Falcon 353001 351008 may be also used; they made narrower drops.

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References

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