깁슨 조립 및 유전자 총을 사용하여 담배 일시적인 유전자 발현

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Summary

이 작품은 선택적으로 바이오 래드 유전자 총을 사용하여 정량, 식물의 세포 내 소기관을 대상으로하기위한 새로운 방법을 설명합니다.

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Mattozzi, M. D., Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C. Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun. J. Vis. Exp. (86), e51234, doi:10.3791/51234 (2014).

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Abstract

여러 세포 내 소기관으로 단백질을 단일 타겟하기 위하여, 식물은 일반적으로 중요한 유전자를 복제하고, 차동 촉진제 및 / 또는 신호 서열을 포함한 복잡한 규제 전략을 사용하여 개별적으로 각각의 유전자 표현. 대사 엔지니어와 특정 세포 기관에 효소를 표적에 관심이 합성 생물학은 도전에 직면하고 있습니다 : 하나 이상의 세포 기관에 국한되어 단백질의 경우, 엔지니어는 동일한 유전자를 여러 번 복제해야합니다. 이 작품은이 전략에 대한 솔루션을 제공합니다 :의 mRNA의 스 플라이 싱을 활용. 이 기술은 설립 엽록체와 퍼 옥시 대상 시퀀스를 활용하고 선택적으로 접합되어 하나의 mRNA로 결합. 일부 스플 라이스 변종은 세포질에 퍼 옥시 일부, 일부, 엽록체로 전송됩니다. 여기에 시스템은 여러 세포 기관이 스 플라이 싱 타겟팅을 위해 설계되었습니다. 이 작품에서는, GFP는 EXPR이 될 것으로 예상했다합리적으로 설계된 5 '의 mRNA 태그 일련의 엽록체, 세포질 및 페 록시에 essed. 이 태그는 이종 유전자가 여러 세포 내 소기관으로 표현 될 필요가있을 때 요구 복제의 양을 줄일 수있는 가능성이있다. 구문은 전작 11에 설계되었으며, 깁슨 조립체, 제한 효소를 필요로하지 않는 결찰 독립적 클로닝 방법을 사용하여 클로닝 하였다. 얻어진 플라스미드는 변형 된 유전자 총 프로토콜 benthamiana 표피 된 담배 잎 세포에 도입 하였다. 마지막으로, 형질 전환 된 잎은 공 초점 현미경으로 관찰 하였다.

Introduction

이 작품은 식물 세포가 여러 세포 기관에서 리포터 단백질을 발현하도록 설계하지만, 단 하나의 DNA 구조를 가진 것을 특징으로 대사 공학 / 합성 생물학 프로젝트입니다.

둘 이상의 위치로 단백질을 표적으로하는 하나의 접근법은 여러 복제 유전자 사본 다른 지역화 펩티드를 포함하는 각을 포함한다. 각 복사본은 하나의 변환 1을 역 교배에 의해, 또는 연속 재 변환에 의해 도입, 또는해야합니다. 이 추가 복제를 포함하고, 말단 당 하나의 지역화 태그에 의해 제한됩니다.

여러 위치에 단백질을 집중하는 또 다른 방법은 다른 접합 2-5을 통해서이다. RNA는 단일 유전자로부터 전사되지만, 전 사체의 다른 복사본은 셀 당 하나 이상의 방법으로 종종 다르게 처리된다. 이것은 단일 유전자로부터 전사 셀에 둘 이상의 메신저 RNA가 발생할 수있다. 이러한 다양한 MESSENGER RNA를 동일한 단백질의 상이한 이소 형을 위해 인코딩 또는 틀 이동, 모두 다른 단백질의 경우에 할 수있다. 대안적인 스 플라이 싱은 수년 동안 문헌에 기술되어 있지만, 작업 및 보존 공여체 및 수용체 스플 라이스 위치의기구는 더 최근 6 해명되고있다. 이 사이트는 더 나은 기술되고있다, 그들은 엔지니어링에 대한 기회를 엽니 다.

여러 소기관의 단백질을 발현 할 때 식물 대사 엔지니어는 도전에 직면하고 있습니다. 하나 이상의 세포 기관에 국한되어 단백질의 경우, 엔지니어는 관심의 세포 기관에 지시 별도의 신호 순서와 동일한 유전자 각을 여러 번 복제해야합니다. 세 소기관에 단일 유전자의 경우, 이는 단순히 세 유전자이다. 그러나 여섯 유전자 대사 경로에 대해,이 18의 유전자 복제 상당한 노력을 확장합니다. 하나의 대안 - 접합 유전자 기호에 여러 현지화 시퀀스를 결합ificantly이 노력을 줄일 수 있습니다. 예를 들어, 리엔지니어링 광호흡 7,8 및 이소 프레 노이드 합성 9,10는 엽록체와 퍼 옥시 솜을 모두 포함한다. 자연 애기 장대 시스템에서 관찰로 우리의 경우에 우리는 이전 6 설명 스플 라이스 사이트를 이용했다. 우리는 이성적으로 만 자연 스플 라이스 사이트를 떠나 mRNA의 순서를 재 설계하지만, 대안 - 접합 인트론 (그림 1)에서 엽록체 또는 퍼 옥시 타겟팅 태그를 인코딩 할 순서를 배치. 발현 된 단백질 또는 인코딩 사전의 mRNA는 인트론 (그림 1g1H)로 적출 여부에 따라 태그가있을 수도 있고 없을 수도 있습니다. 이 연구에서 제시 한 구조의 설계에 대한 자세한 내용은 관련 기사 11를 참조하십시오.

이것은 여전히​​ 상당한 클로닝 노력 깁슨 조립체, DNA 구조를 클로닝하기위한 새로운 방법이므로, U는건설에 나오지. 깁슨 방법에 관계없이 제한 부위 (그림 2) 12 ~ 14의 모든 순서에 사용될 수있다. 효소의 특정 혼합 한 단계 등온 조립을 허용한다. 이 방법에서는, 몇개의 이중 가닥 선형 DNA의 부품들은 50 ~ BP의 겹치는 서열을 갖도록 설계된다. 깁슨 조립체 효소 믹스는 부분적 상동 서열의 단일 가닥을 노광, 선형 DNA의 부분 소화. 이러한 부분적인 단일 가닥 서열은 신속한 원스텝, 순서에 관계없이, 결찰 미사용 서브 클로닝 반응의 결과, 반응 혼합물에 재 어닐링된다.

이 작품은 식물의 엽록체, 퍼 옥시 솜 및 cytosols의 표현을위한 1) 합리적인 설계 대안 접합 구조를 설명, 2) 자신의 복제 깁슨 어셈블리의 새로운 결찰없는 방법을 사용, 3) 유전자 총을 가진 담배 잎의 세포에 자신의 배달하고, GFP 관찰로, 세포 기관 타겟팅을 보여주는 4) 결과및 공 초점 현미경.

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Protocol

대상으로 여러 세포 기관에 대한 대안 - 접합 시퀀스의 1. 디자인

  1. 최종 단백질 발현을위한 사이트를 확인합니다. 이 작품의 경우, 관심이 엽록체, 퍼 옥시 및 세포질을 대상으로합니다.
  2. 관심의 세포 기관에 단백질을 표적으로하는 것으로 알려진 단백질과 DNA 시퀀스를 식별하기 위해 문학을 사용합니다. 이 경우 엽록체는 애기 장대의 L-isoaspartate의 methyltransferase 6,15에서 순서를 대상으로하고, 애기 장대 트랜스 티 레틴 같은 S-알란토인 합성 효소 (16, 17)에게로부터 순서를 대상으로하는 페 록시가 결정되었다.
  3. 정확한 세포 기관의 관심 단백질을 대상으로해야 대안 - 스 플라이 싱 정권을 확인합니다. 자연 애기 시스템 6 관찰이 작품의 경우, 사이트를 접합. mRNA의 서열은 천연 스플 라이스 사이트를 떠나기 재 설계되었지만, 시퀀스는 인코딩 엽록체 또는 peroxis을 넣었다대안 - 접합 인트론 내 태그 (그림 1) 오메 타겟팅.

DNA 파트 2. 깁슨 조립

그림 2를 참조하십시오.

깁슨 조립체 법) (1)에 미리 만들어진 혼합 여러 효소의 작용에 따라 부분적으로 단일 가닥 및 DNA 부분을 인접한 2) 어닐링 무료 염기쌍을 만들기 위하여 이중 가닥 DNA의 끝을 소화. 이는 제한 부위의 제한없이 DNA 단편의 클로닝을 허용한다.

  1. DNA 플라스미드 구조의 요소에 대한 주문을 선택합니다. ) 플라스미드 식물, 카나마이신 저항성 마커에서 작동하는 것으로 알려진 GFP 구조를 포함하는 벡터 (기공, 대장균아그로 박테 리움이 호스트를 투메 파시 엔스), B)에 대한 복제의 기원 : 예를 들어 TriTag-1의 요소가 프로모터 서열, (P ENTCUP2, 식물의 구성적인 것으로 표시), c) 시퀀스 (CTS)를 대상으로 엽록체, c) 페 록시) 이전 6 바와 같이 스플 라이스 위치의 일련의 시퀀스 (PTS), 및 D 타겟팅.
  2. 구조의 기초를 위해베이스 실리 디자인 소프트웨어를 디자인합니다. 원숭이는이 작업에 유용한 오픈 소스 프리웨어 패키지입니다.
    참고 : TriTag-1, 순서가 : 플라스미드 벡터, 프로모터, ATG, 스플 라이스 기증자 사이트, 엽록체 표적 서열, 스플 라이스 기증자 사이트, 중립 사이트, 스플 라이스 수용체 사이트, 퍼 옥시 대상 시퀀스 결합 수용체 사이트, GFP 플라스미드 벡터에 포함 된 .
    1. PCR 프라이머를 주문하면 각 조각 사이에 50 bp의 중첩이되도록에 실리 DNA의 구조를 설계합니다. 25 bp의 각 방향 :이 프라이머로서 50 bp의 중첩을 사용하는 것이 가능하다.
      1. 시퀀스의 각 조각의 기원을 추적해야합니다. 그것은과 같습니다 : 성장과 miniprepped하는 플라스미드; PCR의 주형으로서 사용할 수있는 선형 서열; 또는해야합니다 순서상업적으로 합성? 몇몇 회사는 단편 <500 BP에 대한 저가의 DNA 합성 서비스를 제공합니다. 상업적으로 주문하는 것이 유익이 경우에, TriTag 자체는 437 BP입니다.
      2. 모든 조각이 PCR 증폭과 자신의 템플릿 DNA에서 정제하는 경우 가장 좋은 결과가 올 것이다. 저항 마커보다 쉽게​​ PCR 증폭 두 개의 작은 템플릿으로이 큰 DNA를 나눌 수있는 좋은 장소입니다.
      3. 제한 제한 효소 DpnI는 메틸화 된 DNA를 잘라냅니다. PCR 템플릿은 E.에서 미니 프렙 인 경우 대장균, DpnI 처리는 오염 템플릿 DNA를 제거합니다.
  3. 별도로 모든 DNA 서열을 정화하고 물, TE 또는 버퍼 EB에 용출.
    1. 기공 벡터 1 부 ~ 3,000 BP (녹색 화살표). PCR 증폭과 DpnI 치료.
    2. 기공 벡터 부분 2 ~ 3,000 BP (검은 색 화살표). PCR 증폭과 DpnI 치료.
    3. TriTag 삽입, 437 BP (파란색 화살표). 상업적으로 주문했다. Resuspend DDH 2 O.에서
    4. P의 ENTCUP 프로모터 ~ 750 BP (주황색 화살표). PCR 증폭과 DpnI 치료.
  4. DNA 조각의 각각의 농도를 측정한다. 벡터 조각 150 NG / μL을 목표로.
  5. 냉장고에서 깁슨 어셈블리 믹스의 나누어지는를 타고 얼음 해동. 이 실험실 12-14에서 만들 상용, 또한 간단합니다.
    1. 점성 배 마스터 믹스 15 μl의 반응 크기의 1.33 배 분량 씩이 조리법에 두 단계가 있습니다. 배의 마스터 믹스는 포함한다 : 3 ㎖ 1 M 트리스 - 염산의 pH 7.5, 300 ㎕의 1 M MgCl2를 각각의 dNTP 600 μL 10 밀리미터, 300 ㎕의 1 M DTT, 1.5 g PEG-8000, 20 밀리그램 NAD 및 DDH 2 6 ML에 O. 320 ㎕의 분취 량 (18)를 준비하고 -20 ° C.에 하나를 제외하고 모두 동결 이 솔루션은 매우 점성이 될 것입니다. 이러한 "배 등온선 버퍼를"레이블
    2. (320 μL)를, 나머지 하나에, 1.2 ㎕의 T5 엑소 뉴 클레아 제, 20 μL Phusion 높은-FID를 추가elity DNA 중합 효소, 160 μL의 Taq DNA 리가 제 700 μL의 DDH 2 O. 15 μL 씩 분주 (~ 80) -20 PCR 튜브 및 저장소에있는 얼음에 °를 준비 C.
  6. 각 조각의 몰량에 대한 볼륨을 결정합니다. Gibthon.org을 포함하여 몇 가지 온라인 계산기가 있습니다. 모든 DNA 조각의 5 μL의 총이 있어야합니다. 깁슨이 나누어지는 혼합 15 μL에 추가합니다. 이 피펫에 너무 작은 볼륨을 필요로하는 경우, DNA 조각을 희석 및 / 또는 하나 이상의 나누어지는을 사용합니다.
    1. 혼자 벡터 DNA의 제어를 준비 (항생제 내성 마커를 포함하는 예를 들어 DNA 부분)와 물을 사용하여 볼륨을 구성하는 것을 잊지 마십시오.
  7. 30~60분에 대한 50 ~ 55 ° C에서 열 자전거 타는 사람에 튜브를 품어. 얼음에 교체 한 E.로 변환 열 충격을 화학적으로 유능한 세포를 통해 대장균. electrocompetent 세포를 사용하지 마십시오. 높은 염 농도와 비교적 낮은 DNA 농도세포가 아크의 원인이 될 수 있습니다.
    1. 200 ㎕의 칼슘 염화물의 상업 준비 관할 E.보기에 20 μl를 적용 대장균.
      42 ° C에서 30 분 얼음과 열 충격 60 초에 품다
    2. 얼음 2 분으로 돌아 750 μL의 SOC 또는 LB 매체를 적용하고 37 ℃에서 microcentrifuge 관 30 분에 흔들리는 복구 LB + 칸 (또는 다른 적절한 항생제)의 혼합물과 적절한 희석 플레이트. 이것은 기존의 결찰 기반 복제보다 더 높은 배경 (및 비 표적 재조합 이벤트의 높은 숫자)이 발생할 수 있지만 약 10 식민지를 화면에 가치가있다.
  8. 순서를 통해 클론을 확인하고, -80 ° C에서 나누어지는 저장

유전자 총과 담배 3. Biolistic 형질

이 조브 18, 19 년에 설립 된 기술이다. 주요 단계와의 차이는 아래에 설명되어 있습니다.

  1. 50 ~ 100 ㎖의 E.을 성장 공동리 또는 200 ㎖의 아그로 박테 리움. 맥시 예비 학교 문화를. 약 1,500 NG /의 농도는 ㎕를 계속해야합니다.
  2. 전술 한 바와 같이 유전자 총 글 머리 기호를 준비합니다. 유전자 총에로드.
  3. 는 담배 benthamiana 담배 잎의 표피 조직의 형질를 들어, 3 개월 이전 공장의 기본에 가까운 큰 잎을 선택합니다. 조심스럽게 잘라 15cm 페트리 접시에 젖은 종이 타월에 바닥면을 위로 놓습니다.
  4. 200 ~ 250 PSI에 유전자 총을 그는 압력을 설정합니다.
  5. 조심스럽게 약 3-5센티미터 그 위에, 잎의 아래쪽에 갈비뼈 사이의 유전자 총을 목표로하고 있습니다. 안전을 해제하고 잎에 입자를 제공합니다. 각 탄환은 잎에 동일한 위치에 두 번 사용될 수있다. 잎 폭발은 버리고 시작하면 새 잎이 잎의 인성에 어떤 변화로 인해 같은 12 cm 잎의 경우, 약 6 탄에 맞게 기대 등 나이, 습기 등의 성장 조건이다.
  6. 의 상단으로 덮여 잎을 저장,벤치에 낮은 조명에서 2 ~ 3 일 배양 접시.
  7. UV 형광 장착 된 해부 현미경 잎을 검사하고 GFP를 표현하는 각각의 세포를 검색합니다. 잎 5 ~ 10 밀리미터 섹션을 해부하다.
  8. ~ 200 ㎕의 0.1 % 트리톤 X-100에서 깊은 우물 현미경 슬라이드에 잎을 담근다. 세제는 표면에 형성되는 기포를 방지하고, 깊은 웰 현미경 슬라이드는 큰 조직 이미징 영역을 허용한다.

트랜 조직 4. 공 초점 현미경

이 지침은 모든 기기에 따라 다를 수 있으므로 제대로 훈련을 얻을하는 것이 필수적입니다.

  1. 형광 검출 실험을 위해, 489 nm의 여기 레이저를 설정하고, GFP의 형광 및 엽록소 자동 형광을위한 630-700 nm의에 대한 500-569 nm의 광전자 증 배관 탐지기를 설정합니다. 40X 물 침지 목표를 사용하여 이미지 세포.

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Representative Results

디자인 노력은 중요한 계획의 결과였다. 이 프로젝트에 대한 소설은 발현 된 단백질로 번역되는 사전의 mRNA를 만들 수있는 스 플라이 싱의 사용이다. 이들 단백질은,이 경우, 다른 세포 기관에서 발현되는 엽록체, 페 록시 및 / 또는 시토 졸. 우리는 선택적으로 6 접합되어 자연 애기 장대의 유전자를 적응하고, (TriTag-1과 TriTag-2) 대체 엑손의 시퀀스를 대상으로 엽록체 6 페 록시 17 알려진 배치했다. TriTag-3 엽록체 시퀀스의 복잡도가 낮은 영역 내에 포함 된 페 록시 신호로 구성된다. 이들은 GFP (그림 1) 프레임에 배치했다.

시퀀스 GFP를 표적 PIMT2 유전자 06 엽록체 및 페 록시로부터 네이티브 대안 접합 섭생 및 플라스미드 백본 : 본 연구에 사용 된 플라스미드 따라서 몇 가지 요소를 포함 하였다. 각각은 매우 사양이 있기 때문에IFIC이 순서를 요구, 일련의 독립적 인 방법이 필요합니다. 깁슨 조립체 프로토콜 12,13 너무 오래 구성 부분이 서로 서열 유사성으로 설계된대로 임의 서열에 사용할 수 있고, 반복 서열을 포함하지 않는다. 요약하면, 선형 DNA 단편 (중 PCR 증폭, 상업 합성, 또는 미리 만들어진 플라스미드의 소화를 통해) 구성되어 그들이 중복 상동 서열 ~ 50 BP (그림 2)을 갖도록. DNA 단편의 각각의 등몰 수량을 1 시간 동안 50 ° C에서 배양 깁슨 조립체 믹스를 함유 한 튜브에 결합하고, E.로 변환된다 대장균. 깁슨 어셈블리 프로토콜로 인한 플라스미드 생어 시퀀싱에 의해 확인되었다.

본 연구에서는 세 가지 GFP 소기관 타겟팅 구조는 태그가 GFP와 Rubisco - 태그 GFP를 비교 하​​였다. 공 초점 현미경은 SI에서 GFP 형광을 검출하기 위해 사용되었다ngle 세포가 일시적으로 바꾸었다. 제어 실험에서 관찰되는 일시적인 식 (엽록소의 붉은 형광도에 의해 쉽게 식별) 엽록체, 핵 (엽록체없는 세포 당 하나가 큰 세포 소기관) 상관 관계, 및 / 또는 작은 세포 기관이 될 것으로 추정 퍼 옥시 솜. 녹색 (GFP)과 빨간색 (엽록소 형광도) 채널은 세포 내 현지화 (그림 3) 공부를 중첩되었다. 이러한 결과에 대한 자세한 설명은, 우리의 동반자 제 11 조를 참조하십시오.

예측으로, 세 가지 듀얼 대상으로 구조에, GFP는 오버레이 공 초점 현미경의 엽록체에서 (그림 4)이 관찰되었다. TriTag-1과 TriTag-2 대상 세포질과 퍼 옥시 좀 (그림 4a 및도 4b, 각각)로 여겨지고 작은 세포 기관에 또한 GFP. 만 엽록체와 페 록시,하지만에 TriTag-3 대상 GFP세포질 (그림 4C). 결과의 요약은 (그림 5) 다이어그램으로한다.

그림 1
는 담배 benthamiana에서 차동 소기관 식에 대한 대안 접합 구조의 그림 1. 디자인. () TriTag-1의 다이어그램을 스플 라이스, (B) TriTag-2, 그리고 (c) TriTag-3 비 대상 시퀀스를 보여 (회색), 엽록체 대상 시퀀스 (밝은 녹색), 퍼 옥시 대상 시퀀스 (오렌지), 그리고 일시적 발현 실험에 사용 된 GFP 코딩 서열. TriTag-1과 TriTag-2는 다른 접합 구조로 구성; TriTag-3 엽록체 시퀀스의 복잡도가 낮은 영역 내에 포함 된 페 록시 신호로 구성된다. 의 시퀀스 (e) TriTag-2, 및 (f) TriTag -3. 이러한 시퀀스의 끝에 ATG 코돈은 개시 코돈 GFP에 대응한다. 또는 접합 대상 지역은 밑줄로 표시됩니다. 기증자와 수용체 이합체는 밑줄로 표시됩니다. 밝은 녹색 DNA 서열은 지역 6 코딩 PIMT2 5 '에서 파생 엽록체 타겟팅 순서 (녹색) 암호화 서열이 (가) 있습니다. 라이트 오렌지 DNA 서열은 영역 (17)을 코딩 TTL 5 '에서 파생 퍼 옥시 대상 시퀀스 (오렌지)를 코딩하는 서열을 포함한다. TriTag-3 엽록체 시퀀스의 복잡도가 낮은 영역 내에 포함 된 페 록시 신호로 구성된다. (G) TriTag-1 (H) TriTag-2 표현 될 것으로 최종의 mRNA의 회로도. 허가 (11) 재판. 큰 IMA를 보려면 여기를 클릭하십시오GE.

그림 2
그림 2 깁슨 어셈블리 설계도 :.. DNA 조각을 중복의 조립을위한 새로운 방법 플라스미드 건설 (12, 13)에 대한 깁슨의 조립 방법은 신속하게 많은 실험실에서 기존의 제한 결찰 복제를 대체하고있다. 기본적으로, 하나는 다양한 소스에서 증폭 된 PCR 제품의 구성을 정확하게 관심의 DNA를 포함 실리코의 구조를 디자인 할 수 있습니다. 서로를 무료로 이용하실 수 있습니다 프라이머를 디자인하고, 컬러 프라이머 각 조각을 PCR-증폭. 효소 믹스 하나의 튜브에 모든 조각을 추가하고 E.에게 변환 대장균 유능한 세포. 패를 보려면 여기를 클릭하십시오arger 이미지.

그림 3
그림 3. 제어 처리는 N.에 포격 benthamiana 잎의 표피 세포. (AC) 태그없는 GFP. () 녹색 채널. 태그없는 GFP는 세포질에 대응하는, 핵 및 세포 둘레 표현되지만하지 액포. (b) 적색 엽록체 엽록소의 형광도를 나타낸다. (c) 오버레이. 이 구조의 형광 핵 단지 세포질에서 관찰 아니라 엽록체. (DF) 엽록체 태그 GFP 제어 할 수 있습니다. (D) 녹색 채널입니다. GFP는 설명 된대로 세포를 가진 큰 세포 소기관으로 표현된다. (E) 레드 엽록체는 크롤의 형광도를 나타냅니다ophyll. (F) 오버레이. 이 경우 노란색 엽록체는 GFP (녹색) 엽록체를 대상으로 나타내는, 관찰된다. 허가 (11) 재판. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
도 4. 트라이 태그 1, 2, 3 태그 GFP 이미지를 합병. (a) 트라이 TAG1. 이 경우 노란색 엽록체 주위는 GFP가 엽록체에 대상을 나타내는, 관찰된다. GFP는 또한 세포질뿐만 아니라 퍼 옥시 솜 수 있습니다 작은 점 모양의 세포 기관에서 관찰된다. (b)의 세 배 TAG2. 이 경우 노란색 엽록체 주위는 GFP가 C로 대상을 나타내는, 관찰 hloroplast. GFP는 또한 세포질뿐만 아니라 퍼 옥시 솜 수 있습니다 작은 점 모양의 세포 기관에서 관찰된다. (C) 트라이 Tag3. 이 경우 노란색 엽록체는 물론 페 록시 수 있습니다 작은 점 모양의 세포 기관으로, 관찰된다. 그러나 GFP가 세포질에서 관찰되지 않습니다. 허가 (11) 재판. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
도 5. 일반적인 담배 잎 표피 세포의 격실. 이곳에서 자신의 상대적인 크기 및 셀 내의 위치를 도시하고, 상대적 발현 수준은 공 초점 현미경을 통해 관찰된다. 허가 (11) 재판./ 51234/51234fig5highres.jpg "대상 ="_blank "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

본 연구에서는 단순한 전략은 식물의 여러 세포 구획에 단일 유전자 변형 단백질을 지역화에 대해 설명합니다. 목표는 담배 benthamiana에 하나 이상의 소기관으로 단일 유전자를 발현 할 구조물을 설계하는 것이었다. 전략은 합리적 GFP 기반의 DNA 구조의 설계, 깁슨 조립, 유전자 총을 가진 잎의 세포에 플라스미드의 전달 및 공 초점 현미경과 결과의 관찰이 (가) 있습니다.

세 가지 짧은, N-말단 태그 (11)를 대상으로 동시 엽록체, 퍼 옥시과 세포질을 위해 설계되었습니다. 이러한 "TriTags"는 엽록체 플러스 세포질 6 퍼 옥시 플러스 세포질 (17) 중 하나에 인코딩 된 단백질을 직접 선택적으로 접합의 mRNA를 인코딩하는 자연 발생의 DNA를 결합하여 설계되었다. TriTag-3 플라이 싱에 의존하고있는 NA 엽록체 대상 시퀀스로 구성하지 않는turally 구조화되지 않은 부분은 퍼 옥시 타겟팅 순서 15, 17로 대체되었습니다. 는 담배 benthamiana 잎의 표피 세포에서 GFP (그림 5)를 대상으로 생체 내에서 TriTags 기능.

공 초점 현미경을 효과적으로 엽록체, 퍼 옥시 및 세포질에 해당 TriTag-1과 TriTag-2 대상 GFP를 보였다, 그러나 각각 엽록체와 퍼 옥시, 선호와 (그림 4a 및도 4b). TriTag -3 타겟은 엽록체 및 페 록시에만 GFP 아니라 세포질 (도 4c). 모두,이 태그는 시간을 줄일 수 있으며, 자원, 특히 엽록체와 퍼 옥시 솜의 특정 표현을 필요로하는 사람들을 위해, 식물 대사 공학에 대한 복제에 보냈다.

수정 및 문제 해결

로 현재 건설 TriTags은 매우 정적입니다. 그러나 underlyin다른 위치에 특정 태그의 번역을 허용하는 G 기술, 스 플라이 싱은 유연합니다. 기존의 엽록체 및 / 또는 퍼 옥시 특정 태그가 분비 통로, 미토콘드리아, ER 거주 태그, 공포 될, 다른 세포 기관을 위해 변경 될 수 있습니다. 이들은 또한 등 씨앗, 꽃, 뿌리, 잎, 줄기, 예 : 조직 특이 적 프로모터와 결합 될 수있다

등이 하나의 구조를 복제에 대한 깁슨의 조립 방법 12-14로 프로젝트에 이상적입니다. 그것은 제한 부위의 제한없이 시퀀스를 서브 클로닝하는 간단하고 강력한 도구이다. 한 단계의 반응에서, 깁슨 어셈블리는 빠르게 복제에 최소한의 노력으로 구조 및 컨트롤을 만들었습니다. 깁슨 조립 기술은 너무 오래 템플릿 시퀀스를 PCR 증폭 될 수있는 임의의 시퀀스에 대한 거의 무한대로 변경 가능합니다. 이 예에서 깁슨 어셈블리는 소화 플라스미드로 표시되었지만, PCR 증폭 벡터는 소화 미니 프렙을 사용하는 것보다 더 잘 작동하는 경향이있다.

이 저널 (18, 19)에 의해 설립 된 바와 같이 유전자 군은 세포의 일시적인 형질에 대한 신속하고 효과적인 방법입니다.는 담배 benthamiana 큰 lobate 잎 표피 유전자 총을 가진 형질 모두에 이상적입니다 세포,뿐만 아니라 위해가 공 초점 현미경으로 관찰. 글 머리 기호를 만들기위한 프로토콜은 잘 확립되어있다. 금은 지금까지 문헌에있는 대부분의 실험에서 미세 전달체로 사용되었지만, 텅스텐 미세 전달체는 저렴한 비용으로 최근에 사용할 수 있습니다.

기술의 한계

깁슨 방법의 중요한 한계는 반복 서열의 존재이다 : 이상 중복 영역이 적은 부 생성물의 결과이다. DpnI와 PCR 제품의 소화 플라스미드 템플릿을 오염 제거해야합니다; 보통 측의 소스되는제품. 효소는 단일 가닥으로 이중 가닥 DNA로부터 DNA 단편을 소화. DNA 단편의 단부 (1 ~ KB) 부근의 반복 서열의 존재는 상당히 부적절 재조합의 가능성을 증가시킨다. 뿐만 아니라, 시퀀스 내에서 반복은 제한 포즈 : 그것은 잘 알려져 있으며, T5의 엑소 뉴 클레아 제 씹이 단일 가닥 DNA를 백업하는 방법까지 통제하기 어려운 일이 아니다. 엑소 뉴 클레아 제의 신속한 활성은 높은 반응 온도 결국 효소를 변성 (50-55 ℃)하고, 용액 전체의 움직임을 감소 점도에 의해 강화된다. 반응 단계, 순서 및 결찰 독립적 인 복제 (SLIC)을 더 미세 조정을 위해 (20)가 바람직하다.

유전자 총 기술의 주요 한계는 단지 촬영 이벤트 당 1-10 일시적 형질 전환 세포의 주문에 생기는 것이다.

기존의 방법에 대한 중요성

깁슨 조립 기술은 편의성, 유연성, 적응성에 대한 신속한 채택을 즐기고있다. 그것은 기존의 제한 / 결찰 복제보다 더 빠른 프로토콜이며, 이러한 제한 소화에 필요한 것과 같은 특정 시퀀스를 필요로하지 않습니다. 그것은 재결합 할 두세 단편에 한정되지 않는다; 원래 연구진은 제한 효율 불구하고, 최대 10 개의 부품을 성공적으로 증명하고있다. 많은 연구자 깁슨 조립체는 포지티브 클론의 큰 수있게.

Biolistic 기술과 더 많은 형질 전환 또는 형질 전환 캘러스 조직의 생성을 위해, 캐비닛 스타일 biolistic 장치 (예를 들면 바이오 래드 PDS-1000)의 사용은 사용되어야한다. 다른 방법은 아그로 박테 리움의 침투이다.

미래의 응용 프로그램

깁슨 어셈블리에, DNA의 크고 큰 클러스터를 조립 할 수 있습니다최대 한도가 관찰되지 않은 점. 원래 저자는 DNA 13 수백 킬로베이스를 조립하는 데 사용했다.

선택적으로 단일 유전 구조체 여러 세포 기관을 표적으로 할 수있는 능력은 변형 될 필요 유전자의 수를 감소시킬 가능성이있다. 크고 큰 DNA 단편 (따라서 더 큰 대사 경로)의 배송은 단기 목표입니다. 이소 프레 노이드 경로는 biolistic 방법으로 엽록체에 전달되었습니다; 같은 다른 탄소 고정 경로와 같은 다른 유전자 클러스터는 수평선에 있습니다.

프로토콜 내에서 중요한 단계.

깁슨 어셈블리에서 템플릿 시퀀스가​​ 대상 재조합 사이트를 제외하고 서로 동성을 가지고 있지 않음을 기억하시기 바랍니다.

된 담배 식물의 biolistic 변환에서, 10 ~ 15 센티미터 잎 위의 유전자 총을 유지하기 위해주의ND 200 ~ 250 psi에서 헬륨의 압력을 유지한다. 보다 가까이, 깨지기 쉬운 잎 폭발, 멀리가 잘 변형되지 않도록보다됩니다. 제대로 변환되는 경우 형질 감염 후 2 일째에 멍이 잎에 나타납니다.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

저자는 담배 benthamiana 모종의 관대 한 기부에 대한 매사 추세 츠 종합 병원의 젠 쉰에게 감사의 말씀을 전합니다. 젠 부시 대통령은 식물 성장 및 성장 챔버 영역을 설정하는 조언에 크게 도움을주었습니다. Wyss 다음 연구소의 톰 Ferrante의 공 초점 현미경에 중요한 도움을 제공했다. 저자는 특히 보스턴 아동 병원의 돈 Ingber과 유전자 총과 관련된 공급의 관대 한 기부에 대한 Wyss 다음에 연구원에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 프로젝트에 대한 자금 조달은 PAS, JCW 및 MDM에 대한 에너지 고급 연구 프로젝트 기관의 부 (ARPA-E 상 # DE-000079)와 협력 계약을 통해 제공되며, Chimerion 생명 공학, 주식 회사를 통해 MJV에 대한했습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Oligonucleotide primers IDT (custom) Design specifically for construct
GeneBlocks IDT (custom) 500 bp oligonucleotides
ApE software U Utah (download) http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
MinElute kit Qiagen 28004 Used to purify PCR products
QIAprep spin miniprep kit Qiagen 27104 Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid
Phusion Master Mix with GC Buffer NEB M0532S Used to PCR-amplify gene of interest
Gibson assembly reaction mix NEB E2611L Master mix of the following 9 ingredients
1 M Tris-HCl pH7.5 Teknova T1075 Gibson assembly mix
1 M MgCl2 G Biosiences 82023-086 Gibson assembly mix
dNTP mix Fermentas R0192 Gibson assembly mix
1 M DTT Fermentas R0861 Gibson assembly mix
PEG-8000 Affymetrix 19966 Gibson assembly mix
NAD Applichem A1124,0005 Gibson assembly mix
T5 exonuclease Epicentre T5E4111K Gibson assembly mix
Phusion polymerase NEB F530S Gibson assembly mix
Taq DNA ligase NEB M0208L Gibson assembly mix
Gibthon.org Website to simplify calculations
Plasmid PLUS Maxi kit Qiagen 12963 Used to prepare DNA for gene gun bullets
Gene Gun system BioRad 165-2451 Includes all parts necessary
Nicotania benthamiana (n/a) (n/a) Gift of Jen Sheen, MGH
Confocal microscope Leica SP5 X MP Imaging of resultant cells
Deep well slides Electron Microscopy Sciences 71561-01 Used for confocal imaging
A Plasmid Editor (ApE) University of Utah http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape
Gibthon:Ligation calculator http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/

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References

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